1N0K конденсатор: 1n0k конденсатор

Содержание

Транзистор тестер в порядочном корпусе.

Добрый день (опционально вечер/ночь).

В общем решил разжиться я подобным устройством. Но для меня по мимо функционала важен еще и внешний вид, люблю законченные устройства со своими корпусами. Поэтому выбора пал на сей аппарат. Будет разборка и немножко измерений.

Введение


В общем данная модификация тестера не попадалась мне на этом сайте, поэтому не грех и глянуть, что там и как.

Для особо нервных людей и людей с завышенными ожиданиями, не стоит данный аппарат рассматривать в качестве прибора, никогда.

По причине того, что поверку на данный аппарат не сделать, он имеет погрешность (хотя я каждую деталь замерял по три раза и погрешность на самом деле не значительная, но она есть).

Что можно сделать при помощи этого аппарата?
Да просто банально отсеять плохие детали от хороших, например, пока я писал этот обзор я достаточно много выбросил советских, старых транзисторов, к которым даже рука никогда не прикасалась после смерти отца, также можно проверить качество конденсаторов, например, я заметил, что БУ конденсаторы из блоков питания самсунгов лучше новых, купленных в магазине, я догадывался об этом, но не думал, что все действительно так плохо будет.

Этот аппарат не идеален в своих измерениях, и некоторые детали он не понимает, такие как варисторы, например, мелкие сборки LM1117 и тп.

Но давайте обо всем по порядку.

Как обычно, предупреждение:

Вся ответственность, а именно самостоятельное проникновение в корпус готового изделия с последующим нарушением его целостности работоспособности, лежит на человеке совершившим это действие.

Внешний вид


Характеристики:

• Дисплей: 128 х 160
• Ток отключения: 20нА
• Диапазон тестируемого резистора: 0,5 Ом — 50M Ом
• Диапазон тестируемой индуктивности: 0,01 мГн — 20 Гн
• Диапазон тестируемого конденсатора: 25 пФ — 100000 мкФ
• Цвет: черный
• Размеры изделия: 135 x 70 x 25 мм
• Вес изделия: 99 г

Внешний вид достаточно неплох, по размерам напоминает маленький мультиметр:

В комплекте идет ZIF разъем для подключения разнообразных деталей с объемными выводами:

Разъем держится не очень хорошо, приходиться работать двумя руками, одной держать разъем, другой зажимать деталь.

Тестер питается от кроны. На лицевой стороне имеет всего две кнопки.

Время измерения примерно пол минуты, может чуть больше если конденсатор рассчитан на большую емкость.

Я не очень понимаю страсть китайцев ко всяким логотипам, картинкам и тд в технике. Тут нас встречает лого из трансформеров:

Да, светодиод конечно же — синий. Вообще мне кажется у китайцев либо проблемы с восприятием синего, либо наоборот они видят его иначе. Чертов синий светодиод лупит по глазам, в срочном порядке будет меняться на зеленый — красный.

Так как кроны у меня нет, я буду использовать вот такое приспособление, примитивный повышатель до 9В:

Поэтому я не смогу сказать насколько сильно данный прибор жрет батарею, все-равно данный аппарат будет подвергаться переделке на литий, не люблю я кроны использовать.

Так же при каждом включении аппарат показывает версию ПО:

Думается мне, в сети гуляет достаточно много разных прошивок этих аппаратов.

Тестирование


Совсем немного пробегусь по тестированию.

Конденсаторы


1. БУ электролитический конденсатор Sanwha 400V 68 uF:

2. БУ электролитический конденсатор Teapo 200V 560 uF:

3. Новый электролитический конденсатор Yageo 35V 1000 uF:

4. БУ электролитический конденсатор Sanwha 6.3V 2200 uF:

5. Новый электролитический конденсатор Yageo 25V 1000 uF:

6. Новый электролитический конденсатор CapXon 10V 1000 uF:


7. БУ электролитический конденсатор CapXon 25V 470 uF:


8. Новый электролитический конденсатор Jackcon 50V 10 uF:

9. БУ Пленочный, полипропиленовый конденсатор Pilkor MKP 330n 275V:

10. БУ Пленочный, полипропиленовый конденсатор CSD MPX .1K 275V:

11. Новый полипропиленовый конденсатор 4.7n 100V:

12. Новый полиэстровый, пленочный конденсатор 4.7 100V:

13. Новый керамический конденсатор 430:

14. БУ пленочный конденсатор MD 250V 1K:

15. БУ пленочный конденсатор UTX MEF 155K 100V:

16. БУ Конденсатор КСО 0,010 250V:

Очень было интересно в каком он состоянии, слышал про их крайнюю надежность.

17. БУ Конденсатор КСО 4300 500V:

18. БУ керамический конденсатор (Флажок) 1n0k:

19. БУ конденсатор МБМ 0.1 uF 160V:

20. БУ электролитический конденсатор HY 25V 4700 uF:

21. Пленочный конденсатор HW 475K 400V:

Транзисторы


1. Германиевый транзистор МП 26Б:

2. Германиевый транзистор МП40:

3. Транзистор КТ611Б:

4. Транзистор ВС337:

5. Транзистор IRF530N:

6. Транзистор 13007F2:

7. Транзистор КТ829А:

8. Транзистор04N60C3:

9. Транзистор германиевый П213Б:

Резисторы


1. Резистор 10W 3кОм:

2. Резистор подстроечный 10К:

3. Фото-резистор:

При слабом свете:

При ярком свете:

Индуктивность


Безымянная катушка индуктивности:

Диоды


1. Диод Шоттки STPS20:

2. Диод МД226:

3. Светодиод красный:

4. Светодиод синий:

Всякая всячина


1. Лама галогенная:

2. Симистор BTA16 600BW:

3. Стабилизатор L1117:

4. Варистор СН1-1-1 560В:

Разборка


Разбирается аппарат достаточно тривиально, откручиваем 4 самореза и готово:

Внутри нас встречает все та же Атмега 328Р:

Вывод

Товар в целом достаточно годный, определить сбойную деталь или полудохлый конденсатор пойдет. Занял место в моем наборе инструмента.

Транзистор тестер в порядочном корпусе.

Добрый день (опционально вечер/ночь).

В общем решил разжиться я подобным устройством. Но для меня по мимо функционала важен еще и внешний вид, люблю законченные устройства со своими корпусами. Поэтому выбора пал на сей аппарат. Будет разборка и немножко измерений.

Введение


В общем данная модификация тестера не попадалась мне на этом сайте, поэтому не грех и глянуть, что там и как.

Для особо нервных людей и людей с завышенными ожиданиями, не стоит данный аппарат рассматривать в качестве прибора, никогда.

По причине того, что поверку на данный аппарат не сделать, он имеет погрешность (хотя я каждую деталь замерял по три раза и погрешность на самом деле не значительная, но она есть).

Что можно сделать при помощи этого аппарата?
Да просто банально отсеять плохие детали от хороших, например, пока я писал этот обзор я достаточно много выбросил советских, старых транзисторов, к которым даже рука никогда не прикасалась после смерти отца, также можно проверить качество конденсаторов, например, я заметил, что БУ конденсаторы из блоков питания самсунгов лучше новых, купленных в магазине, я догадывался об этом, но не думал, что все действительно так плохо будет.

Этот аппарат не идеален в своих измерениях, и некоторые детали он не понимает, такие как варисторы, например, мелкие сборки LM1117 и тп.

Но давайте обо всем по порядку.

Как обычно, предупреждение:

Вся ответственность, а именно самостоятельное проникновение в корпус готового изделия с последующим нарушением его целостности работоспособности, лежит на человеке совершившим это действие.

Внешний вид


Характеристики:

• Дисплей: 128 х 160
• Ток отключения: 20нА
• Диапазон тестируемого резистора: 0,5 Ом — 50M Ом
• Диапазон тестируемой индуктивности: 0,01 мГн — 20 Гн
• Диапазон тестируемого конденсатора: 25 пФ — 100000 мкФ
• Цвет: черный
• Размеры изделия: 135 x 70 x 25 мм

• Вес изделия: 99 г

Внешний вид достаточно неплох, по размерам напоминает маленький мультиметр:

В комплекте идет ZIF разъем для подключения разнообразных деталей с объемными выводами:

Разъем держится не очень хорошо, приходиться работать двумя руками, одной держать разъем, другой зажимать деталь.

Тестер питается от кроны. На лицевой стороне имеет всего две кнопки.

Время измерения примерно пол минуты, может чуть больше если конденсатор рассчитан на большую емкость.

Я не очень понимаю страсть китайцев ко всяким логотипам, картинкам и тд в технике. Тут нас встречает лого из трансформеров:

Да, светодиод конечно же — синий. Вообще мне кажется у китайцев либо проблемы с восприятием синего, либо наоборот они видят его иначе. Чертов синий светодиод лупит по глазам, в срочном порядке будет меняться на зеленый — красный.

Так как кроны у меня нет, я буду использовать вот такое приспособление, примитивный повышатель до 9В:

Поэтому я не смогу сказать насколько сильно данный прибор жрет батарею, все-равно данный аппарат будет подвергаться переделке на литий, не люблю я кроны использовать.

Так же при каждом включении аппарат показывает версию ПО:

Думается мне, в сети гуляет достаточно много разных прошивок этих аппаратов.

Тестирование


Совсем немного пробегусь по тестированию.

Конденсаторы


1. БУ электролитический конденсатор Sanwha 400V 68 uF:

2. БУ электролитический конденсатор Teapo 200V 560 uF:

3. Новый электролитический конденсатор Yageo 35V 1000 uF:

4. БУ электролитический конденсатор Sanwha 6.3V 2200 uF:

5. Новый электролитический конденсатор Yageo 25V 1000 uF:

6. Новый электролитический конденсатор CapXon 10V 1000 uF:


7. БУ электролитический конденсатор CapXon 25V 470 uF:


8. Новый электролитический конденсатор Jackcon 50V 10 uF:

9. БУ Пленочный, полипропиленовый конденсатор Pilkor MKP 330n 275V:

10. БУ Пленочный, полипропиленовый конденсатор CSD MPX .1K 275V:

11. Новый полипропиленовый конденсатор 4.7n 100V:

12. Новый полиэстровый, пленочный конденсатор 4.7 100V:

13. Новый керамический конденсатор 430:

14. БУ пленочный конденсатор MD 250V 1K:

15. БУ пленочный конденсатор UTX MEF 155K 100V:

16. БУ Конденсатор КСО 0,010 250V:

Очень было интересно в каком он состоянии, слышал про их крайнюю надежность.

17. БУ Конденсатор КСО 4300 500V:

18. БУ керамический конденсатор (Флажок) 1n0k:

19. БУ конденсатор МБМ 0.1 uF 160V:

20. БУ электролитический конденсатор HY 25V 4700 uF:

21. Пленочный конденсатор HW 475K 400V:

Транзисторы


1. Германиевый транзистор МП 26Б:

2. Германиевый транзистор МП40:

3. Транзистор КТ611Б:

4. Транзистор ВС337:

5. Транзистор IRF530N:

6. Транзистор 13007F2:

7. Транзистор КТ829А:

8. Транзистор04N60C3:

9. Транзистор германиевый П213Б:

Резисторы


1. Резистор 10W 3кОм:

2. Резистор подстроечный 10К:

3. Фото-резистор:

При слабом свете:

При ярком свете:

Индуктивность


Безымянная катушка индуктивности:

Диоды


1. Диод Шоттки STPS20:

2. Диод МД226:

3. Светодиод красный:

4. Светодиод синий:

Всякая всячина


1. Лама галогенная:

2. Симистор BTA16 600BW:

3. Стабилизатор L1117:

4. Варистор СН1-1-1 560В:

Разборка


Разбирается аппарат достаточно тривиально, откручиваем 4 самореза и готово:

Внутри нас встречает все та же Атмега 328Р:

Вывод

Товар в целом достаточно годный, определить сбойную деталь или полудохлый конденсатор пойдет. Занял место в моем наборе инструмента.

Конденсаторы К10-7в, кд-1 и другие дисковые (за 285 ШТ)

Описание лота

Состояние Хорошее
демонтаж, отличное

Звоните по контактному телефону для уточнения номиналов в наличии. Цена указана за ВСЕ.

Керамические К10-7в (237 шт + 6 сколотых)

http://www.eandc.ru/pdf/kondensator/k10-7v.pdf

M 47p — 13

M 51p — 2

L 68p

M 82pJ

M 82pK — 5

M 91pK — 2

470p Z

M n10K (уголок немного сколот)

M n10K — 7

U n10

n10K M1500 — 2

M n12K

M n13K — 2

V n15

n18 JM — 4

n22 V — 2

U n22K — 5

M n22K

U n27K

U n30K — 2

n33KU

n47N V

n47 JU

n47K — 7

n68K — 6

Н68С М750 — 2

1n0 K — 2

1n0 JV — 2

1000 (подписано маркером)

1НОС М1500

D 2n2

D 3n3(M) — 4

3Н3 М30

D 4n7M — 3

X 4n7 — 4

D 6n8M — 2

6Н8 М30 — 2

10Н Н30 — 2

10n F — 26

10n MD — 7

10Н Н90 — 2

15n F

15Н Н90 — 2

22n F — 14

F 22n

F 33n

33n F — 19

47n F — 31

47Н Н90

68n F — 17

6 штук без маркировки (до 10-50 пф вероятно — надо мерять)

сколотые в разной степени — в довесок

M n22K

1n0K

33Н Н90 — 11 Шт

33n F

68n F — 3

Другие (возможно тоже советские выпуска 1995 — 2004 годов)

2 и последующие фото

Синие

1n0 KV — 5 ШТ

47nZ KF — 2 ШТ

4n7 KD — 5 ШТ

n10 — 4 ШТ

n15

6p2 — 2 ШТ

2n2 K — 4 ШТ

6n8 KD

Желтые

22n KF — 7 ШТ

1n0 KV — 3 ШТ

47nZ KF — 2 ШТ

n47 VD

Конденсаторы КД-1 (номиналы на фото)

4,3 пф — 3 ШТ

100 пф — 2 ШТ

33 пф — 2 Шт

27 пф

10 пф

0402-2N0K |.API Delevan — Tanssion Electronics

Buy with confidence from

Tanssion.com

0402-2N0K is warrantied and traceable.

0402-2N0K

производитель номер части0402-2N0K
производительAPI Delevan
Часть описанияFIXED IND 2NH 1.04A 70 MOHM SMD
категорияДроссели, катушки, дроссели
Листки 0402 Series
Статус бесплатного свидания / Статус RoHSСодержит несоответствие свинца / RoHS
Состояние на складеin stock
Доставить изHong Kong
Путь отгрузкиDHL/Fedex/TNT/UPS/EMS
  • Склад:in stock
  • Минимальный заказ:1
  • Краткий:1

Запросить цену

Ввести 0402-2N0K

Мы можем поставить 0402-2N0K, используйте форму цитаты запроса, чтобы запросить 0402-2N0K PERCE и Wead Time.tanssion.com Профессиональный дистрибьютор электронных компонентов.С 3+ миллионами линейных элементов имеющихся электронных компонентов могут отправлять в короткие сроки, более 250 тысяч номеров деталей электронных компонентов на складе для немедленного доставки, что может включать в себя номер детали 0402-2N0K. Цена и время выполнения 0402-2N0K в зависимости от количестваТребуется, доступность и складское место. Contact US сегодня и наш представитель продаж предоставит вам цену и доставку на части # 0402-2N0K. Мы с нетерпением ждем работы с вами, чтобы установить долгосрочные отношения сотрудничества

Характеристики

Отзывы

Характеристики

Тип Wirewound Толерантность ±10%
Поставщик Упаковка устройства Размер / Dimension 0.050″ L x 0.030″ W (1.27mm x 0.76mm)
экранирование Unshielded Серии 402
Рейтинги Q @ Freq 16 @ 250MHz
упаковка
Tape & Reel (TR)
Упаковка / Nonstandard
Другие названия 0402-2N0K TR 4000 Рабочая Температура -40°C ~ 125°C
Тип установки Surface Mount Материал — Core Ceramic
Статус бесплатного свидания / Статус RoHS Contains lead / RoHS non-compliant Частота — индуктивность 250MHz
индуктивность 2nH Высота — Сидящая (Макс) 0.024″ (0.60mm)
Частота — Self Резонансное 6GHz Подробное описание 2nH Unshielded Wirewound Inductor 1.04A 70 mOhm Max Nonstandard
Сопротивление постоянному току (DCR) 70 mOhm Max Текущий рейтинг 1.04A
Ток — Насыщенность  

Отзывы

  1. 5 Stars

    0%

  2. 4 Stars

    0%

  3. 3 Stars

    0%

  4. 2 Stars

    0%

  5. 1 Stars

    0%

Ключевые слова 0402-2N0K

  • API Delevan 0402-2N0K.
  • Технический лист 0402-2N0K
  • 0402-2N0K Datasheet
  • 0402-2N0K PDF Datasheet.
  • Скачать таблицу данных 0402-2N0K
  • 0402-2N0K Image.
  • 0402-2N0K Часть
  • API Delevan 0402-2N0K.
  • API Delevan [MIL] 0402-2N0K.
  • API Delevan Inc. 0402-2N0K.

Hum tech electronics — Знакомство с маркировкой на корпусе конденсатора

Знакомство с маркировкой на корпусе конденсатора.

Для электролитических конденсаторов маркировка проста для понимания, и у многих технических специалистов здесь нет проблем.


Проблема с неполярным конденсатором, давайте посмотрим на некоторые маркировки на неполярных конденсаторах.

Давайте посмотрим на несколько примеров:

 

Используя описанный выше метод, вы всегда получаете результат в пикофарадах (пФ)

Давайте посмотрим на приведенный выше пример конденсатора номер 224К.

Просто запишите первую и вторую цифру так, как они указаны на корпусе конденсатора.

Итак, у нас есть 22, а третья цифра — это количество нулей. Следовательно, 4 равно 4 нулям, следовательно, 224 равно 220000 пФ. Результат всегда в пикофарадах (fF)

И K — это допуск, и из таблицы видно, что K равно (+ или -) 10 %

И, наконец, максимальное напряжение 630 Вольт.

Давайте посмотрим на другой пример

Итак, у нас есть первые две цифры 39 и без добавления нуля, я имею в виду, что у вас есть 39 пФ.Если бы это было 391, то это могло бы быть 39, затем добавить один ноль (0) и, следовательно, снова могло бы быть 39 0 пФ, допуск равен K, поэтому +-10 %

Максимальное напряжение 1кВ

Мы знаем, что 1К=1000 единиц, поэтому (1кВ=1000В)

Вот еще пример неполяризованного конденсатора написанного на корпусе 1н0К

То же, что и конденсатор 1,0n:

Учитывая 1 микро (мкФ) = 1000 нФ

1 нано=1000 пф

Так 1.0n равно 1000 пФ и допуск +-10%

Максимальное рабочее напряжение 100 Вольт

Наконечник: кодировка маркировка корпуса керамического конденсатора:

Запишите первые две цифры кода, а затем добавьте количество нулей, указанное третьей цифрой кода.

Примеры:

Обратите внимание, что конденсатор 7n2=7k2=7200pF это одно и то же.

Ответы: а) 10 000 пФ

                 b)330 000 пФ

                 c) 22 000 пФ

                 г) 20 000 пФ

Если вы прошли тест и правильно ответили на вопросы, то вы должны оценить себя за чашечкой кофе.

На этом пока все друзья


Берегите себя


Нажмите здесь, чтобы прочитать мою электронную книгу по поиску и устранению неисправностей и ремонту ЭЛТ-телевизоров с точки зрения технического специалиста



 

Vintage Electro-Harmonix Bubble Font Big Muff Pi | Гитара

Sovtek Bubble Font Big Muff

Педаль в хорошем состоянии; отсутствуют ручки и есть фальсифицированный переключатель (верхняя часть пропала, поэтому я приклеил ножку вау к верхней части).Это работало до 24 часов назад, возможно, переключатель вышел из строя, но у меня нет времени, чтобы исправить это.

Педаль продается как неработающая, если вы хотите попробовать, вы можете получить муфту дешевле, чем обычно.

Получите ваши черные ключи / Дэн Ауэрбах на…

———————————————- ————————————————— —————-
Немного истории о Sovtek Big Muffs:
Зеленые русские Big Muffs Pi — самые распространенные БМП Sovtek, которые можно найти в Эпоха 1990-х годов.Также известен как Высокий Шрифт и Пузырьковый Шрифт Зеленых Русских. Танкоподобный военный внешний вид делал эти педали весьма уродливыми и очень желанными. Они поставлялись в том же деревянном ящике в стиле милитари с русскими буквами, что и Red Army Overdrive Майка Мэтьюза и предыдущие БМП Sovtek, хотя графика на коробке изменилась где-то во время третьего выпуска. Они были сделаны в Санкт-Петербурге Россия.
Вопреки распространенному мнению, эти российские БМП не производились с использованием запасных частей танков, ящиков с боеприпасами, фугасов (!) или любого другого хлама военного оружия.Они были сделаны на бывшем российском заводе военной техники, которым управляли два русских полковника. Некоторые компоненты печатной платы могли быть изготовлены или закуплены в эпоху холодной войны, но это максимально близко к военным деталям. Интересно отметить, что действительно существовал русский танк под названием БМП. Нет, не для Big Muff Pi, а для Броневой Машины Пьехоты. Это был бронетранспортер, разработанный во время холодной войны для перевозки пехоты на поле боя.Он был тяжелым, надежным, но имел относительно тонкую броню (звучит знакомо?). Впервые он был замечен на публике в ноябре 1967 года на советском параде на Красной площади.

ГРАФИКА И ЦВЕТА. Двухцветная цветовая схема Sovtek Big Muff времен Гражданской войны, выпущенная в конце 1990-х годов, уже изменилась на полностью зеленую коробку с черной графикой. Теперь графика изменена, чтобы использовать более простые буквы Big Muff. Было три издания. В первом издании, получившем прозвище «Высокий шрифт, зеленый русский», были высокие, сжатые буквы Big Muff.В дополнение к английской маркировке MADE IN RUSSIA, как и на предыдущей Muff, эта версия также имела те же слова русскими буквами, нанесенными трафаретной печатью на передней части. В последний раз русские буквы были замечены на Red Army Overdrive, но до сих пор они никогда не появлялись на других русских Big Muff. Они оставались на каждом русском Big Muff до тех пор, пока EH не прекратил их выпуск в 2009 году. Во втором издании примерно 1995 года, получившем прозвище Bubble Font Green Russian, буквы Big Muff были закруглены. Третье издание сохранило графику с пузырьковым шрифтом, но коробка была заменена на легкую коробку из листового металла с шестью винтами и металлической крышкой батарейного отсека.Буквы CE были добавлены к рисунку на конце коробки. Маркировка CE удостоверяет, что продукт соответствует требованиям ЕС (Европейского союза, состоящего из 27 государств-членов с экономическими и политическими стандартами) в отношении потребительской безопасности, здоровья или окружающей среды. Зеленый цвет менялся во время производства, как вы можете видеть на фотографиях ниже, хотя некоторые различия в цвете связаны с разным освещением и условиями баланса белого на этих фотографиях. Большинство из них были оливково-серого военного зеленого цвета, хотя некоторые были на оттенок светлее или темнее, а некоторые были ярко-травяно-зелеными.Я предполагаю, что у завода в Санкт-Петербурге должны были быть проблемы с совместимостью с поставщиками краски в России. Краска на первом издании Tall Font green Big Muffs была очень плохого качества и буквально отслаивалась. Большинство русских шрифтов с высоким шрифтом такие, но более поздние русские шрифты с пузырьковым шрифтом имеют лучшую краску.
ОРГАНЫ УПРАВЛЕНИЯ / РУЧКИ. Были замечены некоторые ранние образцы с теми же серыми ручками, которые использовались в версии 7B Green Civil War Big Muffs, описанной выше, но большинство из них имеют обычные черные ручки с ямочками и ребристыми сторонами.Во время производства использовалось как минимум четыре разных больших ножных переключателя разных размеров и форм.
ЦЕПЬ — Первое и второе издания имели ту же схему, что и переходная Зеленая гражданская война Big Muffs. У некоторых высоких шрифтов первого выпуска были точно такие же печатные платы, детали и прозрачные / серые пластиковые разъемы, что и у зеленого Civil War V7B. В более поздних первых и вторых версиях использовалась новая трассировка печатной платы (# BM-1-01.00.000) и разъемы нового стиля с черными кольцами. Новая трассировка платы (#BM-1-01.00.001) был создан для третьего издания. Некоторые третьи выпуски 1995 года имели другой шаблон трассировки на печатной плате в форме буквы «Т» без номера печатной платы.
Транзисторы NPN Russian Silicon обычно были без маркировки, в черном пластиковом корпусе Т092 с белыми и зелеными точками, нарисованными сверху и по бокам. Некоторые третьи выпуски имели трансмиссии в корпусе TO92 с маркировкой 3102, EF или EE1. Иногда в первых выпусках использовались транзисторы в металлическом корпусе TO18 с маркировкой NPN KT3102E 9108. Во втором и третьем изданиях двойные конденсаторы 1n0K в каждом из первых трех каскадов схемы были заменены одним конденсатором емкостью 470 пФ.Это убрало часть баса из тона и сделало их немного более грубыми и менее гладкими, чем Muffs Civil War, но больше похожими на первое издание Red Army Overdrive с конденсаторами 430pF. Использовались пленочные конденсаторы, а также плоские прямоугольные зеленые или красные керамические колпачки, а иногда и круглые керамические дисковые колпачки. Никакие электролиты не использовались, кроме поляризованного фильтра питания 20-22 мкФ. Резисторы представляли собой смесь углеродного состава или металлической пленки. ПИТАНИЕ — Питание только от батареи 9В.Красный светодиод показывает, когда цепь включена. Для подключения к стандартному блоку питания переменного тока типа Boss используйте адаптер для батареи 9 В 100 мА, например 1 Spot CBAT. Если вы собираетесь добавить стандартный разъем питания 9 В, который работает со стандартными источниками питания с отрицательным наконечником, вы можете узнать, куда подключать провода + и -, посмотрев на схему подключения для вашей версии или просто следуя красным (+) и черные (-) провода от аккумулятора защёлкиваются.

Как и в предыдущей версии Civil War, на некоторых печатных платах появляется нарисованный от руки серийный номер, хотя это случается редко.Я считаю, что это фактические порядковые номера единиц по мере их изготовления. Вряд ли номер является последовательным для всего производства этой версии. Нумерация, скорее всего, повторялась ежемесячно или ежегодно или, возможно, повторялась при каждом изменении цвета или графики. Очевидно, практика была прекращена для второго издания Green Russian и всех последующих русских Muffs.
КОРОБКА ДЛЯ КОРОБКИ. Первые версии имели те же литые коробки с четырьмя винтами, ребристыми сторонами и верхними частями из листового металла, что и предыдущая версия Green Civil War, и такую ​​же пластиковую крышку батарейного отсека.У некоторых из первых выпусков гребни были отполированы, как у муфт гражданской войны, хотя это было редко. Эти коробки были обработаны грубо, с небрежной очисткой отливов формы. У второго издания была такая же коробка, но печатная графика изменилась. К днищу коробки были приклеены четыре резиновые ножки, склонные к падению, как и в предыдущих выпусках. Третье издание было изменено на менее дорогой шестивинтовой, легкий, полностью сложенный корпус из листового металла с металлической крышкой батарейного отсека. Резиновые ножки были привинчены к нижней части этого издания.
————————————————————— —————————————————
Приоритетная доставка стоит 20 долларов США. читать дальше…

Поиск

может быть отправлен в тот же день. Paypal принят, закажите онлайн сегодня!


Купите сейчас, вам понравится
✓Отправьте заказ в тот же день!
✓Доставка по всему миру!
✓Ограниченная распродажа
✓Легкий возврат.

Обзор продукта
Название продукта Поиск
Доступное количество Возможна отправка немедленно
Модель №.
Код ТН ВЭД 85290
Минимальное количество Начиная с одной детали
Атрибуты продукта
Категории
  • идентификатор продукта
    артикул
    gtin14
    мпн
    Статус детали Активный
    Все основные кредитные и дебетовые карты через PayPal.
    Paypal (AMEX принимается через Paypal)
    Мы также можем принять банковский перевод. Просто отправьте нам электронное письмо с URL-адресами или кодами продукта. Укажите адрес доставки и предпочтительный способ доставки. Затем мы вышлем вам полные инструкции по электронной почте.

    Мы никогда не храним данные вашей карты, они остаются в Paypal

    Товары пересылаются почтовыми службами и оплачиваются по себестоимости.
    Товары будут отправлены в течение 1-2 рабочих дней после оплаты. Доставка может быть объединена при покупке большего количества.
    Другие способы доставки могут быть доступны при оформлении заказа — вы также можете сначала связаться со мной для получения подробной информации.
    Судоходная компания Расчетное время доставки Информация об отслеживании
    Плоская транспортировочная 30-60 дней Нет в наличии
    Заказная авиапочта 15-25 дней В наличии
    ДХЛ/ЭМС/ФЕДЕРАЛ ЕХПРЕСС/ТНТ 5-10 дней В наличии
    Окончательное время доставки Может быть задержано вашей местной таможней из-за таможенного оформления.

    Возврат принимается, если продукт не соответствует описанию, покупатель оплачивает стоимость обратной доставки; или сохранить товар и договориться о возврате с продавцом.

    Подробнее о защите покупок PayPal см.
    Получите заказанный товар или верните деньги.
    Включает стоимость покупки и первоначальную стоимость доставки.
    Если вы не получили товар в течение 25 дней, просто сообщите нам об этом, будет выдан новый пакет или замена.
    Программа защиты покупателей PayPal
    Защита вашей покупки от клика до доставки
    Вариант 1) Полный возврат средств, если вы не получили свой заказ
    Вариант 2) Полный или частичный возврат, если товар не соответствует описанию
    Если ваш товар значительно отличается от нашего описания продукта, вы можете A: вернуть его и получить полный возврат средств или B: получить частичный возврат средств и сохранить товар.

    Спецификация или техническая спецификация в формате PDF доступны для скачивания по запросу.

    Почему выбирают нас?

  • Расположен в Шэньчжэне, центре электронного рынка Китая.
  • 100% гарантия качества компонентов: Оригинал.
  • Достаточный запас по вашему срочному требованию.
  • Опытные коллеги помогут вам решить проблемы, чтобы снизить риск при производстве по требованию.
  • Более быстрая доставка: компоненты, имеющиеся на складе, могут быть отправлены в тот же день.
  • Круглосуточная служба.
  • Каковы ваши основные продукты?

    Наша основная продукция
    Интегральные схемы (ИС) Дискретный полупроводник Потенциометры, регулируемые R
    Звук специального назначения Аксессуары Реле
    Часы/хронометраж Мостовые выпрямители Датчики, преобразователи
    Сбор данных Диакс, Сидак Резисторы
    Встроенный Диоды Катушки индуктивности, катушки, дроссели
    Интерфейс МОП-транзисторы Фильтры
    Изоляторы — драйверы затворов БТИЗ Кристаллы и генераторы
    Линейный JFET (эффект поля перехода) Соединители, межсоединения
    Логика ВЧ полевые транзисторы Конденсаторы
    Память ВЧ-транзисторы (БЮТ) Изоляторы
    PMIC SCR Светодиод
    Транзисторы (БЮТ)
    Транзисторы
    Триаки

    Какова цена?

  • Все цены указаны за единицу в долларах США (USD).
  • Цена на некоторые детали нестабильна в зависимости от рынка, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам, чтобы узнать самую последнюю и лучшую цену.
  • Какой способ оплаты?

  • PayPal, кредитные карты через PayPal, банковский перевод, Western Union.
  • Покупатель несет ответственность за все расходы по доставке.
  • Пожалуйста, свяжитесь с нами, если вы предпочитаете другой способ оплаты.
  • Что такое возврат и замена?

  • Если есть какие-либо проблемы с качеством, убедитесь, что все эти предметы должны быть возвращены в их первоначальном состоянии, чтобы иметь право на возврат или замену.(Любые использованные или поврежденные предметы не могут быть возвращены или заменены).
  • Каков минимальный объем заказа вашей продукции?

  • Минимальный объем заказа от ОДНОЙ штуки.
  • Вы можете купить столько, сколько захотите.
  • Когда вы отправите мне детали?

  • Мы отправим вам детали в тот же день после получения оплаты.
  • Как разместить заказ?

  • Добавьте товар в корзину, а затем перейдите к оформлению заказа на нашем веб-сайте.
  • Предлагаете ли вы техническую поддержку?

  • Да, наш технический инженер поможет вам с информацией о распиновке 2SD1733TLR, примечаниями по применению, замена, даташит в pdf, инструкция, схема, аналог, перекрестная ссылка.
  • Предоставляете ли вы гарантию?

  • Да, мы предоставляем 6-месячную гарантию на наш продукт.
  • Как сделать наш бизнес долгосрочным и хорошим?

  • Мы поддерживаем хорошее качество и конкурентоспособные цены.
  • Мы уважаем каждого клиента как нашего друга и работаем добросовестно!
  • По любым другим вопросам, пожалуйста, обращайтесь к нам.Мы всегда к вашим услугам!

    %PDF-1.4 % 8442 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 8442 47 0000000016 00000 н 0000001295 00000 н 0000001724 00000 н 0000001801 00000 н 0000001861 00000 н 0000001918 00000 н 0000001975 00000 н 0000002032 00000 н 0000002089 00000 н 0000002938 00000 н 0000003303 00000 н 0000003409 00000 н 0000003554 00000 н 0000003693 00000 н 0000003832 00000 н 0000003971 00000 н 0000004110 00000 н 0000004249 00000 н 0000004388 00000 н 0000004527 00000 н 0000004666 00000 н 0000005338 00000 н 0000005770 00000 н 0000005813 00000 н 0000006039 00000 н 0000006260 00000 н 0000006291 00000 н 0000007935 00000 н 0000007959 00000 н 0000008176 00000 н 0000008368 00000 н 0000038432 00000 н 0000044309 00000 н 0000052217 00000 н 0000052425 00000 н 0000052505 00000 н 0000055184 00000 н 0000055250 00000 н 0000055317 00000 н 0000055384 00000 н 0000055451 00000 н 0000055518 00000 н 0000055585 00000 н 0000055653 00000 н 0000055721 00000 н 0000002233 00000 н 0000002915 00000 н трейлер ] >> startxref 0 %%EOF 8443 0 объект > >> /LastModified (D:20071004095017) /МаркИнфо > /PageLayout /OneColumn /ViewerPreferences > >> эндообъект 8444 0 объект > эндообъект 8445 0 объект [ 8446 0 Р 8447 0 Р 8448 0 Р 8449 0 Р ] эндообъект 8446 0 объект )>> /Ф 35 0 Р >> эндообъект 8447 0 объект )>> /Ф 36 0 Р >> эндообъект 8448 0 объект )>> /Ф 82 0 Р >> эндообъект 8449 0 объект )>> /Ф 83 0 Р >> эндообъект 8450 0 объект > эндообъект 8487 0 объект > ручей Hb«`f`d11 +P&!w;)_VcfNL,xz-`py.ZH

    ПРОДАНО — Винтаж Electro-Harmonix Tall Font Big Muff Pi | Совтек Зеленый Русский EHX

    {} {} {} {}

    Только Paypal за 250 долларов США, включая прекрасную упаковку и доставку USPS в нижнюю часть 48

    Sovtek Tall Font Big Muff

    Никаких проблем со звуком — Педаль работает и звучит потрясающе.

    Педаль была вокруг блока, но у нее нет проблем в отделе тона. Как вы можете видеть, у него отсутствует крышка аккумуляторного отсека (обычное явление для них). Включает в себя зажим для батареи 9 В, поэтому вы можете использовать его от источника питания на вашей плате.

    Вот он. ТОТ САМЫЙ. Это волшебный «Зеленый русский» с винтами спереди (как показано на последней картинке. Это ТА ЖЕ модель, которую использует Хуан Альдерете (Racer X, Mars Volta, Deltron 3030) и противопоставляет любой другой пушок, известный человеку в его Сериал Fuzz Wars на YouTube. Эта педаль фузза уничтожит их всех. Та же эпоха, тот же корпус, тот же потрясающий звук.

    Наденьте свои Black Keys / Dan Auerbach тоже… ————————————————— —————————————

    Теперь немного истории о Sovtek Big Muffs:

    Зеленые русские Big Muffs Pi — самые распространенные БМП Совтек, которые можно найти с 1990-х годов.Также известен как Высокий Шрифт и Пузырьковый Шрифт Зеленых Русских. Танкоподобный военный внешний вид делал эти педали весьма уродливыми и очень желанными. Они поставлялись в том же деревянном ящике в стиле милитари с русскими буквами, что и Red Army Overdrive Майка Мэтьюза и предыдущие БМП Sovtek, хотя графика на коробке изменилась где-то во время третьего выпуска. Они были сделаны в Санкт-Петербурге Россия.
    Вопреки распространенному мнению, эти российские БМП были сделаны без запасных частей танков, ящиков с боеприпасами, фугасов (!) или любого другого хлама военного оружия.Они были сделаны на бывшем российском заводе военной техники, которым управляли два русских полковника. Некоторые компоненты печатной платы могли быть изготовлены или закуплены в эпоху холодной войны, но это максимально близко к военным деталям. Интересно отметить, что действительно существовал русский танк под названием БМП. Нет, не для Big Muff Pi, а для Броневой Машины Пьехоты. Это был бронетранспортер, разработанный во время холодной войны для перевозки пехоты на поле боя.Он был тяжелым, надежным, но имел относительно тонкую броню (звучит знакомо?). Впервые он был замечен на публике в ноябре 1967 года на советском параде на Красной площади.

    ГРАФИКА И ЦВЕТА. Двухцветная цветовая схема Sovtek Big Muff времен Гражданской войны, выпущенная в конце 1990-х годов, уже была изменена на полностью зеленую коробку с черной графикой. Теперь графика изменена, чтобы использовать более простые буквы Big Muff. Было три издания. В первом издании, получившем прозвище «Высокий шрифт, зеленый русский», были высокие, сжатые буквы Big Muff.В дополнение к английской маркировке MADE IN RUSSIA, как и на предыдущей Muff, эта версия также имела те же слова русскими буквами, нанесенными трафаретной печатью на передней части. В последний раз русские буквы были замечены на Red Army Overdrive, но до сих пор они никогда не появлялись на других русских Big Muff. Они оставались на каждом русском Big Muff до тех пор, пока EH не прекратил их выпуск в 2009 году. Во втором издании примерно 1995 года, получившем прозвище Bubble Font Green Russian, буквы Big Muff были закруглены. Третье издание сохранило графику с пузырьковым шрифтом, но коробка была заменена на легкую коробку из листового металла с шестью винтами и металлической крышкой батарейного отсека.Буквы CE были добавлены к рисунку на конце коробки. Маркировка CE удостоверяет, что продукт соответствует требованиям ЕС (Европейского союза, состоящего из 27 государств-членов с экономическими и политическими стандартами) в отношении потребительской безопасности, здоровья или окружающей среды. Зеленый цвет менялся во время производства, как вы можете видеть на фотографиях ниже, хотя некоторые различия в цвете связаны с разным освещением и условиями баланса белого на этих фотографиях. Большинство из них были оливково-серого военного зеленого цвета, хотя некоторые были на оттенок светлее или темнее, а некоторые были ярко-травяно-зелеными.Я предполагаю, что у завода в Санкт-Петербурге должны были быть проблемы с совместимостью с поставщиками краски в России. Краска на первом издании Tall Font green Big Muffs была очень плохого качества и буквально отслаивалась. Большинство русских шрифтов с высоким шрифтом такие, но более поздние русские шрифты с пузырьковым шрифтом имеют лучшую краску.

    ОРГАНЫ УПРАВЛЕНИЯ / РУЧКИ. Были замечены некоторые ранние образцы с теми же серыми ручками, которые использовались в версии 7B Green Civil War Big Muffs, описанной выше, но большинство из них имеют обычные черные ручки с ямочками на вершине и ребристыми сторонами.Во время производства использовалось как минимум четыре разных больших ножных переключателя разных размеров и форм.

    ЦЕПЬ — Первое и второе издания имели ту же схему, что и переходные «Зеленые большие муфты Гражданской войны». У некоторых высоких шрифтов первого выпуска были точно такие же печатные платы, детали и прозрачные / серые пластиковые разъемы, что и у зеленого Civil War V7B. В более поздних первых и вторых версиях использовалась новая трассировка печатной платы (# BM-1-01.00.000) и разъемы нового стиля с черными кольцами. Для третьего издания была создана новая трассировка платы (#BM-1-01.00.001).Некоторые третьи выпуски 1995 года имели другой шаблон трассировки на печатной плате в форме буквы «Т» без номера печатной платы.

    Транзисторы NPN Russian Silicon обычно были без маркировки, в черном пластиковом корпусе Т092 с нарисованными сверху и по бокам белыми и зелеными точками. Некоторые третьи выпуски имели трансмиссии в корпусе TO92 с маркировкой 3102, EF или EE1. Иногда в первых выпусках использовались транзисторы в металлическом корпусе TO18 с маркировкой NPN KT3102E 9108. Во втором и третьем изданиях
    двойные конденсаторы 1n0K в каждом из первых трех каскадов схемы были заменены одним конденсатором емкостью 470 пФ.Это убрало часть баса из тона и сделало их немного более грубыми и менее гладкими, чем Muffs Civil War, но больше похожими на первое издание Red Army Overdrive с конденсаторами 430pF. Использовались пленочные конденсаторы
    , а также плоские прямоугольные зеленые или красные керамические колпачки, а иногда и круглые керамические дисковые колпачки. Никакие электролиты не использовались, кроме поляризованного фильтра питания 20-22 мкФ.
    Резисторы представляли собой смесь углеродного состава или металлической пленки.
    ПИТАНИЕ — Питание только от батареи 9В.Красный светодиод показывает, когда цепь включена. Для подключения к стандартному блоку питания переменного тока типа Boss используйте адаптер для батареи 9 В 100 мА, например 1 Spot CBAT. Если вы собираетесь добавить стандартный разъем питания 9 В, который работает со стандартными источниками питания с отрицательным наконечником, вы можете узнать, куда подключать провода + и -, посмотрев на схему подключения для вашей версии или просто следуя красным (+) и черные (-) провода от аккумулятора защёлкиваются.

    Как и в предыдущей версии Civil War, на некоторых платах появляется нарисованный от руки серийный номер, хотя это случается редко.Я считаю, что это фактические порядковые номера единиц по мере их изготовления. Вряд ли номер является последовательным для всего производства этой версии. Нумерация, скорее всего, повторялась ежемесячно или ежегодно или, возможно, повторялась при каждом изменении цвета или графики. Очевидно, практика была прекращена для второго издания Green Russian и всех последующих русских Muffs.

    КОРОБКА ДЛЯ КОРПУСОВ. Первые версии имели те же литые коробки с четырьмя винтами, ребристыми сторонами и верхней частью из листового металла, что и предыдущая версия Green Civil War, и такую ​​же пластиковую крышку батарейного отсека.У некоторых из первых выпусков гребни были отполированы, как у муфт гражданской войны, хотя это было редко. Эти коробки были обработаны грубо, с небрежной очисткой отливов формы. У второго издания была такая же коробка, но печатная графика изменилась. К днищу коробки были приклеены четыре резиновые ножки, склонные к падению, как и в предыдущих выпусках. Третье издание было изменено на менее дорогой шестивинтовой, легкий, полностью сложенный корпус из листового металла с металлической крышкой батарейного отсека. Резиновые ножки были привинчены к нижней части этого издания.

     

    индукторов Дистрибьютор | Sierra IC Inc, заказ онлайн. (стр. каталога 1)

    Мобильная версия Онлайн-заказ Статус заказа Продукты Карта сайта Карта сайта Справочный центр О Sierra Ic Свяжитесь с нами Усилители Защита цепи Связь Преобразование данных Фильтр Катушки индуктивности Межсоединения Пассивные компоненты Источники питания Продукты UnCategorizedПолупроводники и активы

    Copyright © 2003-2022, Sierra IC.Все права защищены.

    16151 Lancaster Hwy Charlotte, Северная Каролина 28277 США | Телефон: 1-866-296-0911 или 704-256-0088 | Факс: 631-207-8305

    [email protected]

    Являясь независимым дистрибьютором, Sierra IC Inc. не связана с производителями продаваемой ею продукции, за исключением случаев, когда прямо указано иное.
    Любые и все права на товарные знаки, связанные с именами производителей и продуктами, принадлежат соответствующим производителям.
    В качестве независимого дистрибьютора Никакие гарантии производителя не предлагаются, если прямо не указано иное.Sierra IC НЕ является авторизованным дистрибьютором/дилером или торговым представителем ЛЮБОГО производителя.
    Заявление об отказе от ответственности: несмотря на то, что Sierra IC Inc. прилагает разумные усилия для сохранения материалов, представленных на этом веб-сайте, Sierra IC Inc., ее сотрудники, поставщики контента или любая другая сторона, внесшая свой вклад, не делает никаких заявлений/гарантий, что информация, содержащаяся здесь, является точной во всех аспектах. или полными, и, таким образом, не несут ответственности за какие-либо ошибки или упущения или за результаты, полученные в результате использования такой информации.Это всеобъемлющее ограничение ответственности, которое распространяется на все виды убытков, включая (помимо прочего) компенсационные, прямые, косвенные или косвенные убытки, финансовые убытки, потерю данных, доходов или прибыли или претензии третьих лиц.

    SIERRA IC INC ДАЕТ 30-ДНЕВНУЮ ОГРАНИЧЕННУЮ ГАРАНТИЮ НА ВСЕ ПРОДУКТЫ, ПРОДАВАЕМЫЕ КОМПАНИЕЙ, В ОСОБЕННОСТИ НА ЛЮБОЙ ПРОДУКТ, ПРОДАВАЕМЫЙ КОМПАНИЕЙ SIERRA IC INC, НЕ СООТВЕТСТВУЕТ ТЕХНИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ УРОВНЯ ЭТОГО ПРОДУКТА В СООТВЕТСТВИИ С СООТВЕТСТВУЮЩИМ СТАНДАРТАМ MIIL-SPEC ИЛИ КОММЕРЧЕСКОМУ СТАНДАРТУ IC ВЫДАЕТ RMA ДЛЯ ВОЗВРАТА ИЛИ ЗАМЕНЫ ПРОДУКТА, И ЭТО ЯВЛЯЕТСЯ ЕДИНСТВЕННЫМ ВОЗМОЖНОСТЬЮ КЛИЕНТА ДЛЯ РАЗРЕШЕНИЯ ЛЮБЫХ ПРЕТЕНЗИЙ.КЛИЕНТ/ПОКУПАТЕЛЬ ПРИЗНАЕТ, ЧТО ЭТИ ТОВАРЫ, ПРЕДЛАГАЕМЫЕ ДЛЯ ПРОДАЖИ КОМПАНИЕЙ SIERRA IC INC, НЕ ПРЕДСТАВЛЕНЫ КАК ИМЕЮТ ВСЕ ОРИГИНАЛЬНЫЕ СЕРТИФИКАТЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ. КОНКРЕТНО, ИЗВЕСТНО, ЧТО ПРОСЛЕЖИВАНИЕ ДО ПРОИЗВОДИТЕЛЯ ОРИГИНАЛЬНОГО КОМПОНЕНТА НЕДОСТУПНО. КЛИЕНТ ПРИЗНАЕТ, ЧТО ПРОДУКТ МОЖЕТ БЫТЬ НЕ В ОРИГИНАЛЬНОЙ УПАКОВКЕ, И ИЗ-ЗА ОТСУТСТВИЯ ПРОСЛЕЖИВАЕМОСТИ ДЛЯ SIERRA IC INC НЕВОЗМОЖНО, ЧТО ПРОДУКТ ЯВЛЯЕТСЯ ОРИГИНАЛЬНЫМ ПО ВСЕХ СВОИХ ХАРАКТЕРИСТИКАХ. ЗАКАЗЧИК СОГЛАШАЕТСЯ ПРОВЕДЕНИЕ ВСЕХ ИСПЫТАНИЙ, ЧТОБЫ УБЕДИТЬСЯ В ЭКСПЛУАТАЦИОННОЙ ПРИГОДНОСТИ ПРОДУКТА.ИЗДЕЛИЯ ТАКЖЕ НЕ ДОЛЖНЫ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ В КАКОМ-ЛИБО ОБЕСПЕЧЕНИИ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ ИЛИ ВАЖНОМ ОБСЛУЖИВАНИИ БЕЗ ПОВТОРНОЙ СЕРТИФИКАЦИИ И ИСПЫТАНИЙ НА СООТВЕТСТВИЕ ВОЕННЫМ/ВЫСОКОЙ НАДЕЖНОСТИ. SIERRA IC НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБОЙ УЩЕРБ, ВКЛЮЧАЯ, ПОМИМО ПРОЧЕГО, ПРЯМОЙ, СЛУЧАЙНЫЙ ИЛИ КОСВЕННЫЙ УЩЕРБ ИЛИ ЛЮБЫЕ ДРУГИЕ ПРЕТЕНЗИИ, СВЯЗАННЫЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННОГО ПРОДУКТА. ЗАКАЗЧИК ПРИНИМАЕТ НА СЕБЯ ВСЕ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ДАННЫЙ ПРОДУКТ.

    Идентификация гена Wee1-подобной киназы, необходимого для выживания проциклической Trypanosoma brucei

    PLoS One.2013; 8(11): e79364.

    , 1 , 1 , ¤ , 2 , 1 , 3 , 3 и 1 , *

    Бойнак Наталья Юрьевна

    1 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genetica y Biologia Molecular «Dr. Эктор Н. Торрес», (INGEBI-CONICET), Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Федерико Рохас

    1 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genetica y Biologia Molecular «Dr.Эктор Н. Торрес», (INGEBI-CONICET), Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Сесилия Д’Алессио

    2 Лаборатория гликобиологии, Fundación Instituto Leloir и Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires-CONICET, Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Саломе К. Вилчес Ларреа

    1 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genetica y Biologia Molecular «Dr. Эктор Н. Торрес», (INGEBI-CONICET), Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Ванина Родригес

    3 Департамент науки и технологий, Национальный университет Кильмеса, Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Пабло Д.Гирингелли

    3 Департамент науки и технологий, Национальный университет Кильмеса, Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Мария Т. Теллес-Иньон

    1 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genetica y Biologia Molecular «Dr. Эктор Н. Торрес», (INGEBI-CONICET), Буэнос-Айрес, Аргентина,

    М. Каролина Элиас, редактор

    1 Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genetica y Biologia Molecular «Dr.Эктор Н. Торрес», (INGEBI-CONICET), Буэнос-Айрес, Аргентина,

    2 Лаборатория гликобиологии, Fundación Instituto Leloir и Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires-CONICET, Буэнос-Айрес, Аргентина,

    3 Департамент науки и технологий, Национальный университет Кильмеса, Буэнос-Айрес, Аргентина,

    Instituto Butantan, Laboratorio Especial de Toxinologia Aplicada, Бразилия,

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Придумал и спроектировал эксперименты: ФР НБ МТТИ. Выполнены опыты: НБ FR CDA SCVL. Проанализированы данные: НБ ФР ЦДА МТТИ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: VR PDG. Написал рукопись: НБ ФР ЦДА МТТИ.

    ¤ Текущий адрес: Институт иммунологии и инфекционных исследований, Школа биологических наук, Ashworth Laboratories, Эдинбургский университет, Эдинбург, Шотландия

    Поступила в редакцию 25 июля 2013 г.; Принято 28 сентября 2013 г.

    Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что первоначальный автор и источник должным образом указаны.

    Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

    Abstract

    Регуляция прогрессирования эукариотического клеточного цикла требует последовательной активации и инактивации циклинзависимых киназ (CDK). Активация комплекса циклин B-cdc2 киназы является ключевой стадией инициации митоза, а тирозинкиназа Wee1 является ключевым регулятором последовательности клеточного цикла во время перехода G2/M и ингибирует вступление в митоз путем фосфорилирования ингибирующего тирозина 15 на M-фазе cdc2. -индуцирующая киназу.Деградация Wee1 необходима для выхода из фазы G2. У трипаносоматид мало что известно о генах, которые регулируют комплексы циклин B-cdc2 на переходе G2/M их клеточного цикла. Хотя канонические тирозинкиназы отсутствуют в геноме трипаносоматид, фосфорилирование остатков белка тирозина было зарегистрировано у Trypanosoma brucei. Здесь мы охарактеризовали ген Wee1-подобной протеинкиназы из T. brucei . Экспрессия TbWee1 в штамме Schizosaccharomyces pombe , нулевом для Wee1, ингибировала клеточное деление и вызывала удлинение клеток.Это демонстрирует удлинение G2, что дает клеткам дополнительное время для роста перед делением. Wee1-подобная протеинкиназа экспрессировалась в проциклических и пролиферативных тонких формах T. brucei, а роль Wee1 в развитии клеточного цикла была проанализирована путем создания клеточных линий с РНК-интерференцией. В проциклической форме T. brucei нокдаун экспрессии TbWee1 с помощью РНКи приводил к ингибированию роста паразита. В этих клеточных линиях РНКи наблюдали аномальные фенотипы, показывающие увеличение процента клеток с 1N0K, 0N1K и 2N1K.Используя паразитов с синхронизированным клеточным циклом, мы продемонстрировали, что TbWee1 связан с фазой G2/M. Мы также показали, что TbWee1 является важным геном, необходимым для правильного развития клеточного цикла и роста паразитов у T. brucei . Наши результаты свидетельствуют о существовании функционального Wee1 у T. brucei с потенциальной ролью в клеточном делении на G2/M.

    Введение

    Регуляторные пути, контролирующие клеточный цикл эукариот, очень хорошо изучены у дрожжей и высших эукариотических клеток, и было показано, что они включают сложную сеть регуляторных белков, таких как циклины, циклинзависимые киназы (CDK) и ингибиторы CDK ( CKI) [1].Активность CDK регулируется как связыванием циклина, так и фосфорилированием консервативных остатков. Обратимое фосфорилирование белков протеинкиназами и фосфатазами является основным механизмом регуляции большинства клеточных процессов в эукариотических организмах [2]. Прогресс через фазовый переход G2/M у эукариот требует активности циклина B/Cdk1, которая, в свою очередь, регулируется посредством динамического фосфорилирования, основного регуляторного механизма большинства клеточных процессов в эукариотических организмах [3]. Статус фосфорилирования треонина 14 (T14) и тирозина 15 (Y15) каталитической субъединицы CDK регулирует их активность и определяет время G2 и митоза [4].

    Фосфорилирование Wee1 по остатку Y15 в сайте связывания АТФ блокирует активность Cdk1, тогда как дефосфорилирование его антагонистом CDC25 активирует фермент, запуская переход из G2- в М-фазу [4]. Противоположные активности Wee1 и CDC25 составляют главный переключатель митоза [5]. Первоначально Wee1 был описан у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe как мишень для мутаций, которые позволяют клеткам делиться преждевременно, производя таким образом клетки вдвое меньше их обычной длины [6,7].Позже один или несколько гомологов были обнаружены у всех других исследованных эукариот, включая Saccharomyces cerevisiae [8], человека [9], Xenopus [10], мышей [11], Drosophila [12], и Arabidopsis [13]. На основании его последовательности считается, что Wee1 является атипичной тирозинкиназой, входящей в семейство серин-треонин-специфических протеинкиназ [7,14]. Wee1 содержит три домена: N-концевой регуляторный домен, центральный домен киназы и короткий C-концевой регуляторный домен [9,12,15] и регулируется на нескольких уровнях, таких как транскрипция [16], трансляция [17]. и стабильность белка [18,19].

    Trypanosoma brucei , возбудитель сонной болезни у людей и наганы у крупного рогатого скота, является простейшим паразитом со сложным жизненным циклом, включающим разных хозяев и две формы паразита: кровоток (у млекопитающих) и проциклический (у насекомых-переносчиков) [ 20]. У обеих форм клеточный цикл имеет обычные последовательные фазы G1, S, G2 и М [21], но отличается от такового у других организмов наличием кинетопластного клеточного цикла с S-фазой (SK) и фазой сегрегации кинетопластов. предшествующая ядерной S-фазе (SN) и митозу [21,22].Более того, две другие основные органеллы должны быть продублированы и точно разделены перед клеточным делением: базальное тельце и жгутик, отходящий от базального тельца.

    Молекулярная регуляция клеточного цикла T. brucei имеет уникальные и необычные особенности. Имеются четкие доказательства того, что трипаносоматидный клеточный цикл регулируется CDK [23-26], хотя модуляция активности CDK может иметь характерные для трипаносоматидов особенности. T. brucei содержит одиннадцать киназ, родственных cdc2 (CRK1-4 и CRK6-12).CDK активируются путем связывания циклинового партнера, и 10 циклинов (CYC2-11) закодированы в геноме T. brucei [25,27,28].

    Функциональный анализ некоторых родственных cdc2 киназ и циклинов T. brucei выявил их роль в регуляции различных контрольных точек клеточного цикла. Как в кровотоке, так и в проциклических формах РНК-интерференция (РНКи) CRK1 или CYC2 обогащает культивируемые в фазе G1 клетки [29–31]. Фазовый переход трипаносоматид G2/M также регулируется активностью митотической CDK.Функциональный гомолог CDK1 млекопитающих, CRK3, в комплексе с CYC6 необходим для митоза [25,30,32]. Хотя события внутриклеточной передачи сигналов еще не были подробно описаны для трипаносоматид, вполне вероятно, что фосфорилирование тирозина также играет роль в клеточных процессах, как и у высших эукариот. Фосфорилирование остатков тирозина хорошо задокументировано у трипаносоматид [33–35]; хотя ключевое различие между киномами хозяина и паразита заключается в полном отсутствии протеинкиназ, которые картируются с рецепторной тирозинкиназой и тирозинкиназоподобными группами у этих паразитов.Было высказано предположение, что фосфорилирование тирозина, вероятно, связано с действием атипичных тирозинкиназ, таких как Wee1, и киназ двойной специфичности, которые могут фосфорилировать серин, треонин и тирозин [36]. Более того, CRK3 содержит консервативный остаток тирозина (Y34) в том же субдомене, что и регуляторный тирозин CDK1 человека (Y15) [23]. Крупномасштабный фосфопротеомный анализ кровотока [35] и проциклических форм T. brucei [34] показал, что действительно имеет место фосфорилирование по остаткам тирозина на CRK3, CRK2 и CRK1, что может соответствовать консервативной канонической последовательности CDK1. мотивы.Поскольку трипаносоматиды транскрибируют большинство своих генов в больших полицистронных единицах, сигнальные каскады у этих паразитов могут функционировать посредством посттранскрипционной регуляции.

    В настоящем исследовании мы показываем, что TbWee1 представляет собой белок с последовательностью, сходной с хорошо известными Wee1-подобными киназами, экспрессируемыми как в проциклической, так и в кровяной формах T. brucei . Мы демонстрируем, что экспрессия TbWee1 у мутантов S. pombe ∆Wee1 способна восстанавливать укорочение клеточного цикла и способствовать удлинению клеток, что указывает на то, что TbWee1 функционально дополняет фенотип ΔWee1 у дрожжей.Кроме того, мы показали, что TbWee1 является важным геном, необходимым для правильного прохождения клеточного цикла и роста паразита у T. brucei .

    Материалы и методы

    Культура клеток Trypanosoma brucei

    Клетки проциклической формы T. brucei штамма 29-13 [37] культивировали при 28°С в среде SDM-79 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, PAA Laboratories GmbH). ), G-418 (15 мкг/мл) и гигромицин В (50 мкг/мл) в культуральной среде для поддержания в клетках конструкций гена Т7-РНК-полимеразы и тетрациклин-репрессора.

    Экспрессия рекомбинантного белка TbWee1 и продукция антител

    Аминокислотные последовательности человека (NP003381.1) и S. pombe (NP 587933.1) Wee1 были получены из базы данных Entrez Protein с использованием веб-сайта NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein). Каждую последовательность использовали для поиска гомологичных белков T. brucei в базе данных TriTryp (http://tritrypdb.org/tritrypdb/). Последовательности были выровнены с использованием Multiple Sequence Alignment от CLUSTALW (http://align.genome.jp). Единственный участок, кодирующий гомолог Wee1, идентифицированный в геноме паразита, был обозначен как TbWee1. Его амплифицировали из геномной ДНК, полученной из T. brucei с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов 5´-GAATTCATGTTGGCGCCTAAAGGGG-3´ и 5´-CGGATATCCTAAAATTTTGCACTATCTCC-3´ (сайты рестрикции, соответствующие EcoRI и EcoRV, подчеркнуты). полимераза Pfu (Stratagene, La Jolla, США). TbWee1 был клонирован в сайты рестрикции EcoRI и EcoRV входного вектора Gateway pENTR 2B (Invitrogen).Набор Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen) использовали для вставки кодирующей последовательности TbWee1 в целевой вектор pDEST17 (Invitrogen) для создания рекомбинантного белка с N-концевой гистидиновой меткой. Мутации, индуцированные ПЦР, удаляли путем секвенирования (Macrogen Inc., Сеул, Корея). Клетки Escherichia coli BL-21 (DE3) pLysS, содержащие полную конструкцию pDEST17-TbWee1, выращивали в среде Луриа-Бертани при 37°C до OD при 600 нм (OD 600 ), равной 0.6. Экспрессию гена TbWee1 индуцировали добавлением 0,8 мМ изопропил-δ-тиогалактозида (ИПТГ) и далее культуру выращивали в течение 4 ч при 37°С. Рекомбинантный белок получали из телец включения следующим образом: клетки собирали, ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ буфера Tris-HCl, pH 8,0 и 20 мМ NaCl, и дважды обрабатывали ультразвуком в течение 30 с (Heat Systems Ultrasonics, Inc.), а затем 1 мин отдыха между циклами при 4°С между циклами. Затем клеточный экстракт подвергали семи циклам замораживания и оттаивания и центрифугировали при 14000x g в течение 30 мин при 4°C.Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl-буфера, рН 8,0, 20 мМ NaCl и 8 М мочевины, обрабатывали ультразвуком четыре раза (4 импульса по 30 с) с последующим 1-минутным отдыхом между циклами при 4°C и центрифугировали при 14000x. г в течение 30 мин при 10°С. Полученный супернатант наносили на никель-аффинную хроматографию (Ni-NTA-агароза) (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд, США). Фракционирование белков проводили в соответствии с инструкциями производителя. Фракции, содержащие слитый белок TbWee1, контролировали с помощью SDS-PAGE, объединяли, дважды подвергали диализу против 20 мМ Tris-HCl, pH 7.8, 200 мМ ЭДТА в течение 2 ч и один раз в течение ночи в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,8. Очищенный рекомбинантный белок использовали в качестве антигена для получения антител у мышей.

    Генерация и индукция клеточных линий РНКи

    Праймеры для амплификации целевого фрагмента РНКи были разработаны с использованием программного инструмента RNAit (http://trypanofan.path.cam.ac.uk/software/RNAit.html). Фрагменты-мишени РНКи амплифицировали методом ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes, Espoo, Финляндия). Фрагмент 527 п.н. TbWee1 амплифицировали из геномной ДНК проциклической формы Т.brucei с использованием праймеров 5′-GGACTAGTCAAGGAGGTGAAGGAGCTT-3′ (сайт SpeI подчеркнут) и 5′-CCCTCGAGCACTGAACAAGTTCCCGGTT-3′ (сайт XhoI подчеркнут). Продукты ПЦР очищали и клонировали в вектор p2T7 Ti -177 [38]. Клетки штамма 29-13 трансфицировали электропорацией следующим образом. Вкратце, 10 8 клеток собирали, дважды промывали буфером Cytomix (120 мМ KCl; 0,15 мМ CaCl 2 ; 10 мМ K 2 HPO 4 ; 25 мМ Hepes; 2 мМ EGTA; 90 мМ 774Cl). 2 , 2 мМ АТФ, 5 мМ глутатиона, pH доведен до 7.6 с KOH) и суспендировали в 0,45 мл буфера Cytomix, содержащего 10 мкг линеаризованных конструкций NotI. Электропорацию проводили с использованием электропоратора Bio-Rad с пиковым разрядом при 1,6 кВ и емкостью 25 мкФ. Трансфицированные клетки немедленно переносили в 10 мл SDM-79 с добавлением G418 и гигромицина. Трансфектанты отбирали при 2,5 мкг/мл флеомицина, при этом отдельные клетки клонировали с помощью предельных разведений, получая независимые клеточные линии Wee1 RNAi. Полученные таким образом стабильные трансфектанты затем индуцировали с помощью 2.5 мкг/мл тетрациклина для включения промотора Т7, чтобы инициировать РНКи TbWee1. Клетки в присутствии (+Tet) или в отсутствие (-Tet) тетрациклина подсчитывали ежедневно и кривые кумулятивного роста для каждого клона строили в логарифмическом масштабе.

    Нозерн-блоттинг

    Тотальную РНК получали из T. brucei с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя и нозерн-блоттинга, как описано ранее [39]. Зонды для TbWee1 представляли собой полноразмерные открытые рамки считывания (ORF).Зонды были помечены радиоактивным изотопом [α- 32 P] dCTP (10 9 имп/мин/моль -1 , NEN) с использованием системы мечения Prime-a-Gene (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Количественную оценку проводили с использованием Storm 820 Phosphorimager (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) и программного обеспечения ImageQuant. Для измерения нагрузки использовали рибосомную РНК.

    Проточный цитометрический анализ клеточных линий РНКи

    Образцы клеток для проточного цитометрического анализа готовили следующим образом. Вкратце, 10 6 клеток, собранных в разное время центрифугированием при 600 g в течение 10 мин, дважды промывали холодным PBS плюс 2 мМ ЭДТА.Осадки клеток ресуспендировали в 200 мкл PBS плюс 2 мМ ЭДТА и фиксировали, добавляя по каплям 1,5 мл 70% этанола в PBS при встряхивании. Образцы хранили при 4°С в течение ночи. Фиксированные клетки промывали PBS, а затем суспендировали в 1 мл PBS, содержащего РНКазу А (10 мг/мл) и иодид пропидия (PI) (20 мг/мл). Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем анализировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Процент клеток на разных фазах клеточного цикла оценивали с помощью программного обеспечения ModFitLT (Becton Dickinson).

    Анализ конфигураций ядер и кинетопластов

    Клетки T. brucei собирали, трижды промывали PBS и фиксировали на предметных стеклах холодным метанолом при -20°C в течение 20 мин. Предметные стекла промывали PBS в присутствии 1 мкг/мл DAPI. Затем клетки исследовали с помощью фазово-контрастного и флуоресцентного микроскопа Olympus для подсчета количества ядер и кинетопластов в отдельных клетках в популяциях, состоящих более чем из 200 клеток в каждом образце.

    Индуцированная гидроксимочевиной синхронизация клеточного цикла

    T. brucei

    Синхронизация проциклических форм T. brucei в S-фазе с использованием гидроксимочевины (HU) была достигнута, в основном, как описано в Chowdhury et al. [40]. Вкратце, 10 мл культуры (2,5×10 6 клеток/мл) инкубировали в среде, содержащей 0,2 мМ HU, в течение 12 часов. Затем ГУ удаляли центрифугированием (1200 g, 10 мин) и дважды промывали клетки средой при комнатной температуре.После отмывания HU клетки продолжали культивировать в течение 12 часов. Чтобы оценить синхронность, мы фиксировали клетки каждые 2 часа, окрашивали их йодидом пропидия и проводили проточную цитометрию, как описано в разделе 2.6. Белок TbWee1 выявляли на разных стадиях клеточного цикла методом Вестерн-блоттинга с использованием антисыворотки против TbWee1 (1:1000).

    Сверхэкспрессия TbWee1 в

    Schizosaccharomyces pombe

    Ген TbWee1 был экспрессирован в штамме S. pombe FY7283 ( ∆Wee1 : h , уе1::ура4 + , leu1-32, ura4-D18 , любезно предоставлено ЯГРК) (http://yeast.lab.nig.ac.jp/nig). Кодирующую последовательность TbWee1 амплифицировали с использованием праймеров 5’-CCGCTCGAGATGTTGGCGCCTAAAGGGG-3’ и 5’-CGCGTCGACCTAAAATTTTGCACTATC-3’ . Продукт ПЦР лигировали в сайты XhoI и SalI pREP3X [41] и экспрессировали под контролем сильного промотора nmt1 , репрессируемого тиамином [42]. Компетентные клетки S. pombe подвергали электропорации с pREP3X-SpWee1 (Wee1 из S. pombe ), pREP3X-TbWee1 (Wee1 из T.brucei ) или только pREP3X. Трансформанты отбирали на минимальной среде [43] с добавлением 70 мг/л урацила и 70 мг/л аденина плюс 10 мкМ тиамина. Экспрессию индуцировали в течение 4 дней при 28°С путем выращивания дрожжевых клеток в минимальной среде в отсутствие тиамина или подавляли добавлением 10 мкМ тиамина. Изображения были получены с использованием светового и флуоресцентного микроскопа Olympus BX41 с цифровой камерой Olympus DP71 и программным обеспечением для захвата (Olympus America, Inc., Center Valley, PA, USA).Длину клеток измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Эксперименты были повторены с использованием нескольких независимых трансформантов, и все они дали сходные результаты. Для окрашивания DAPI 1 мл экспоненциально растущих клеток S. pombe центрифугировали, фиксировали в 100% метаноле и инкубировали в течение 1 часа при -20°С. Клетки концентрировали до 30 мкл метанола, каплю 5 мкл подсушивали в стеклянной крышке 5 мин при комнатной температуре и инкубировали с 0,5 мкг/мл DAPI (Molecular Probes).

    Анализы фосфорилирования рекомбинантного белка TbWee1, экспрессированного в бакуловирусной системе

    Полноразмерный TbWee1, слитый с N-концевой гексагистидиновой меткой, экспрессированный в бакуловирусе, полученный с использованием экспрессионной системы Bac-to-Bac® (Invitrogen). Кодирующую область TbWee1 амплифицировали, как описано в разделе 2.1, и плазмиду для переноса получали с использованием pFastBac TM (Invitrogen). Клетки насекомых Spodoptera frugiperda Sf-9 размножали в среде Грейса (Gibco) при 27°C и инфицировали при множественности заражения (MOI), равной 1.Рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с никелем (Ni-NTA агароза) (Qiagen) в соответствии с процедурами производителя. Полученный таким образом рекомбинантный белок rTbWee1 обнаруживали как с помощью антител TbWee1, так и с полигистидиновыми антителами, и использовали для анализа фосфорилирования. Эти анализы проводились с 40 мкг rTbwee1 либо с 0,2 мг/мл поли-(glu:tyr) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), общим субстратом для тирозинпротеинкиназы, и анализировались на фосфоцеллюлозной бумаге P81. [44], или с 0.5 мг мл -1 гистона h2, как сообщалось ранее [39]. Последние реакции останавливали 5-кратным буфером Лэммли, анализировали в 12% SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Amersham Hybond-ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) в соответствии с инструкциями производителя. Мембраны подвергали воздействию пленок X-Omat Kodak (Sigma-Aldrich) или сигнал сканировали с помощью Storm 820 Phosphorimager (Amersham) [39]. Альтернативно, блотированные мембраны анализировали с антителами против фосфотирозина (1:1000) (Transduction Laboratories, Лексингтон, Кентукки, США) и с антителами против полигистидина (1:5000) (Sigma-Aldrich).Автофосфорилирование rTbWee1 определяли по методу Ferrell и Martin [45], как описано ранее [44] (данные не представлены).

    Результаты

    Идентификация гомолога Wee1 в геномной базе данных трипаносом

    Систематический поиск потенциального гомолога гена Wee1 в T. brucei был выполнен с использованием описанных последовательностей человека и делящихся дрожжей Wee1 Единственный гомологичный ген этой киназы был обнаружен в хромосоме 4 T. brucei .ORF, соответствующая этому предполагаемому гомологу киназы T. brucei Wee1, была обозначена как TbWee1 и зарегистрирована под инвентарным номером GenBank. {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JN083854″,»term_id»:»386832695″,»term_text»:»JN083854″}}JN083854. Идентификация только одной последовательности с помощью BLAST указывает на то, что TbWee1 является однокопийным геном. Этот предполагаемый киназоподобный гомолог TbWee1 кодируется ORF длиной 1812 п.н. и состоит из 603 аминокислот с предполагаемой молекулярной массой 66.22 кДа и расчетной изоэлектрической точкой 6,57.

    Выравнивание каталитического домена TbWee1 с ортологической последовательностью из нескольких организмов показано на рис. Поиск в базе данных генома Trypanosoma cruzi показал, что у этой трипаносоматиды присутствуют два предполагаемых гомолога Wee1. Эти гены были названы TcWee90 (инвентарный номер GenBank {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JN573306″,»term_id»:»386832703″,»term_text»:»JN573306″. «}}JN573306) и TcWee570 (инвентарный номер GenBank.{«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JN257712″,»term_id»:»386832701″,»term_text»:»JN257712″}}JN257712) и доля от 67 % до 25 % идентичность последовательности с TbWee1 соответственно (). Низкий уровень гомологии последовательностей между TbWee1 и TcWee570 позволяет предположить, что они могли происходить из разных подсемейств. Процент идентичности между TbWee1 и другими киназами Wee1 колеблется от 23 до 29% (10). Все заявленные идентичности аминокислот основаны на оценках BlastP. Помимо каталитической области, между TbWee1 и другими протеинкиназами было мало гомологии.Это согласуется с фактом отсутствия очевидной гомологии последовательностей между N-концевыми доменами Wee1-подобных белков, выделенных из различных видов.

    Сравнение последовательностей белков TbWee1 и гомологов у других видов.

    (A) Множественное выравнивание последовательностей каталитических доменов предполагаемого белка Trypanosoma brucei Wee1 с другими Wee1-подобными киназами. Аминокислотные последовательности выравнивали с помощью программы ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw).Идентичности обозначены звездочками под последовательностью. Консервативные замены отмечены двумя вертикальными точками, а полуконсервативные замены отмечены одной точкой. Штрихи обозначают пробелы, введенные для оптимального выравнивания. 11 консервативных субдоменов обозначены римскими цифрами [45,46]. Каталитический и активационный сегменты обозначены соответственно синей и розовой рамкой. Черный ящик указывает на законсервированный мотив EGD. Треугольники обозначают аминокислоты, которые сохраняются во всех известных членах семейства киназ Wee1, но не в других эукариотических протеинкиназах.Показанные последовательности относятся к киназы Wee1A трипаносомы . brucei (TbWee1, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JN083854″,»term_id»:»386832695″,»term_text»:»JN083854″}}JN083854), люди (HsWee1, NP003381.1), мыши (MmWee1, NP033542.2), Schizosaccharomyces pombe (SpWee1, NP587933.1), сахаромицеты cerevisiae (ScSwe1, NP012348.1), Arabidopsis thaliana (AtWee1, NP171796.1), Xenopus laevis (XlWee1, NP001081784.1) и Trypanosoma cruzi (TcWee90, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JN573306″,»term_id»:»386832703″,»term_text»:»JN573306″ }}JN573306; TcWee570, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JN257712″,»term_id»:»386832701″,»term_text»:»JN257712″}}JN257712). (B) Сравнение TbWee1 с другими протеинкиназами. Положение предполагаемого домена протеинкиназы показано черным цветом, а числа представляют процент идентичности аминокислот с этой областью предсказанного TbWee1.

    Описано одиннадцать субдоменов каталитического домена киназы с высокой степенью консервативности [46,47], и все они присутствуют в TbWee1 ().Каталитический домен TbWee1 (остатки 189-483) имеет типичную богатую глицином петлю (GxGxxG, остатки 207-212) и Lys229, которые участвуют в связывании АТФ. Каталитический сегмент (остатки 324-336), который является высококонсервативным, содержит мотив активного сайта HxD и близко соответствует консенсусной последовательности протеинкиназы Wee1 IVHxDLKPxNIx. Этот мотив содержит инвариантные остатки Asp328 и Asn333, участвующие в реакции фосфопереноса. Asp328 предположительно является каталитическим основанием, которое принимает протон от атакующей гидроксильной группы субстрата.Аминокислота Lys330, возможно, нейтрализует отрицательный заряд γ-фосфата и тем самым облегчает фосфоперенос [47]. Активационная петля (остатки 390-418) имеет длину 29 остатков и содержит триплетный мотив Glu407-Gly408-Asp409 (мотив EGD), который встречается исключительно в субдомене VIII семейства протеинкиназ Wee1 [8]. Еще одним диагностическим признаком, обнаруженным у всех членов семейства киназ Wee1, являются консервативные остатки Trp в субдомене IV и Trp и Arg в субдомене X [10]. Эти остатки присутствуют в TbWee1 в консервативных положениях, хотя Trp в субдомене X замещен гидрофобной аминокислотой Phe ().В последовательности TbWee1 не было идентифицировано N-концевого сигнального пептида, трансмембранных доменов или мотивов локализации. Филогенетическая связь между последовательностями, использованными при множественном выравнивании последовательностей, показана на рис. Филогенетический анализ проводили с использованием MEGA версии 5 [48]. Эта филогения, основанная на киназных доменах Wee1, показывает три основные группы: Wee1 животных и растений, Wee1 грибов и трипаносоматид Wee1, что подтверждает существование нового семейства трипаносоматидов Wee1 с уникальными характеристиками.

    Все вместе эти характеристики подтверждают, что TbWee1 является предполагаемой киназой Wee1 у T. brucei .

    Понижающая регуляция экспрессии TbWee1 ингибирует клеточный цикл проциклической формы

    T. brucei

    Чтобы выяснить, влияет ли истощение TbWee1 на пролиферацию клеток, была создана стабильная клеточная линия, индуцируемая тетрациклином РНКи, с использованием части TbWee1 , которая не имеет существенной идентичности последовательности с другими геномными последовательностями T.brucei , клонируется в вектор p2T7 Ti -177. Влияние РНКи на экспрессию гена Wee1 исследовали с помощью Нозерн-блоттинга. Уровень мРНК Wee1 снижался на 80 % через 3 дня индукции РНКи (вставка). Экспрессию TbWee1 исследовали с помощью вестерн-блоттинга, и наши результаты показывают, что содержание белка в индуцированных клетках (+Tet) было снижено (правая панель).

    Влияние нокдауна TbWee1 на проциклическую форму клеток T. brucei .

    (A) Клетки штамма 29-13, несущие конструкцию TbWee1-RNAi, инкубировали в культуральной среде с (+ Tet) или без (-Tet) 2.5 мкг/мл тетрациклина при 28°С. Ежедневно контролировали скорость роста клеток и количество клеток наносили на график в логарифмической шкале. На вставках показан уровень внутриклеточной мРНК через 3 дня после введения РНК-интерференции по данным нозерн-блоттинга. RNAr использовали в качестве контроля загрузки. Вестерн-блоттинг экстрактов индуцированных и неиндуцированных клеток анализировали с использованием антитела против TbWee1 (правая вставка). (B) Динамика проциклической формы T. brucei , индуцированной РНКи. Клетки окрашивали йодидом пропидия и подвергали анализу FACS для измерения содержания ДНК.Процентное содержание клеток в фазах G1, S и G2/M определяли с помощью программного обеспечения ModFitLT и наносили на правую панель.

    Чтобы исследовать влияние TbWee1 на рост клеток, TbWee1-дефицитные паразиты (в качестве контроля) подсчитывали ежедневно в течение 8-дневного инкубационного периода (). В качестве контроля использовали неиндуцированные культуры. Поскольку каждый независимый клон давал по существу один и тот же фенотип, показаны данные только для одного клона. Рост клеток явно ингибировался через 4 дня после индукции, а через 8 дней после трансфекции жизнеспособность клеток снижалась в 4 раза при молчании Wee1 по сравнению с неиндуцированными РНКи клеточными линиями.Жизнеспособность клеток, истощенных по TbWee1, ингибировалась более чем на 77 % при подавлении Wee1. Значительное ингибирование роста клеток предполагает, что TbWee1 может играть существенную роль в проциклической форме T. brucei.

    Истощение TbWee1 изменяет ход клеточного цикла проциклической формы

    T. brucei

    Чтобы оценить влияние потери функции Wee1 на клеточный цикл в разное время, процент клеток на разных фазах клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрии (FACS).Когда экспрессия Wee1 была подавлена ​​в течение 8 дней, FACS-анализ содержания ДНК в культуре T. brucei показал снижение на 10% в клетках G2/M-фазы. Это сопровождалось лишь небольшими изменениями в популяции G1-фазы, тогда как клетки S-фазы оставались относительно неизменными (1). Появление пика суб-G1 (от ~ 2 до 18 %) было очевидным в индуцированных тетрациклином клетках по сравнению с неиндуцированными.

    Динамику влияния истощения TbWee1 на клеточное деление и сегрегацию кинетопластов отслеживали с помощью окрашивания DAPI для визуализации ядер и кинетопластов ().Клетки в фазах G1 и S, по-видимому, имели одно ядро ​​и один кинетопласт (1N1K). Поскольку деление К предшествует делению ядра, клетки в фазе G2/M имеют одно ядро ​​и два кинетопласта (1N2K), а клетки, подвергающиеся цитокинезу, имеют два ядра и два кинетопласта (2N2K). В контрольной неиндуцированной культуре Wee1 82% клеток имели одиночное ядро ​​нормального размера и один кинетопласт (1N1K), в то время как остальные клетки (18%) были в основном либо 1N2K, либо 2N2K (). После 6 дней индукции РНКи популяция 1N1K значительно уменьшилась с 82 до 70%, тогда как популяции 1N2K и 2N2K не показали явных изменений.Однако средний размер каждого отдельного ядра в клетках 1N2K оказался значительно увеличенным. Эти клетки были названы 1N*2K, чтобы их можно было отличить от обычных 1N2K (). Популяция энуклеированных клеток (зоидов), каждая из которых содержит один кинетопласт (0N1K), увеличилась с 0% до 7% популяции, в то время как 1N0K клеток увеличилась примерно с 3 до 10% (). Появление делящихся клеток 1N*2K, показывающих образование аномальных клеток 1N1K и 0N1K, дополнительно подтверждает дефект митоза в Wee1-истощенных клетках.

    Морфологические фенотипы Wee1-дефицитных клеток T. brucei проциклической формы.

    Образцы TbWee1-истощенных клеток, взятые в разное время, окрашивали DAPI и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. (A) Анализ количества ядер и кинетопластов, определенных окрашиванием DAPI. Данные представлены в виде средних процентов ± стандартная ошибка. общей подсчитанной популяции (> 200 клеток в каждом из трех независимых экспериментов). (B) Wee1-дефицитные клетки, просмотренные с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии.N: ядро, K: кинетопласт.

    РНКи TbWee1 приводила к увеличению доли клеток с содержанием ДНК <1C (пик subG1). Это согласуется с наблюдаемым кариотипом клеток, показывающим увеличение количества зоидов и клеток с 1N0K. Это могут быть дочерние клетки, полученные в результате деления клеток 1N*2K с образованием клеток 1N1K и зоидов. Это наблюдение предполагает, что цитокинез может управляться сегрегацией кинетопластов без митоза.

    TbWee1 может спасти

    S.pombe Мутанты ΔWee1

    Ген Wee1 первоначально был идентифицирован как генетический элемент, контролирующий размер, при котором клетки S. pombe вступают в митоз [6]. Потеря активности Wee1 заставляет клетки вступать в митоз до того, как произойдет достаточный рост. Следовательно, в результате цитокинеза образуются две дочерние клетки аномально укороченной длины (фенотип ΔWee1). Наоборот, увеличение дозы гена Wee1 вызывает задержку вступления в митоз и увеличение длины клетки. Это указывает на то, что уровни активности Wee1 определяют время вступления в митоз и оказывают сильное влияние на размер клеток [7].

    Чтобы выяснить, принадлежит ли TbWee1 к семейству киназ Wee1, мы затем попытались спасти дефект роста штамма S. pombe , в котором отсутствует wee1 ( ∆Wee1 ). Ген TbWee1 экспрессировали в делящихся дрожжах под контролем тиамин-репрессируемого промотора nmt1 с использованием вектора pREP3X [49].

    У мутантов ∆Wee1 , экспрессирующих TbWee1, наблюдалась остановка клеточного цикла, проявляющаяся увеличением длины клеток после вымывания репрессии тиамином из клеточной культуры.Тот же самый фенотип наблюдался, когда Wee1 из S. pombe сверхэкспрессировался в тех же клетках (4). Этот длинноклеточный фенотип не наблюдался, когда экспрессия Spwee1 или TbWee1 подавлялась тиамином или когда клетки ΔWee1 трансформировали пустым вектором (10). Более того, избыточная экспрессия TbWee1 вызывала удлинение клеток S. pombe и достижение размера, даже большего, чем у клеток дикого типа, что указывает на то, что эффект TbWee1 на рост клеток ∆Wee1 является дозозависимым ().

    Спасение мутанта Schyzosaccharomyces pombe Wee1 с помощью TbWee1.

    (A) Мутанты S. pombe ∆Wee1 трансформировали вектором pREP3x или pREP3x, в котором был клонирован S. pombe Wee1 или TbWee1. Делящиеся дрожжи культивировали на твердых средах в присутствии (+тиа) или в отсутствие (-тиа) 15 мкМ тиамина. Нижняя панель: клетки S. pombe , экспрессирующие Wee1 дикого типа. (B) Окрашивание DAPI клеток S. pombe , трансформированных pREP3x TbWee1, выращенных в отсутствие тиамина.Средний размер клеток у дрожжей S. pombe , дополненных TbWee1, составлял 16,3 мкм, при этом 55% популяции находились в диапазоне 10-15 мкм. Средний размер клеток контрольных дрожжей S. pombe составлял 10,4 мкм, при этом 57% популяции находились в диапазоне 5-10 мкм. п=100. Бар = 100 мкм.

    Для проверки того, что фенотип длинных клеток, индуцированный гиперэкспрессией TbWee1, не был обусловлен псевдогифальным ростом (фенотип, характеризующийся отсутствием разделения дочерних клеток после митоза и септации [50]), положением и количеством ядер на S .pombe исследовали с помощью окрашивания DAPI. В клетках ΔWee1, экспрессирующих TbWee1, было обнаружено только одно ядро ​​и не было перегородки, что указывает на то, что увеличение длины клеток не связано с псевдогифальным ростом, и подтверждает способность TbWee1 спасать мутантный фенотип ΔWee1 .

    Эти данные показывают, что TbWee1 проявляет функциональные свойства, характерные для киназ Wee1, и может выполнять роль, сходную с ролью делящихся дрожжей Wee1. Это подтверждает идею о том, что TbWee1 может быть трипаносомным функциональным гомологом киназы Wee1.

    Активность аутофосфорилирования TbWee1

    Известно, что многие протеинкиназы подвергаются аутофосфорилированию. Чтобы проверить, относится ли это к TbWee1, очищенный рекомбинантный слитый белок TbWee1-6xHis, полученный из бакуловирусной системы, инкубировали с [γ- 32 P] АТФ в присутствии Mg 2+ и Mn 2+ . Анализ с помощью SDS-PAGE/авторадиографии выявил наличие меченой полосы с той же молекулярной массой (~ 70 кДа), что и слитый белок (1).Хотя очищенный рекомбинантный слитый белок TbWee1-6xHis был способен аутофосфорилировать in vitro , не было заметной киназной активности, когда неспецифические субстраты, такие как гистоны (h2 и смесь гистона HII) или синтетический пептид поли-(глу- tyr) (Sigma-Aldrich), общий субстрат для тирозинкиназы. Вестерн-блоттинг с использованием антигистидинового антитела подтвердил, что меченая полоса представляла собой TbWee1 (). Кроме того, аутофосфорилированный TbWee1 распознавался антителом против фосфотирозина, что указывает на то, что некоторые или все фосфорилирования происходили по остаткам тирозина.

    Аутофосфорилирование рекомбинантного слитого белка TbWee1-6xHis.

    Реакции фосфорилирования проводили в отсутствие или в присутствии 40 мкг rTbWee1-6xHis, экспрессированного в бакуловирусной системе, в смеси, содержащей 5 мкКи [γ-32P]-АТФ (6000 Ки/ммоль, NEN) в течение 10 мин при 30 °С. Продукты реакции разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и визуализировали с помощью авторадиографии. Мембраны выявляли антителами против гистидиновой метки (1:5000) и антителами против фосфотирозина (1:1000).

    Обнаружение нативного белка TbWee1 в экстрактах паразита

    Паттерн экспрессии белка TbWee1 изучали на проциклической и кровеносной стадиях жизненного цикла паразита с использованием антител, полученных против рекомбинантного белка TbWee1.В белковых экстрактах из IPTG-индуцированных культур E. coli (верхняя и нижняя панели) с помощью окрашивания кумасси синим и вестерн-блоттинга с антигистидиновым антителом была обнаружена сильная полоса ~70 кДа. Рекомбинантный слитый белок был обнаружен только в нерастворимой фракции (IF), поэтому ферментативная активность TbWee1 не могла быть определена. Очищенный слитый белок TbWee1-6xHis (E2, ) использовали для получения поликлональных антител против TbWee1 у мышей.

    Амплификация и очистка слитого белка TbWee1-6xHis для получения поликлональных антител против TbWee1.

    (A) SDS-PAGE анализ лизатов, полученных из Escherichia coli IPTG-индуцированных (I) и неиндуцированных (NI) клеточных культур, трансформированных pDEST17-TbWee1. Верхняя панель: окрашивание кумасси бриллиантовым синим. Нижняя панель: вестерн-блоттинг с антителом против гистидиновой метки (1:5000). Стрелка указывает положение рекомбинантного белка ~70 кДа. (B) Стадии очистки слитого белка rTbwee1-6xHis контролировали с помощью анализа 12% SDS-PAGE. Лизат наносили на колонку с ниагарозой.Поток (F), промывки (W, 1–3) и элюированные фракции (250 мМ имидазол, E 1–3) анализировали с помощью 12% SDS-PAGE, окрашенного кумасси бриллиантовым синим. (C) Вестерн-блот-анализ экспрессии rTbWee1 с поликлональным антителом против TbWee1. Белковые экстракты формы кровотока T. brucei (дорожка 1), проциклической формы T. brucei (дорожка 2) и рекомбинантного TbWee1-6xHis (дорожка 3) разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и подвергали электроблотингу на нитроцеллюлозе. мембрана. Блоты инкубировали с поликлональными антителами против TbWee1 (1:1000) и выявляли с помощью хемилюминесценции.

    Антисыворотка против TbWee1 распознала белок ~70 кДа в общих клеточных экстрактах проциклической формы и формы кровотока (), подтверждая, что белок Wee1 присутствует на обеих стадиях жизненного цикла паразита.

    Белок TbWee1 обнаруживается только на стадии G2/M клеточного цикла

    Чтобы выяснить, колеблются ли уровни белка TbWee1 в течение клеточного цикла, была изучена картина экспрессии белка TbWee1 на всех стадиях клеточного цикла паразита. Т.brucei проциклические формы были синхронизированы с HU по новой методике Chowdhury et al [40]. Синхронность достигалась за счет индуцированного HU истощения пула dNTP, что приводило к временному накоплению клеток при переходе от G1 к S. После удаления HU клетки претерпевали короткий лаг-период, а затем синхронно продвигались по клеточному циклу. В разное время после освобождения от блокировки клеточного цикла клетки собирали и анализировали с помощью FACS и иммуноблота. Анализ содержания ДНК показал, что клетки синхронно проходят разные фазы клеточного цикла (1).Иммуноблот-анализ с поликлональным антителом против TbWee1 показал, что сигнал TbWee1 присутствовал в небольших количествах на стадии G2/M () и не мог быть обнаружен в фазах G1 или S. Всего было необходимо 40 мкг белкового экстракта для обнаружения очень низких уровней TbWee1 на стадии G2/M (), поэтому белок TbWee1 циклически, но даже на фазе G2/M его содержание невелико.

    Синхронизация проциклического T. brucei и анализ экспрессии белка TbWee1 на разных стадиях клеточного цикла.

    (A) Ячейки были синхронизированы с 0.2 мМ гидроксимочевины в течение 12 ч, затем отмывали HU, окрашивали клетки йодидом пропидия и анализировали в течение 12 ч с помощью проточной цитометрии, проводимой каждые 2 ч. (B) Процентное содержание клеток в фазах G1, S и G2/M определяли с помощью программного обеспечения ModFitLT. (C) Белковые экстракты из S, G2/M и G1 разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и подвергали электроблотингу на нитроцеллюлозных мембранах. Рекомбинантный TbWee1 с меткой His (10 мкг) использовали в качестве положительного контроля. Блоты инкубировали с поликлональным антителом против TbWee1 (1:1000) (дорожки 1, 3, 5: 20 мкг; дорожки 2, 4, 6: 40 мкг).В качестве контроля нагрузки использовали антитело, распознающее β-тубулин (1:5000).

    Обсуждение

    Хотя был достигнут значительный прогресс в идентификации молекулярных регуляторов клеточного цикла T. brucei , многие регуляторы, несомненно, еще предстоит идентифицировать. Ортологи многих консервативных протеинкиназ, таких как CDKs, митоген-активируемые протеинкиназы (MAPKs), Aurora и Polo-подобные киназы, присутствуют в T. brucei , хотя их функции часто расходятся [51].Хотя фосфорилирование белковых остатков тирозина регулирует важные клеточные функции у высших эукариот, роль этой посттрансляционной модификации в значительной степени неизвестна для T. brucei [34,35]. В киноме трипаносоматид не было обнаружено связанных с рецептором тирозинкиназ, и фосфорилирование тирозина, вероятно, осуществляется протеинкиназами двойной специфичности [34,36]. Сообщалось, что гомологи киназы Wee1 присутствуют в трипаносоматидах, но не гомологи Myt1 (родственный член киназ семейства Wee), CDC25, Tome1 (лигаза SCF типа E3, которая нацелена на Wee1 для деградации в начале митоза). ) и обнаружены белки-ингибиторы CDK [36].Это говорит о том, что для регуляции активности CRKs у трипаносоматидов развились другие механизмы.

    Целью этого исследования было идентифицировать гомолог киназы Wee1 в T. brucei . Сосредоточив внимание на нескольких ключевых вопросах, связанных со структурой и функцией семейства Wee1, поиск в базе данных TriTryp выявил гомолог, который мы назвали TbWee1, с киназным доменом, сходным с доменом гомологов Wee1 из других эукариот. Кодирующая последовательность TbWee1 содержит консервативные остатки, общие для всех киназ, а также сигнатурный мотив «EGD», ранее отмеченный для семейства киназ Wee1 [8,52].Хотя Wee1 была функционально охарактеризована как тирозинкиназа, ее первичная аминокислотная последовательность наиболее близко напоминает серин/треонинкиназы, такие как Chk1 и цАМФ-зависимые киназы, по структуре и первичной аминокислотной последовательности [14].

    При попарном сравнении TbWee1 более тесно связан с трипаносомой Wee1, чем с последовательностями животных, дрожжей или растений. Все эти Wee1-подобные киназы имеют сходную структуру с С-концевым киназным доменом и менее консервативным N-концевым доменом. Белковые последовательности больших N-концевых доменов гомологов Wee1 из S.pombe , почкующиеся дрожжи S. cerevisiae , плодовые мушки Drosophila melanogaster , Xenopus и люди сильно различаются [7–10,16]. Считается, что эти некаталитические области белка играют важную роль в регуляции, белок-белковых взаимодействиях и субклеточной локализации киназ Wee1 [53-57].

    В этом отчете мы показываем, что TbWee1 проявляет функциональные свойства, характерные для киназ Wee1. Ген Wee1 первоначально был идентифицирован как генетический элемент, контролирующий время вступления в митоз и размер, при котором S.Pombe вступает в эту стадию клеточного цикла [6]. Потеря активности Wee1 заставляет клетки вступать в митоз до того, как произойдет достаточный рост, продуцируя две дочерние клетки аномально маленького размера (фенотип Wee1). Наоборот, увеличение дозы гена Wee1 вызывает задержку вступления в митоз и увеличение размера клетки [7]. Нам удалось комплементировать мутант Wee1 S. pombe : дрожжи, экспрессирующие TbWee1, показали увеличение длины по сравнению с контрольными пустыми векторами. Примечательно, что эти длинноклеточные фенотипы также были получены, когда гомологи человека, дрозофилы и кукурузы сверхэкспрессировались в S.pombe и указывают на остановку G2 [9,58]. Хотя ген Wee1 Arabidopsis и томата ( Solanum lycopersicum ) неспособен комплементировать мутации в их гомологе дрожжей, их сверхэкспрессия ингибирует деление клеток у делящихся дрожжей [13,59]. Хотя результаты экспериментов по комплементации у дрожжей не являются недвусмысленным доказательством того, что TbWee1 имеет те же функции в T. brucei , что и Wee1 в дрожжах, они представляют собой первое указание на клеточную функцию протеинкиназы Wee1 в трипаносомах.

    Во-вторых, мы исследовали, ведет ли себя активность TbWee1 как родственные киназы Wee1 других эукариот, используя небольшое количество белка rTbWee1, полученного из бакуловируса. Было показано, что аутофосфорилирование регулирует многие протеинкиназы [60]. Все гомологи Wee1 имеют остатки тирозина в амино-концевой области, и, как сообщается, большинство гомологов Wee1 подвергаются аутофосфорилированию [7-10,12,16,61-64]. Белок TbWee1-His был способен к аутофосфорилированию, так как та же самая полоса, которая распознается анти-His-меткой и анти-фосфотирозиновыми антителами, была помечена при инкубации с [γ- 32 P] АТФ.Эта модификация может изменить активность протеинкиназы во всей клетке. Однако протеинкиназная активность этого белка не определялась. Это может быть связано с тем, что это семейство протеинкиназ имеет очень специфические требования к субстрату [65].

    Функциональный анализ клеточного цикла показывает, что Wee1 является ключевым игроком, который служит митотическим ингибитором в сложной сети киназ и фосфатаз, которые регулируют прогрессию G2 [16,66]. Антитела против TbWee1 показали, что эта протеинкиназа присутствует в пролиферативных проциклических и тонких формах паразитов, циркулирующих в кровотоке.Используя синхронизированные клетки TbWee1, мы показали, что экспрессия белка Wee1 регулируется клеточным циклом с накоплением белка в фазе G2/M. Эти данные полностью согласуются с другими сообщениями, в которых наблюдали за экспрессией белка Wee1 во время клеточного цикла. У S. pombe Wee1+ транскрипты не флуктуируют в течение клеточного цикла, тогда как белок Wee1 испытывает умеренные колебания, находясь в S- и G2-фазах [52]. Кроме того, эксперименты, следящие за поведением эндогенного S.cerevisiae Swe1 пришли к выводу, что Swe1 стабилен во время G2/M и не деградирует до выхода из митоза [67,68]. Тот факт, что экспрессия TbWee1 так сильно связана с фазой G2/M трипаносом, а TbWee1 экспрессируется в пролиферативных проциклических и тонких формах кровотока, также хорошо согласуется с возможной ролью этой протеинкиназы в клеточном делении в G2/M.

    В этом исследовании мы показали, что истощение TbWee1 из проциклической формы T. brucei вызывает дефект роста, приводящий к обогащению клеток суб-G1-фазы и снижению процентного содержания G2/M-фазы, что коррелировало с увеличением количества тонких зоидов (0N1K) и аномальных (1N0K) клеток и уменьшением количества клеток 1N1K.Это можно объяснить тем, что цитокинез был преждевременно инициирован после истощения TbWee1, что приводило к тому, что делящаяся клетка 1N2K давала аномальные дочерние клетки до того, как у нее появился шанс пройти через митоз. Это может объяснить отсутствие накопления клеток 1N2K с небольшим уменьшением количества клеток 2N2K и увеличением количества аномальных клеток при истощении TbWee1.

    Интересно, что нокдаун Wee1 с помощью siRNA снижает жизнеспособность клеток рака молочной железы, но не нормальных эпителиальных клеток молочной железы [69].Ингибирование Wee1 в раковых клетках приводило к накоплению повреждений ДНК, изменению регуляции клеточного цикла с остановкой S-фазы клеточного цикла, увеличению содержания суб-G1 ДНК и индукции апоптоза [69]. Было показано, что клетки с интактной блокировкой G1-checkpoint, такие как нормальные клетки или раковые клетки с интактной передачей сигналов p53, менее зависимы от ареста G2-checkpoint и, следовательно, не так чувствительны к ингибированию Wee1 [70]. Кроме того, растения, лишенные функционального Wee1, неотличимы от растений дикого типа при выращивании в нестрессовых условиях, но чрезвычайно чувствительны к химическим веществам, ингибирующим репликацию, демонстрируя фенотип ингибирования роста корней [71].Т.о., хотя Wee1 может не выполнять функцию регулятора клеточного цикла в нестрессовых условиях, его киназная активность, по-видимому, важна при репликационном стрессе [72].

    Таким образом, мы впервые показали у трипаносоматид присутствие белка, принадлежащего к семейству киназ Wee1. Мы продемонстрировали, что фермент паразита может восстанавливать фенотип wee мутантов S. pombe и что он проявляет активность аутофосфорилирования тирозина. Хотя в условиях, использованных в этом эксперименте, подавление TbWee1 не приводило к сильному фенотипу, оно приводило к более медленному росту популяции и появлению популяции subG1.

    Несмотря на то, что специфическую функцию TbWee1 еще предстоит определить, мы установили присутствие этой протеинкиназы на разных стадиях паразитов и в фазе G2/M клеточного цикла. Будущие исследования будут сосредоточены не только на идентификации субстратов TbWee1, но и на его специфической локализации, и в настоящее время мы занимаемся этой задачей.

    Благодарности

    Авторы выражают благодарность доктору Джереми К. Моттраму (Welcome Trust Center for Molecular Parasitology и Institute of Infection, Immunity and Inflammation, University of Glasgow) и Dr.Sergio Schenkman (Федеральный университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия) за рекомендации по культивированию линий клеток T. brucei PCF и BSF. Мы благодарим доктора Риту Уллоа за критическое прочтение этой рукописи, доктора Мариану Потенца за совет и доктора Веронику Джанмарию за помощь в экспериментах по фосфорилированию. Примечание. Данные о последовательности протеинкиназы Trypanosoma brucei TbWee1 и протеинкиназы Trypanosoma cruzi TcWee90 и TcWee570 доступны в банке данных GenBank™/EBI под номерами доступа JN083854, JN573306, JN257712 соответственно.

    Заявление о финансировании

    Эта работа финансировалась Национальным советом научных исследований и технологий (CONICET) и Национальным агентством содействия научным исследованиям и технологиям (ANPCyT), Аргентина. NYB, FR, VR, SV были стипендиатами, а DG, CD и MTTI — профессиональными исследователями CONICET. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Каталожные номера

    2. Коэн П. (2000) Регуляция функции белка путем многосайтового фосфорилирования — обновление за 25 лет.Тенденции биохимии 25: 596-601. PubMed: 11116185. [PubMed] [Google Scholar]4. Kumagai A, Dunphy WG (1991) Белок cdc25 контролирует дефосфорилирование тирозина белка cdc2 в бесклеточной системе. Клетка 64: 903-914. PubMed: 1825803. [PubMed] [Google Scholar]6. Медсестра П. (1975) Генетический контроль размера клеток при делении клеток у дрожжей. Природа 256: 547-551. PubMed: 1165770. [PubMed] [Google Scholar]7. Russell P, Nurse P (1987)Отрицательная регуляция митоза с помощью wee1+, гена, кодирующего гомолог протеинкиназы.Клетка 49: 559-567. PubMed: 3032459. [PubMed] [Google Scholar]8. Booher RN, Deshaies RJ, Kirschner MW (1993) Свойства Saccharomyces cerevisiae wee1 и его дифференциальная регуляция p34CDC28 в ответ на циклины G1 и G2. ЭМБО J 12: 3417-3426. PubMed: 8253069. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Игараси М., Нагата А., Джинно С., Суто К., Окаяма Х. (1991) Wee1(+)-подобный ген в клетках человека. Природа 353: 80-83. PubMed: 1840647. [PubMed] [Google Scholar] 11. Honda R, Tanaka H, ​​Ohba Y, Yasuda H (1995) Мышиная p87wee1 киназа регулируется специфическим фосфорилированием M-фазы.Хромосомный рез 3: 300-308. PubMed: 7551544. [PubMed] [Google Scholar]12. Campbell SD, Sprenger F, Edgar BA, O’Farrell PH (1995) Drosophila Wee1 kinase спасает делящиеся дрожжи от митотической катастрофы и фосфорилирует Drosophila Cdc2 in vitro. Мол Селл Биол 6: 1333-1347. PubMed: 8573790. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]13. Соррелл Д.А., Марчбэнк А., МакМахон К., Дикинсон Дж. Р., Роджерс Х. Дж. и другие. (2002) Гомолог Wee1 из Arabidopsis талиана . Планта 215: 518-522.PubMed: 12111237. [PubMed] [Google Scholar]14. Squire CJ, Dickson JM, Ivanovic I, Baker EN (2005)Структура и ингибирование киназы контрольной точки клеточного цикла человека, киназа Wee1A: атипичная тирозинкиназа, играющая ключевую роль в регуляции CDK1. Структура 13: 541-550. PubMed: 15837193. [PubMed] [Google Scholar] 17. Charlesworth A, Welk J, MacNicol AM (2000) Временной контроль трансляции мРНК Wee1 во время созревания ооцитов Xenopus регулируется цитоплазматическими элементами полиаденилирования в 3′-нетранслируемой области.Дев Биол 227: 706-719. PubMed: 11071785. [PubMed] [Google Scholar] 18. Michael WM, Newport J (1998)Связь митоза с завершением S-фазы посредством Cdc34-опосредованной деградации Wee1. Наука 282: 1886-1889. PubMed: 9836638. [PubMed] [Google Scholar] 19. Lim HH, Surana U (2003) Tome-1, wee1 и начало митоза: совместное разрушение для своевременного входа. Мол Ячейка 11: 845-846. PubMed: 12718868. [PubMed] [Google Scholar] 20. Vickerman K (1985) Циклы развития и биология патогенных трипаносом.Бр Мед Булл 41: 105-114. PubMed: 3928017. [PubMed] [Google Scholar] 21. Вудворд Р., Галл К. (1990) Время репликации ядерной и кинетопластной ДНК и ранние морфологические события в клеточном цикле Trypanosoma brucei. J Клеточная наука 95: 49-57. PubMed: 21. [PubMed] [Google Scholar]22. Ploubidou A, Robinson DR, Docherty RC, Ogbadoyi EO, Gull K (1999) Доказательства новой контрольной точки клеточного цикла в трипаносомах: сегрегация кинетопластов и цитокинез в отсутствие митоза. J Клеточная наука 112: 4641-4650.PubMed: 10574712. [PubMed] [Google Scholar] 23. Mottram JC, Smith G (1995)Семейство трипаносомных cdc2-родственных протеинкиназ. Ген 162: 147-152. PubMed: 7557404. [PubMed] [Google Scholar]24. McKean PG (2003) Координация клеточного цикла и цитокинеза у Trypanosoma Брюсей . Курр Опин Микробиол 6: 600-607. PubMed: 14662356. [PubMed] [Google Scholar] 25. Hammarton TC, Clark J, Douglas F, Boshart M, Mottram JC (2003) Стадиальные различия в контроле клеточного цикла у Trypanosoma brucei , выявленный с помощью РНК-интерференции митотического циклина.J Биол Хим 278: 22877-22886. PubMed: 12682070. [PubMed] [Google Scholar] 26. Monnerat S, Almeida Costa CI, Forkert AC, Benz C, Hamilton A и другие. (2013) Идентификация и функциональная характеристика CRK12:CYC9, нового комплекса циклин-зависимая киназа (CDK)-циклин в Trypanosoma Брюсей . ПЛОС ОДИН 8: e67327. doi:10.1371/journal.pone.0067327. PubMed: 23805309. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Берриман М., Гедин Э., Герц-Фаулер С., Бландин Г., Рено Х. и другие.(2005)Геном африканской трипаносомы Trypanosoma brucei. Наука 309: 416-422. PubMed: 16020726. [PubMed] [Google Scholar]29. Li Y, Li Z, Wang CC (2003)Дифференцировка Trypanosoma brucei может быть неспецифической и не требует развития клеточного цикла. Мол Микробиол 49: 251-265. PubMed: 12823826. [PubMed] [Google Scholar] 30. Tu X, Wang CC (2004) Участие двух cdc2-родственных киназ (CRK) в Trypanosoma brucei регуляция клеточного цикла и характерные специфические для стадии фенотипы 31-, вызванные истощением CRK3.J Биол Хим 279: 21519-20528. [PubMed] [Google Scholar] 31. Hammarton TC, Engstler M, Mottram JC (2004) The Trypanosoma brucei cyclin, CYC2, необходим для прохождения клеточного цикла через фазу G1 и для поддержания морфологии клеток проциклической формы. J Биол Хим 279: 24757-24764. PubMed: 15039435. [PubMed] [Google Scholar]32. Li Z, Wang CC (2003) PHO80-подобный циклин и циклин B-типа контролируют клеточный цикл проциклической формы Trypanosoma . Брюсей .J Биол Хим 278: 20652-20658. PubMed: 12665514. [PubMed] [Google Scholar]33. Парсонс М., Валентайн М., Дин Дж., Шивен Г.Л., Ледбеттер Дж.А. (1991) Отличительные закономерности фосфорилирования тирозина в течение жизненного цикла Trypanosoma Брюсей . Мол Биохим Паразитол 45: 241–248. PubMed: 1710035. [PubMed] [Google Scholar] 34. Нетт И.Р., Дэвидсон Л., Ламонт Д., Фергюсон М.А. (2009a) Идентификация и специфическая локализация фосфорилированных по тирозину белков у Trypanosoma Брюсей .эукариотическая клетка 8: 617-626. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]35. Нетт И.Р., Мартин Д.М., Миранда-Сааведра Д., Ламонт Д., Барбер Д.Д. и другие. (2009b) Фосфопротеом кровяного русла формы Trypanosoma brucei , возбудитель африканской сонной болезни. Мол клеточная протеомика 8: 1527-1538. PubMed: 19346560. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]36. Parsons M, Worthey EA, Ward PN, Mottram JC (2005) Сравнительный анализ киномов трех патогенных трипаносоматидов: Leishmania майор, Трипаносома бруцеи и трипаносома крузи .Геномика BMC 6: 127 PubMed: 16164760. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]37. Wirtz E, Leal S, Ochatt C, Cross GA (1999) Жестко регулируемая индуцируемая система экспрессии для условного нокаута генов и доминантно-негативной генетики в Trypanosoma Брюсей . Мол Биохим Паразитол 99: 89–101. PubMed: 10215027. [PubMed] [Google Scholar]38. Wickstead B, Ersfeld K, Gull K (2002)Нацеливание тетрациклин-индуцируемой системы экспрессии на транскрипционно молчащие минихромосомы Trypanosoma Брюсей .Мол Биохим Паразитол 125: 211-216. PubMed: 12467990. [PubMed] [Google Scholar]39. Gómez EB, Kornblihtt AR, Téllez-Iñón MT (1998)Клонирование cdc2-родственной протеинкиназы из Trypanosoma cruzi , который взаимодействует с циклинами млекопитающих. Мол Биохим Паразитол 91: 337–351. PubMed: 9580532. [PubMed] [Google Scholar]40. Чоудхури А.Р., Чжао З., Энглунд П.Т. (2008)Влияние гидроксимочевины на проциклические трипаносомы brucei: нетрадиционный механизм достижения синхронного роста.эукариотическая клетка 7: 425-428. PubMed: 18083826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]42. Maundrell K (1990) Nmt1 делящихся дрожжей. Высокотранскрибируемый ген полностью репрессирован тиамином. J Биол Хим 265: 10857-10864. PubMed: 2358444. [PubMed] [Google Scholar]43. Морено С., Клар А., Медсестра П. (1991) Молекулярно-генетический анализ делящихся дрожжей Schizosaccharomyces помбе . Методы Энзимола 194: 795–823. doi: 10.1016/0076-6879(91)94059-L. PubMed: 2005825. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44.MacIntosh GC, Ulloa RM, Raices M, Téllez-Iñón MT (1996) Изменения активности кальций-зависимой протеинкиназы во время клубнеобразования in vitro у картофеля (Solanum tuberosum), L. Завод Физиол 112: 1541-1550. PubMed: 12226463. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]45. Ferrell JE Jr, Martin GS (1991)Оценка активности блотированных протеинкиназ. Методы Энзимола 200: 430-435. дои: 10.1016/0076-6879(91)00159-Т. PubMed: 1956329. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Хэнкс С.К., Куинн А.М., Хантер Т. (1988)Семейство протеинкиназ: консервативные черты и выведенная филогения каталитических доменов.Наука 241: 42-52. дои: 10.1126/наука.32. PubMed: 32. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Хэнкс С.К., Хантер Т. (1995) Протеинкиназы 6. Суперсемейство эукариотических протеинкиназ: структура и классификация киназного (каталитического) домена. ФАСЭБ Ж 9: 576-596. PubMed: 7768349. [PubMed] [Google Scholar]48. Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и другие. (2011) MEGA5: Молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии.Мол Биол Эвол 28: 2731–2739. doi:10.1093/molbev/msr121. PubMed: 21546353. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Maundrell K (1993)Репрессируемые тиамином векторы экспрессии pREP и pRIP для делящихся дрожжей. Ген 123: 127-130. doi: 10.1016/0378-1119(93)

    -D. PubMed: 8422996. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Borup MT (2006)Стресс-индуцированный переход к псевдогифальному росту у S. pombe. Клеточный цикл 5: 2138-2145. doi: 10.4161/cc.5.18.3206. PubMed: 16940755. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51.Hammarton TC, Lillico SG, Welburn SC, Mottram JC (2005) Трипаносома brucei MOB1 необходим для точного и эффективного цитокинеза, но не для выхода из митоза. Мол Микробиол 56: 104–116. doi:10.1111/j.1365-2958.2005.04542.x. PubMed: 15773982. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Хэнкс С.К., Куинн А.М. (1991)База данных последовательностей каталитических доменов протеинкиназы: идентификация консервативных признаков первичной структуры и классификация членов семейства.Методы Энзимола 200: 38-62. doi: 10.1016/0076-6879(91)00126-H. PubMed: 1956325. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Parker LL, Atherton-Fessler S, Piwnica-Worms H (1992) p107wee1 представляет собой киназу с двойной специфичностью, которая фосфорилирует p34cdc2 по тирозину 15. Proc Natl Acad Sci U_S_A 89: 2917-2921. PubMed: 1372994. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]54. Aligue R, Wu L, Russell P (1997)Регулирование тирозинкиназы Schizosaccharomyces pombe Wee1. J Биол Хим 272: 13320-13325. дои: 10.1074/jbc.272.20.13320. PubMed: 9148953. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Ватанабе Н., Араи Х., Ивасаки Дж., Шиина М., Огата К. и другие. (2005)Фосфорилирование Cyclin-зависимой киназы (CDK) дестабилизирует соматический Wee1 несколькими путями. Proc Natl Acad Sci U_S_A 102: 11663-11668. PubMed: 16085715. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]58. Сунь Ю, Дилкес Б.П., Чжан С., Данте Р.А., Карнейро Н.П. и другие. (1999) Характеристика кукурузы (Zea mays L.) Wee1 и ее активности в развитии эндосперма. Proc Natl Acad Sci U_S_A 96: 4180-4185.PubMed: 10097184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

    59. Гонсалес Н., Эрнульд М., Дельмас Ф., Жеводан Ф., Дафф П. и другие. (2005) Молекулярная характеристика гомолога гена Wee1 у томата. (Lycopersicon esculentum Mill.) Растение Мол Биол 56: 849-861

    60. Ульрих А., Шлессингер Дж. (1990)Передача сигнала рецепторами с тирозинкиназной активностью. Клетка 61: 203-212. дои: 10.1016/0092-8674(90)-К. PubMed: 2158859. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 61. Паркер Л.Л., Атертон-Фесслер С., Ли М.С., Огг С., Фальк Дж.Л. и другие.(1991) Cyclin способствует фосфорилированию тирозина p34cdc2 зависимым от wee1+ образом. ЭМБО J 10: 1255-1263. PubMed: 1850698. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]62. Parker LL, Piwnica-Worms H (1992) Инактивация комплекса p34cdc2-циклин B тирозинкиназой WEE1 человека. Наука 257: 1955-1957 гг. дои: 10.1126/наука.1384126. PubMed: 1384126. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 64. Murakami MS, Copeland TD, Vande Woude GF (2011) Mos положительно регулирует Xe-Wee1, чтобы удлинить первый митотический клеточный цикл Xenopus.Гены Дев 13: 620-631. PubMed: 10072389. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]65. Mueller PR, Leise WF 3rd (2005) Измерение активности киназы Wee. Методы Мол Биол 296: 299-328. PubMed: 15576941. [PubMed] [Google Scholar] 66. Потапова Т.А., Сивакумар С., Флинн Дж.Н., Ли Р., Горбский Г.Дж. (2011)Митотическая прогрессия становится необратимой в прометафазе и разрушается при ингибировании WEE1 и CDC25. Мол Селл Биол 22: 1191-1206. doi: 10.1091/mbc.E10-07-0599. PubMed: 21325631. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]68.Harvey SL, Kellogg DR (2003)Консервация механизмов, контролирующих вступление в митоз: почкующиеся дрожжи wee1 задерживают вступление в митоз и необходимы для контроля размера клеток. Карр Биол 13: 264-275. doi: 10.1016/S0960-9822(03)00049-6. PubMed: 12593792. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 69. Мерроу Л.В., Гаримелла С.В., Джонс Т.Л., Каплен Н.Дж., Липковиц С. (2010)Идентификация Wee1 как потенциальной молекулярной мишени в раковых клетках с помощью скрининга РНКи тирозинового кинома человека. Лечение рака молочной железы 122: 347-357.doi: 10.1007/s10549-009-0571-2. PubMed: 19821025. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]70. De Witt Hamer PC, Mir SE, Noske D, Van Noorden CJ, Würdinger T (2011)Нацеливание на киназу Wee1 в сочетании с терапией рака, повреждающей ДНК, катализирует митотическую катастрофу. Клин Рак Рез 17: 4200-4207. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2537. PubMed: 21562035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]71. Де Шуттер К., Жубес Дж., Кулс Т., Веркест А., Кореллоу Ф. и другие. (2007) Киназа WEE1 арабидопсиса контролирует остановку клеточного цикла в ответ на активацию контрольной точки целостности ДНК.Растительная клетка 19: 211-225. doi: 10.1105/tpc.106.045047. PubMed: 17209125. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]72. Кулс Т., Янчева А., Веймер А.К., Боэнс С., Такахаши Н. и другие. (2011)Киназа контрольной точки WEE1 Arabidopsis thaliana защищает от преждевременной дифференцировки сосудов во время стресса репликации.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *