Д203А характеристики: КД203А, Мощный выпрямительный диод, СЗТП

Содержание

Заклинивание компрессора

Одна из неприятностей, которая может случиться с компрессором – заклинивание его механизма. В этом случае компрессор при включении просто гудит некоторое врумя, затем срабатывает тепловая защита. Компрессор можно заменить как отдельную запчасть для холодильника, но этот дефект можно попробовать и исправить. Для срыва заклинивания компрессоров используется простое устройство, так называемая «расклинка». Это приспособление, состоящее из двух диодов.

При устранении заклинивания компрессора при помощи данного приспособления напряжение на обмотки электродвигателя подают кратковременно на 3-5 секунд. Затем повторяют это через 20-30 секунд.
Расклинивающий эффект возникает в результате того, что при подаче тока через диоды на валу электродвигателя возникает знакопеременный вращающий момент. Ротор двигателя начинает вибрировать с частотой 50Гц, вибрация через механику передается на заклиненные элементы компрессора и освобождает их.
Также возможно использование и одного диода вместо двух, расклинивающий эффект будет примерно тот же. Включается он в цепь пусковой обмотки, рабочая обмотка непосредственно подключается к сети, а не через диод.

Расклинивание компрессоров при помощи данного приспособления значительно эффективнее, чем просто подача на электродвигатель более высокого напряжения.
Действие данного устройства при расклинивании компрессоров можно усилить, если подключать его через повышающий трансформатор 1 : 1,2…1,5. Мощность трансформатора – не ниже 50Вт.

Подключение расклинивающего устройства можно осуществить, используя разъем от защитного устройства компрессоров старых моделей холодильников (которые еще без РКТ). Либо с помощью небольших изолированных зажимов. Используемые в расклинивающем приспособлении диоды должны иметь допустимое обратное напряжение не ниже 400В и допустимый прямой ток 10А. Такими характеристиками обладают, например Д246, Д247, Д232А, КД203А (В,Д).
На рисунке расклинивающего устройства: 1, 2, 3 – зажимы, одеваемые на контакты компрессора; 4 – компрессор.

Выпрямительные диоды средней мощности КД201

 Диод  Uоб/Uимп
   В/В
 Iпр/Iимп
   А/А
Uпр/Iпр
  В/А
 Cд/Uд
 пф/В
(T нс)
Io(25)
   /Ioм
 мА/мА
Fmax
кгц
 P/Pт
Вт/Вт
Корпус
КД201А
КД201Б
КД201В
КД201Г
 100/
 100/
 200/
 200/
   5/15
  10/15
   5/15
  10/15
1.0/ 5
1.0/10
1.0/ 5
1.0/10
     /3
   /3
   /3
   /3
1.1
1.1
1.1
1.1
    6
  6
  6
  6
КД202А
КД202Б
КД202В
КД202Г
КД202Д
КД202Е
КД202Ж
КД202И
КД202К
КД202Л
КД202М
КД202Н
КД202Р
КД202С
2Д202Т
  35/50
  35/50
  70/100
  70/100
 140/200
 140/200
 210/300
 210/300
 280/400
 280/400
 350/500
 350/500
 420/600
 420/600
 560/800
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   5/9
 3.5/9
   3/
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
0.9/ 5
0.9/ 3.5
1/ 3
     /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
   /1
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
    7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
  7
КД203А
КД203Б
КД203В
КД203Г
КД203Д
КД203Е
КД203Ж
КД203И
КД203К
КД203Л
КД203М
 420/600
 560/800
 560/800
 700/1000
 700/1000
 560/800
 560/800
 700/1000
 700/1000
 280/400
 420/600
  10/30
   5/15
  10/30
   5/15
  10/30
  10/30
  10/30
  10/
  10/
  10/
  10/
1.0/10
1.0/ 5
1.0/10
1.0/ 5
1.0/10
1.0/10
1.0/10
1.0/10
1.0/10
2.0/
2.0/
     /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /1.5
   /4.5
   /4.5
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  /20
  /20
  /20
  /20
  /20
  6
  6
  6
  6
  6
  8
  8
  8
  8
  8
  8
КД204А
КД204Б
КД204В
 400/400
 200/200
  50/ 50
 0.4/
 0.6/
 1.0/
1.4/0.4
1.4/0.6
1.4/1.0
  0.15/2
0.1 /1
0.05/0.5
 50
 50
 50
    8
  8
  8
КД205А
КД205Б
КД205В
КД205Г
КД205Д
КД205Е
КД205Ж
КД205И
КД205К
КД205Л
    /500
    /400
    /300
    /200
    /100
    /500
    /600
    /700
    /100
    /200
 0.5/
 0.5/
 0.5/
 0.5/
 0.5/
 0.3/
 0.5/
 0.3/
 0.7/
 0.7/
1.0/0.5
1.0/0.5
1.0/0.5
1.0/0.5
1.0/0.5
1.0/0.3
1.0/0.5
1.0/0.3
1.0/0.7
1.0/0.7
  0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
0.1/0.2
  5
  5
  5
  5
  5
  5
  5
  5
  5
  5
   28
 28
 28
 28
 28
 28
 28
 28
 28
 28
КД206А
КД206Б
КД206В
 400/
 500/
 600/ 
  10/100
   5/100
   5/100
1.2/1
1.2/1
1.2/1
  0.7/1.5
0.7/1.5
0.7/1.5
  1
  1
  1
  /10
  /10
  /10
  8
  8
  8
2Д207А  600/  0.5/4.5 1.5/0.5   0.15/0.5   1 0.15   5
КД208А  100/100  1.5/ 1.0/1
 
0.05/0.2   1    10
КД209А
КД209Б
КД209В
КД209Г
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
 0.7/15
 0.5/15
 0.5/15
 0.2/10
1.0/0.7
1.0/0.5
1.0/0.5
1.0/0.2
  0.1/0.3
0.1/0.3
0.1/0.3
0.1/0.3
  1
  1
  1
  1
   10
 10
 10
 10
КД210А
КД210Б
КД210В
КД210Г
 800/
 800/
1000/
1000/
  10/50
  10/50
  10/50
  10/50
1.0/10
1.0/10
1.0/10
1.0/10
  1.5/1.5
1.5/1.5
1.5/1.5
1.5/1.5
  1
  1
  1
  1
  /20
  /20
  /20
  /20
  8
  8
  8
  8
КД212А
КД212Б
КД212В
КД212Г
 200/
 200/
 100/
 100/
   1/50
   1/50
   1/50
   1/50
1.0/1
1.2/1
1.0/1
1.2/1
 (300)
 (500)
 (500)
 (300)
0.05/2
 0.1/3
0.05/2
 0.1/3
100
100
100
100
   29
 29
 29
 29
КД213А
КД213Б
КД213В
КД213Г
 200/200
 200/200
 200/200
 100/100
  10/100
  10/100
  10/100
  10/100
1.0/10
1.2/10
1.2/10
1.7/10
 (300)
 (170)
 (500)
 (300)
 0.2/10
 0.2/25
 0.2/25
 0.2/25
100
100
100
100
    9
  9
  9
  9
2Д215А
2Д215Б
2Д215В
 400/400
 600/600
 200/200
   1/10
   1/10
   1/10
1.2/10
1.2/10
1.1/10
  0.05/0.1
0.05/0.1
0.05/0.1
  1
  1
  1
   10
 10
 10
2Д216А
2Д216Б
 100/100
 200/200
  10/30
  10/30
1.2/1
1.2/1
  0.05/0.1
0.05/0.1
100
100
   11
 11
2Д217А
2Д217Б
 100/100
 100/100
   3/9
   3/9
1.1/1
1.1/1
  0.05/2
0.05/2
100
100
    4
  4
2Д218А  100/135   10/100 1.5/10  (300)  0.2/4 100    44
2Д219А
2Д219Б
    /15
    /20
  10/250
  10/250
0.6/10
0.6/10
    20/150
  20/150
200
200
    8
  8
2Д220А
2Д220Б
2Д220В
2Д220Г
2Д220Д
2Д220Е
2Д220Ж
2Д220И
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
1.2/1
1.2/1
1.2/1
1.2/1
1.0/1
1.0/1
1.0/1
1.0/1
 (500)
 (500)
 (500)
 (500)
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
 10
 10
 10
 10
 10
 10
 10
 10
   11
 11
 11
 11
 11
 11
 11
 11
КД221А
КД221Б
КД221В
КД221Г
    /100
    /200
    /400
    /600
 0.7/
 0.5/
    /
    /
1.4/0.7
1.4/0.5
1.4/0.3
1.4/0.3
  0.05/0.15
0.05/0.15
 0.1/0.3
0.15/0.45
 50
 50
 50
 20
   10
 10
 10
 10
2Д222АС
2Д222БС
2Д222ВС
2Д222ГС
2Д222ДС
2Д222ЕС
    /20
    /30
    /40
    /20
    /30
    /40
   3/50
   3/50
   3/50
   3/50
   3/50
   3/50
0.6/3
0.6/3
0.6/3
0.65/3
0.65/3
0.65/3
     2/50
   2/50
   2/50
   2/50
   2/50
   2/50
200
200
200
200
200
200
   45
 45
 45
 45
 45
 45
КД223А  200/230    2/50 1.3/6   0.01/0.5 1.5    52
2Д225АС
2Д225БС
2Д225ВС
    /15
    /25
    /35
   3/75
   3/75
   3/75
0.55/3
0.6/3
0.6/3
     3/30
   3/30
   3/30
200
200
200
   81
 81
 81
КД226А
КД226Б
КД226В
КД226Г
КД226Д
КД226Е
 100/100
 200/200
 400/400
 600/600
 800/800
 600/600
   2/50
   2/50
   2/50
   2/50
   2/50
   2/50
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
0.05/0.4
0.05/0.4
0.05/0.4
0.05/0.4
0.05/0.4
0.05/0.4
 50
 50
 50
 50
 50
 50
   52
 52
 52
 52
 52
 52
КД227А
КД227Б
КД227В
КД227Г
КД227Д
КД227Е
КД227Ж
 100/150
 200/250
 300/450
 400/600
 500/700
 600/850
 800/1200
   5/15
   5/15
   5/15
   5/15
   5/15
   5/15
   5/15
1.6/5
1.6/5
1.6/5
1.6/5
1.6/5
1.6/5
1.6/5
   0.8/
 0.8/
 0.8/
 0.8/
 0.8/
 0.8/
 0.8/
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
   46
 46
 46
 46
 46
 46
 46
2Д228А  100/100    1/50 0.15/1  (300) .025/.25 100    29
2Д229АС
2Д229БС
2Д229ВС
    /15
    /25
    /35
   3/75
   3/75
   3/75
0.55/3
0.6/3
0.6/3
     3/30
   3/30
   3/30
200
200
200
   81
 81
 81
2Д230А
2Д230Б
2Д230В
2Д230Г
2Д230Д
2Д230Е
2Д230Ж
2Д230И
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
   3/60
1.5/3
1.5/3
1.5/3
1.5/3
1.3/3
1.3/3
1.3/3
1.3/3
 (500)
 (500)
 (500)
 (500)
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
.045/1.5
      8
  8
  8
  8
  8
  8
  8
  8
2Д231А
2Д231Б
2Д231В
2Д231Г
    /150
    /200
    /150
    /200
  10/150
  10/150
  10/150
  10/150
1.0/10
1.0/10
1.0/10
1.0/10
  (50)
  (50)
 (100)
 (100)
0.05/2.0
0.05/2.0
0.05/2.0
0.05/2.0
200
200
200
200
    8
  8
  8
  8
2Д232А
2Д232Б
2Д232В
  15/15
  25/25
  35/35
  10/
  10/
  10/
0.6/10
0.6/10
0.6/10
   7.5/100
 7.5/100
 7.5/100
200
200
200
   46
 46
 46
2Д234А
2Д234Б
2Д234В
 100/100
 200/200
 400/400
   3/
   3/
   3/
1.5/3
1.5/3
1.5/3
 (400)
 (400)
 (400)
 0.1/2.0
 0.1/2.0
 0.1/2.0
 50
 50
 50
   11
 11
 11
2Д235А
2Д235Б
  40/40
  30/30
   1/3
   1/3
0.9/3
0.9/3
   0.8/10
 0.8/10
      1
  1
2Д236А
2Д236Б
 600/600
 800/800
   1/30
   1/30
1.5/1
1.5/1
 (115)
 (150)
   5/
   5/
100
100
   47
 47
2Д237А
2Д237Б
 100/100
 200/200
   1/3
   1/3
1.3/1
1.3/1
  (50)
  (50)
0.05/0.4
0.05/0.4
300
300
   39
 39
2Д238АС
2Д238БС
2Д238ВС
  25/25
  35/35
  45/45
 7.5/75
 7.5/75
 7.5/75
0.65/7.5
0.65/7.5
0.65/7.5
      /1
    /1
    /1
200
200
200
   46
 46
 46
2Д239А
2Д239Б
2Д239В
 100/100
 150/150
 200/200
  20/80
  20/80
  20/80
1.4/20
1.4/20
1.4/20
  (50)
  (50)
  (50)
0.02/
0.02/
0.02/
500
500
500
  /25
  /25
  /25
 54
 54
 54
КД241А 1500/1500    2/5 1.4/2 (1500)    /0.005  20 3.5  
КД243А
КД243Б
КД243В
КД243Г
КД243Д
КД243Е
КД243Ж
  50/ 50
 100/100
 200/200
 400/400
 600/600
 800/800
1000/1000
   1/6
   1/6
   1/6
   1/6
   1/6
   1/6
   1/6
1.1/1
1.1/1
1.1/1
1.1/1
1.1/1
1.1/1
1.1/1
  0.01/0.1
0.01/0.1
0.01/0.1
0.01/0.1
0.01/0.1
0.01/0.1
0.01/0.1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
  1
   53
 53
 53
 53
 53
 53
 53
КД244А
КД244Б
КД244В
КД244Г
 100/100
 100/100
 200/200
 200/200
  10/100
  10/100
  10/100
  10/100
1.3/10
1.3/10
1.3/10
1.3/10
  (50)
  (35)
  (50)
  (35)
 0.1/
 0.1/
 0.1/
 0.1/
200
200
200
200
   54
 54
 54
 54
2Д245А
2Д245Б
2Д245В
 400/450
 200/250
 100/150
  10/100
  10/100
  10/100
1.4/10
1.4/10
1.4/10
  (70)
  (70)
  (70)
 0.1/
 0.1/
 0.1/
200
200
200
  /20
  /20
  /20
  9
  9
  9
КД247А
КД247Б
КД247В
КД247Г
КД247Д
КД247Е
 100/100
 200/200
 400/400
 600/600
 800/800
  50/50
   1/30
   1/30
   1/30
   1/30
   1/30
   1/30
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
1.3/1
 (150)
 (150)
 (150)
 (150)
 (250)
 (150)
    /0.1
    /0.1
    /0.1
    /0.1
    /0.1
    /0.1
150
150
150
150
150
150
   53
 53
 53
 53
 53
 53
КД248А
КД248Б
КД248В
КД248Г
КД248Д
КД248Е
КД248Ж
КД248И
КД248К
1000/1000
1000/1000
 800/800
 800/800
 600/600
 600/600
 400/400
 400/400
1000/1200
   3/9.6
   1/3.2
   3/9.6
   1/3.2
   3/9.6
   1/3.2
   3/9.6
   1/3.2
 1.5/4.8
1.4/3
1.4/1
1.4/3
1.4/1
1.4/3
1.4/1
1.4/3
1.4/1
1.1/1.5
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
 (250)
    /1
    /1
    /1
    /1
    /1
    /1
    /1
    /1
    /1
100
100
100
100
100
100
100
100
 65
2.5
2
4.5
2
4.5
2
2.5
2
2.5
 67
 67
 67
 67
 67
 67
 67
 67
 67
2Д249А
2Д249Б
2Д249В
  40/40
  30/30
  20/20
   3/10
   3/10
   3/10
0.475/3
0.475/3
0.475/3
750/1
750/1
750/1
    /3
    /3
    /3
  2.5
2.5
2.5
 52
 52
 52
2Д250А  125/140   10/40 1.4/10 55/100 0.05/ 100    67

Жилые дома на улице 5-я Северная, Омск на карте, год постройки, тип перекрытий

1 ул. Северная 5-я, д. 78 64.00 1968 1 Деревянные Деревянные
2 ул. Северная 5-я, д. 191 8804.80 1988 9 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Кирпич
3 ул. Северная 5-я, д. 193/1 8858.80 1986 9 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Панельные
4 ул. Северная 5-я, д. 195 8828.50 1980 9 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Панельные
5 ул. Северная 5-я, д. 197 621.20 1957 2
6 ул. Северная 5-я, д. 197 А 93.50 1955 1
7 ул. Северная 5-я, д. 199 1598.60 1960 3 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Кирпич
8 ул. Северная 5-я, д. 203Б 708.40 1958 2 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Кирпич
9 ул. Северная 5-я, д. 203 731.40 1958 2 Не указаны в техническом паспорте Железобетонные Кирпич
10 ул. Северная 5-я, д. 203 А 304.60 1959 2
11 ул. Северная 5-я, д. 203 В 301.10 1959 2
12 ул. Северная 5-я, д. 205 299.50 1959 2
13 ул. Северная 5-я, д. 205 А 296.50 1959 2
14 ул. Северная 5-я, д. 205 Б 302.80 1959 2
15 ул. Северная 5-я, д. 205 В 300.50 1959 2
16 ул. Северная 5-я, д. 205 Г 304.70 1959 2
17 ул. Северная 5-я, д. 209 2125.40 1961 4 нет / не указан в техническом паспорте Железобетонные Кирпич
18 ул. Северная 5-я, д. 209 А 2172.90 1961 4 не указан в тех. паспорте Железобетонные Кирпич

идз 1 электроника

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

«Национальный исследовательский Томский политехнический Университет»

Энергетический институт

Кафедра электропривода и электрооборудования

Индивидуальное задание №1

По дисциплине: электроника

Полупроводниковые диоды и их применение в выпрямительных устройствах

Вариант №45

Выполнил: студент группы 4Т61 «04» марта 2018 г. Д.Р. Кошкин

_________

(подпись)

Проверил преподаватель: доцент « » _________ 2018 г. А.В. Глазачев

__________

(подпись)

Томск – 2018

Исходные данные

Дано:

-Номинальное выпрямленное напряжение на нагрузке Ud=10 В;

-ток нагрузки Id=3 А;

-дополнительный коэффициент пульсаций выходного напряжения на нагрузке kп=0,04;

-частота питающей сети f=50 Гц;

-количество фаз n=1;

-номинальное напряжение, подаваемое на первичную обмотку трансформатора, U1=220 В.

Расчет выпрямительного устройства

  1. Анализ исходных данных и выбор принципиальной схемы выпрямителя:

Определим мощность и сопротивление нагрузки:

Однополупериодные выпрямители применяются в основном с емкостным фильтром при токах нагрузки до десятков миллиампер. Преимуществом таких выпрямителей являются простота и возможность работать без трансформатора. Их недостатки: низкая частота пульсаций, высокое обратное напряжение на диодах, плохое использование трансформатора, подмагничивание сердечника трансформатора постоянным током.

Двухполупериодные выпрямители со средней точкой применяются при напряжениях нагрузки до нескольких десятков вольт и выходной мощности до 50 Вт. На выходе выпрямителя устанавливают Г- или П-образные LC и RC фильтры. Преимущества этих выпрямителей: повышенная частота пульсаций, малое число вентилей, возможность применения общего радиатора без изоляции вентилей, малое падение напряжения на вентилях. Недостатки: большая требуемая габаритная мощность трансформатора, повышенное обратное напряжение на вентильных диодах.

Мостовая схема выпрямления применяется наиболее часто. Ее применяют с емкостным, Г- или П-образными LC и RC фильтрами. Достоинством мостовых выпрямителей являются: повышенная частота пульсаций, небольшое обратное напряжение на диодах, эффективное использование трансформатора. Недостатками являются: повышенное падение напряжения на вентилях, невозможность установки однотипных вентилей на одном радиаторе без изолирующих прокладок.

После проведенного анализа однофазных схем выпрямителей выбираем двухполупериодный выпрямитель.

  1. Расчет параметров сглаживающего фильтра:

Так как ток нагрузки составляет единицы, применяем Г-образный LC-фильтр.

Одним из основных условий является обеспечение явно выраженной индуктивной реакции фильтра на выпрямитель, необходимой для большей стабильности внешней характеристики выпрямителя. При индуктивной реакции фильтра меньше действующие значения токов в вентилях и обмотках трансформатора. Для обеспечения индуктивной реакции необходимо, чтобы:

где круговая частота напряжения сети- ,

m-количество пульсаций выпрямленного напряжения за период, для двухполупериодных m=2.

Величину емкости найдем из выражения:

где q-коэффициент сглаживания, который находится по формуле:

Проводим проверку условий эффективности работы фильтра:

Условия эффективности считаются выполненными, если параметры отличаются в более, чем 5 раз, т.е. выше условия выполняются.

  1. Расчет параметров вентильного узла и выбор типов выпрямительных диодов:

Характер нагрузки выпрямителя может быть активным (R), активно- индуктивным (RL) или активно-ёмкостным (RC). Выпрямитель с выходным ёмкостным или резистивно-ёмкостным фильтром считается нагруженным на активно-емкостную нагрузку, а выпрямитель с фильтром, начинающимся на индуктивность – на активно-индуктивную нагрузку.

В нашем случае нагрузка активно-индуктивная.

Для того, чтобы выбрать тип полупроводниковых диодов выпрямителя, необходимо рассчитать с учетом характера нагрузки основные характеристики выпрямителя.

Находим значение максимального обратного напряжения Uобр.max, прикладываемого к силовым диодам при работе выпрямителя выбранного типа:

Среднее Iпр.ср, действующее Iпр.Д и максимальное Iпр.maxзначения прямого тока диодов равны:

Частота на выходе выпрямителя fп:

По справочнику выбираем диод, имеющий ближайшее большие значения предельных параметров, который есть в базе программы EWB.

Выбираем диод КД203А.

Его характеристики: Iпр=10 А при t=100 ⁰C, Uобр.max=420, Iпр.max=10 А при t=100 ⁰C, Iпр.перег.max=50 А, τи=0,05 с, fmax=1 кГц. [1]

Его конструкция:

Рисунок 1- Конструкция диода КД203А

  1. Расчет параметров трансформатора:

Находим действующее значение напряжения U и тока I вторичной обмотки трансформатора:

Минимальная требуемая мощность вторичной обмотки трансформатора равна:

  1. Построение временных диаграмм выпрямителя:

Проверку соответствия применяемых компонентов режима их работы в выпрямителе проведем, смоделировав полученное выпрямительное устройство с использованием прикладной программы Electronics Workbench (Multisim).

Рисунок 2 — Осциллограмма напряжения на обмотке трансформатора

Рисунок 3 — Осциллограмма напряжения после выпрямительной группы

Рисунок 4 — Осциллограмма напряжения на нагрузке

Вывод: в данной работе я провел анализ технического задания, научился выбирать принципиальную схему выпрямительных диодов, рассчитывать сглаживающий фильтр и параметры питающего трансформатора, а также строить временные диаграммы для рассчитанного выпрямителя.

Список литературы

  1. Лавриненко В.Ю. Справочник по полупроводниковым приборам. -М.: Альянс, 2015.-424 с.: ил.

ДИОДЫ ВЫПРЯМИТЕЛЬНЫЕ ЕДИНИЧНЫЕ д242

Основные параметры:

Uобр. макс. — Максимально-допустимое постоянное обратное напряжение
Iпр. макс — Максимально-допустимый постоянный прямой ток tвосст. — Время восстановления
Iобр. — Постоянный обратный ток при Uобр. = Uобр.макс.
Fраб. макс. — Максимальная рабочая частота

Наименование

Iпр.макс., А

Uобр.макс., В

Iобр., мкА

Fраб.макс., кГц

КД102А

КД102Б

2Д102А

2Д102Б

0,1

250-300

0,1

4

КД104А

0,01

500

3

20

Д9Б-К

0,04

10-50

5

40000

КД103А

КД103Б

 2Д103А

2Д103Б

0,1

50

0,4

20

КД128А

0,16

50

0,01

КД209А

0,7

400

100

1

КД209Б

0,5

600

100

1

КД209В

800

КД209Г

КД105Б

КД105В

КД105Г

КД105Д

0,3

400-800

100

1

КД106А

2Д106А

0,3

100

10

30

Д226Б

0,3

300

50

16

Д237Б-Е

0,3

400

50

КД204А

КД204Б

КД204В

 2Д204А

2Д204Б

2Д204В

0,4-1,0

50-400

700

1

КД221А

КД221Б

КД221В

0,5

100-400

50-100

50

КД212А

КД212Б

КД212В

КД212Г

2Д212А

2Д212Б

2Д212В

2Д212Г

1

100-200

50-100

100

КД243Б

КД243В

КД243Г

КД243Д

КД243Ж

1

100-1000

10

1

КД208А

1,5

100

50

1

КД258А

КД258Б

КД258В

КД258Г

КД258Д

1,5

200-1000

150

КД226А

КД226Б

КД226В

КД226Г

КД226Д

2

100-800

50

50

КД257В

КД257Г

КД257Д

3

600-1000

150

КД202В

КД202К

КД202Д

КД202Р

КД202Ж

2Д202В

2Д202К

2Д202Д

2Д202Р

5

50-800

800

1,2

КД213А

КД213Б

КД213В

2Д213А

2Д213Б

2Д213В

10

100-200

200

100

2Д201А

2Д201Б

2Д201В

2Д201Г

5,0-10,0

100-200

3

1,1

КД203А

КД203Б

КД203В

КД203Г

КД203Д

  2Д203А

2Д203Б

2Д203В

2Д203Г

2Д203Д

5,0-10,0

420-700

1500

1

Д242

Д243

Д244

Д245

Д246

Д247

Д248

5,0-10,0

100-600

3000

1,1

Наименование

Iпр.макс., А

Uобр.макс., В

tвосст., нс

Корпус

BAS16

0,215

75

6

SOT23

BAT18

0,1

35

SOT23

BAS19

0,2

100

50

SOT23

BAS21

0,2

250

50

SOT23

BAS32

0,2

75

DO-213AA

BAS216

0,25

75

SOD110

BAS221

0,25

200

SOD110

BAV21

0,25

200

DO-35

GSM1M

1

1000

2500

DO2-14AC

BYV95C

2

600

250

SOD57

BY228

3

1300

SOD64

BY251

3

200

DO-201AD

BY252

3

400

DO-201AD

BY255

3

1300

DO-201AD

BY399

3

800

500

DO-201AD

BYW95C

3,7

600

250

SOD64

BYW96E

3,7

1000

300

SOD64

BY229X-400*

8

400

135

TO-220AC

*Корпус изолированный

Диоды

  • Технические параметрыМаксимальное постоянное обратное напряжение, В..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры 2В102Б:Варикапы 2В102Б кремниевые, диффузионно-сплавные, подстроечные. Предназначены для применения в схемах подстройки контуров резонансных усилителей. Выпускаются в пластмассовом корпусе с гибкими выводами. Тип варикапа приводится на упаковке. Положительный вывод мар..

    Цена по запросу

  • Технические параметрыМинимальная общая емкость варикапа,пФ..

    Цена по запросу

  • Технические параметры Минимальная общая емкость варикапа,пФ 18 Максимальная общая емкость варикапа,пФ 26 при Uобр,В 4 Добротность варикапа 300 Минимальный коэффициент перекрытия по емкости 2.5 Максимальный коэффициент перекрытия по емкости 3 Максимальное постоянное обратное напряжение,В 45 ..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры 2Д204А: Диоды 2Д204А кремниевые, диффузионные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 50 кГц. Выпускаются в металлостеклянном корпусе с жесткими выводами. Тип диода и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе. Масса диода..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры 2Ц202Г:2Ц202ГСтолбы из кремниевых, лавинных, диффузионных диодов, импульсные. Предназначены для преобразования переменного импульсного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на ..

    Цена по запросу

  • Столбы из кремниевых, лавинных, диффузионных диодов, импульсные. Предназначены для преобразования переменного импульсного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.Масса столбов:    2Ц202А, 2Ц202Б не ..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры 2Ц202Е:2Ц202ЕСтолбы из кремниевых, лавинных, диффузионных диодов, импульсные. Предназначены для преобразования переменного импульсного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на ..

    Цена по запросу

  • Диод кремниевый, диффузионный. Предназначен для работы в цепях статических преобразователей электроэнергии постоянного и переменного токов на частотах до 2 кГц. Выпускается в металлостеклянном корпусе с гибким выводом. Диод имеет 15 классов по напряжению (от 1,5 до 14). Охлаждение воздушное естестве..

    Цена по запросу

  • Столбы из кремниевых, сплавных диодов, выпрямительные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах с жесткими выводами. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.Масса столбов: Д1004, Д1005А не более ..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры Д1005Б:Д1005БСтолбы из кремниевых, сплавных диодов, выпрямительные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах с жесткими выводами. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на ко..

    Цена по запросу

  • Столбы из кремниевых, сплавных диодов, выпрямительные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах с жесткими выводами. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.Масса столбов Д1007 не более 60 г.Осно..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры Д1007:Д1007Столбы из кремниевых, сплавных диодов, выпрямительные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах с жесткими выводами. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на корп..

    Цена по запросу

  • Основные технические параметры Д1008:Д1008Столбы из кремниевых, сплавных диодов, выпрямительные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1 кГц. Выпускаются в пластмассовых корпусах с жесткими выводами. Тип столба и схема соединения электродов с выводами приводятся на корп..

    Цена по запросу

  • Диоды Д226Г кремниевые, сплавные.  Выпускаются в металлостеклянном корпусе с гибкими выводами.  Тип диода и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.  Масса диода не более 2 г. Основные технические характеристики диода Д226Г: Uoбp max — Максимальное ..

    Цена по запросу

  • Диоды Д231А кремниевые, диффузионные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1,1 кГц. Выпускаются в металлостеклянном корпусе с жесткими выводами. Тип диода и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.Масса диодов с комплектующими деталями не более 18 ..

    Цена по запросу

  • Тип диода выпрямительный Максимальное постоянное обратное напряжение,В 400 Максимальный прямой (выпрямленный за полупериод) ток,А 0.3 Максимальное время восстановления ,мкс — Максимальное импульсное обратное напряжен..

    Цена по запросу

  • Диоды Д237В кремниевые, диффузионные. Выпускаются в металлостеклянном корпусе с гибкими выводами. Тип диода и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе. Масса диода не более 2 г.Основные технические характеристики диода Д237В:Uoбp max — Максимальное постоянное обратное напряжение:..

    Цена по запросу

  • ОписаниеТип диода выпрямительный Максимальное постоянное обратное напряжение,В 100 Максимальный прямой(выпрямленный за полупериод) ток,А 10 Максимальный прямой (выпрямленный за полупериод) ток,А ..

    Цена по запросу

  •   Описание  Тип диода выпрямительный Максимальное постоянное обратное напряжение,В 100 Максимальный прямой(выпрямленный за полупериод) ток,А 10 Максимальный прямой (выпрямленный за полупериод) ток,А..

    Цена по запросу

  • Технические параметрыМаксимальное постоянное обратное напряжение, В..

    Цена по запросу

  • Молекулярно-динамическое моделирование мутантов фибулина-4 человека D203A и E126K выявило конформационные изменения в доменах EGF, потенциально ответственных за повышенную лабильность протеаз и нарушение сборки внеклеточного матрикса

    https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.05.007 Content

    Highlights

    . мутации вызывают повышенную чувствительность к протеазе и нарушение секреции.

    Впервые представлена ​​3D-модель коровых доменов фибулина-4 EGF2-6

    Abstract

    Фибулин-4 представляет собой 50 кДа гликопротеин эластических волокон и играет важную роль в развитии и функционировании эластических тканей. Фибулин-4 состоит из тандемного массива пяти кальций-связывающих модулей, подобных эпидермальному фактору роста, между N- и C-концевыми доменами.Мутации в гене человеческого фибулина-4 EFEMP2 были идентифицированы у пациентов с различными артериопатиями, включая аневризму, извитость артерий или стеноз, но молекулярная основа большинства корреляций генотип-фенотип неизвестна. Здесь мы представляем подходы к биохимическому и компьютерному моделированию, разработанные для дальнейшего понимания изменений в структуре и функции двух мутаций фибулина-4 (E126K и D203A), которые потенциально участвуют в связывании Ca 2+ в доменах EGF2 и EGF4 соответственно. .Используя рекомбинантно полученные мутантные белки фибулина-4 и белки дикого типа, мы показали, что обе мутации вводят дополнительные сайты расщепления протеазами, нарушают внеклеточную сборку в волокна и влияют на связывание с фибриллином-1, латентными TGF-β-связывающими белками и лизилоксидазой LOXL2. . Молекулярно-динамические исследования показали, что мутации E126K и D203A не обязательно приводят к прямой потере комплексного иона Ca 2+ после времени моделирования 500 нс, но значительно усиливают флуктуации в соединительной петле между доменами EGF3 и EGF4 и другими конформационными изменениями. изменения.Напротив, преднамеренное удаление Ca 2+ из EGF4 (D203A ΔCa) предсказывает резкие изменения в структуре белка. Эти результаты могут объяснить изменения в сайтах расщепления протеаз, сниженную секрецию и нарушение внеклеточной сборки мутантов фибулина-4 E126K и D203A и обеспечить дальнейшее понимание молекулярной основы связанных клинических фенотипов.

    Ключевые слова

    Ключевые слова

    ключевых слов

    Протеин

    Мутация

    Мутация

    Матрица Узел

    Компьютерное моделирование

    FIBULIN-4

    Собеты

    CBEGF-подобный модуль

    Cibegf-подобный модуль

    , связанный с кальцием-связывающим эпидермальный фактором роста модуль

    -концевой домен

    LTBP

    латентный TGF-β-связывающий белок

    LOXL

    лизилоксидазоподобный белок

    rF11

    N-концевая половина рекомбинантного фибриллина-1

    Рекомендуемые статьи

    Просмотр полного текста

    © 2019 Elsevier B.В. Все права защищены.

    Microsoft Word — Приложение A

    %PDF-1.6 % 106 0 объект > эндообъект 103 0 объект >поток Acrobat Distiller 6.0.1 (Windows)2008-01-30T15:47:06-08:00PScript5.dll Версия 5.2.22009-03-23T08:18:25-07:002009-03-23T08:18:25-07: 00uuid:5df30a9e-417f-4b21-8bad-c563865a8880uuid:8dc9f3e0-7c9f-43e6-a471-f767aec0ab84application/pdf

  • Microsoft Word — Приложение A — Volume History-jks.doc
  • jspicer
  • конечный поток эндообъект 102 0 объект > эндообъект 100 0 объект > эндообъект 101 0 объект > эндообъект 141 0 объект > эндообъект 146 0 объект > эндообъект 133 0 объект > эндообъект 157 0 объект > эндообъект 108 0 объект > эндообъект 1 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 7 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 14 0 объект >/Шрифт>/ProcSet[/PDF/Text]/ExtGState>/Шаблон>>>/Тип/Страница>> эндообъект 15 0 объект [16 0 R 17 0 R 18 0 R 19 0 R 20 0 R 21 0 R 22 0 R 23 0 R] эндообъект 31 0 объект >поток Hw6TH/*23Q0

    d203a.nchttp://xml.opendap.org/ns/DAP/3.2# http://xml.opendap.org/dap/dap3.2.xsdhttp://xml.opendap.org/transforms/ddxToRdfTriples.xsl3.2/ rqds / глобальный / ежедневно / d203a.ncNC_GLOBALContainertitleStringJASL / в UHSCL Исследование качества мареографических данные (ежедневно) ncei_template_versionStringNCEI_NetCDF_TimeSeries_Orthogonal_Template_v2.0featureTypeStringtimeSeriesConventionsStringCF-1,6, ACDD-1.3date_createdString2020-05-08T05: 22: 44Zpublisher_nameStringUniversity Гавайи уровня моря центр (в UHSCL) publisher_emailStringphiliprt @ Гавайи.edu, [email protected]_urlStringhttp://uhslc.soest.hawaii.edusummaryStringОбъединенный архив данных о качестве исследований уровня моря (JASL) (RQDS) является результатом сотрудничества между Центром уровня моря Гавайского университета (UHSLC) и Мировой центр океанографических данных Национальных центров экологической информации (NCEI) Национального управления океанических и атмосферных исследований (NOAA). Цель JASL RQDS состоит в том, чтобы собрать хорошо задокументированный, контролируемый по качеству архив почасовых и суточных значений уровня моря, подходящий для научных исследований.JASL RQDS является крупнейшим глобальным собранием проверенных почасовых данных об уровне моря, и постоянные усилия направлены на приобретение новых участков и раскрытие исторических записей по мере их доступности. Данные JASL RQDS проходят оценку качества уровня 1, ориентированную на изменчивость (например, оценку единиц измерения и времени, обнаружение выбросов, объединение нескольких каналов в основной канал и т.g., оценка исходных данных мареографа, оценка привязки уровня к контрольным точкам мареографа, сравнение с близлежащими станциями и т. д.).acknowledgmentStringThe JASL/UHSLC Research Quality Data Set поддерживается Национальным управлением океанических и атмосферных исследований (NOAA) через национальные центры. для информации об окружающей среде (NCEI) и Управления климатических наблюдений (OCO).Идентификатор record_idrecord_idlong_nameStringunique для каждой записи (например, станции и версии) в databaserecord_id1sea_level.timetimelong_nameStringtimeaxisStringTunitsStringdays начиная с 1800-01-01 00: 00: 00time232timetimelong_nameStringtimeaxisStringTunitsStringdays начиная с 1800-01-01 00: 00: 00time232latlatlat.latlatstandard_nameStringlatitudeunitsStringdegrees_northaxisStringYvalid_minInt32-90valid_maxInt3290record_id1lat.record_idrecord_idlong_nameStringunique идентификатор для каждой записи ( т.е. станция и версия) в базе данныхrecord_id1lonlonlon.lonlonstandard_nameStringlongitudeunitsStringdegrees_eastaxisStringXvalid_minInt320valid_maxInt32360record_id1lon.record_idrecord_idlong_nameStringunique идентификатор для каждой записи (т.е. станции и версии) в стране databaserecord_id1station_namestation_namelong_nameStringstation namestring_lengthInt3215record_id1station_countrystation_countrylong_nameStringstation (3166-1 ИСО) string_lengthInt326record_id1station_country_codestation_country_codestation_country_code.station_country_codestation_country_code_FillValueInt160long_nameStringstation код страны (ISO 3166-1) числовые commentStringThese являются 3-значными коды стран (например.g., 003), хранящиеся как целые числа. Гавайский центр уровня моря (UHSLC)record_id1uhslc_id.record_idrecord_idlong_nameStringуникальный идентификатор для каждой записи (т.e., станция и версия) в базе данныхrecord_id1versionversionlong_nameStringверсиястанцииcommentStringВерсия станции представляет собой букву от A до Z, дифференцирующую сегменты записи станции, которые не могут быть связаны с общим эталоном. Система наблюдений (ГЛОСС)record_id1gloss_id.record_idrecord_idlong_nameStringуникальный идентификатор для каждой записи (т.т. е., станция и версия) в базе данныхrecord_id1ssc_idssc_idlong_nameStringуникальный код идентификатора станции в Каталоге станций наблюдения за уровнем моря (SSC), подготовленном Центром мониторинга уровня моря ВМО/МОК (VLIZ)commentStringОбратите внимание, что идентификаторы SSC различаются по длине. Идентификаторы дополняются символами пробела, чтобы создать представленную здесь прямоугольную матрицу символов.record_idrecord_idlong_nameStringunique идентификатор для каждой записи (например, станции и версии) в databaserecord_id1reference_codereference_codelong_nameStringreference codeflag_valuesStringR, Xflag_meaningsStringdata ссылка на данности, данные не ссылается на datumstring_lengthInt321reference_offsetreference_offsetreference_offset.reference_offsetreference_offsetunitsStringmillimeterslong_nameStringreference offsetcommentStringThis постоянное смещение, которое добавляется к каждому значению данных, чтобы сделать данные относительно персонала приливной нулевое или первичное значение.record_id1reference_offset.record_idrecord_idlong_nameStringУникальный идентификатор для каждой записи (т. е. станции и версии) в базе данныхrecord_id1cid:

    Стафилококковый энтеротоксин H Отображает уникальные свойства связывания MHC класса II

    Abstract

    Стафилококковый энтеротоксин H (SEH) был описан как суперантиген благодаря гомологии последовательностей с подсемейством SEA и кратко охарактеризован в отношении его активности in vivo. В этом исследовании мы демонстрируем, что SEH является мощным митогеном Т-клеток и индуктором цитотоксичности Т-клеток, который обладает уникальными свойствами связывания MHC класса II.Очевидное сродство SEH к молекулам MHC класса II является самым высоким из когда-либо измеренных сродств к стафилококковому энтеротоксину ( B max1/2 ~ 0,5 нМ для MHC класса II, экспрессируемых на клетках Raji). Избыток SEA или SEA F47A , у которого снижено связывание с α-цепью MHC класса II, способен конкурировать за связывание SEH с MHC класса II, что указывает на перекрывание сайтов связывания на β-цепи MHC класса II. цепь. Связывание SEH с MHC класса II подобно SEA, SED и SEE зависит от присутствия ионов цинка.Однако SEH, в отличие от SEA, связывается с аланин-замещенной молекулой DR1, βH81A, которая, как полагают, имеет нарушенную цинк-мостиковую способность. Более того, замена остатков D167, D203 и D208 в SEH на аланин снижает сродство к MHC класса II, а также его активность in vitro. Вместе это указывает на сайт связывания MHC класса II на SEH с другой топологией по сравнению с SEA. Эти уникальные свойства связывания будут полезны для SEH, чтобы преодолеть изменчивость и полиморфизм изотипа MHC класса II, а также обеспечить эффективную презентацию на APC даже при низкой поверхностной экспрессии MHC класса II.

    Суперантигены (SAg) 2 представляют собой группу сильнодействующих иммуностимулирующих белков бактериального и вирусного происхождения. В отличие от обычных АГ, САг взаимодействуют как непроцессированные белки с молекулами МНС класса II за пределами пептидсвязывающей бороздки (1) на АПК и активируют высокую частоту Т-лимфоцитов. SAg связывается и активирует все Т-лимфоциты, экспрессирующие определенные Vβ-цепи TCR (2). Активация приводит к активной пролиферации Т-клеток и продукции цитокинов, а также к индукции цитотоксической активности Т-клеток.

    Стафилококковые энтеротоксины (СЭ) представляют собой группу структурно и функционально гомологичных САг и являются основной причиной пищевых отравлений у людей (3, 4). СЭ представляют собой белки с молекулярной массой около 25 кДа, и к настоящему времени охарактеризовано 10 энтеротоксинов: стафилококковый энтеротоксин A, B, C, D, E, G, H, I и J (SEA, SEB и др.) и токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1). SEA и SEB вместе с TSST-1 являются одними из наиболее хорошо охарактеризованных SAg, тогда как SEH, SEG, SEI и SEJ были идентифицированы только недавно (5, 6, 7, 8).Кристаллографические исследования SEA (9, 10), SEB (11, 12), SEC 2 (13), SED (14) и TSST-1 (15, 16) показывают удивительно консервативную топологию, что указывает на сильное эволюционное давление. на структурную целостность SE. На основании сходства последовательностей SE можно разделить на два подсемейства, одно из которых включает SEB, SEC 1–3 и SEG. Второе подсемейство состоит из SEA, SED, SEE, SEH, SEI и SEJ, которые все имеют общий мотив связывания цинка в своем С-концевом домене. Было показано, что координация Zn 2+ является основным требованием для эффективной презентации SEA, SED и SEE на молекулах MHC класса II (17, 18, 19, 20, 21).

    Несмотря на высокую степень структурной гомологии, SE взаимодействуют с молекулами MHC класса II по-разному и с разным сродством. Сокристаллические структуры SEB/HLA-DR1 (22) и TSST-1/HLA-DR1 (23) были разрешены и демонстрируют заметные различия в их взаимодействии с MHC класса II. SEB взаимодействует исключительно с остатками α-цепи МНС класса II, тогда как TSST-1 связывается со связанным пептидом, а также с α- и β-цепью МНС класса II. Кристаллическая структура SEA в комплексе с молекулой MHC класса II еще не определена.Однако исследования ингибирования показывают, что SEA конкурирует как с SEB, так и с TSST-1 (24, 25), указывая на то, что связывание этих токсинов с MHC класса II частично перекрывается. С другой стороны, SEB и TSST-1 не способны ингибировать связывание SEA с MHC класса II (24, 25). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что для этих SE существует общая область связывания, а также дополнительное связывание MHC класса II в SEA. Сайт-направленный мутагенез выявляет две отдельные области в SEA, которые влияют на его сродство к молекулам MHC класса II (17, 18, 19, 26).Сайт связывания, находящийся в N-концевом домене SEA и взаимодействующий с α-цепью MHC класса II, структурно гомологичен такому же участку SEB. Поверхность связывания включает остатки F47 и D70 в SEA (17, 18, 19, 26), которые эквивалентны F44 и E67 в SEB. Эти остатки являются важными контактными остатками на границе между SEB и HLA-DR1 (22). Кроме того, цинк-зависимый сайт связывания находится в С-концевом домене SEA, связываясь с β-цепью MHC класса II посредством координации цинка с помощью h287, h325 и D227 в SEA (9, 10, 18, 19).Вместе эти два сайта связывания позволяют SEA связываться с МНС класса II с аффинностью около 10 нМ (18).

    SEH представляет собой бактериальный SAg, о котором известно лишь несколько функциональных свойств (5, 6). SEH имеет около 35% идентичности аминокислот с SEA, SED и SEE. Выравнивание последовательностей SEH и SEA показывает интересные сходства, а также различия в областях, способствующих взаимодействию MHC класса II в SEA (рис. 1⇓). Недавно была решена кристаллическая структура SEH (Maria Håkansson et al., рукопись в процессе подготовки), а наложение SEH на другие доступные кристаллические структуры показывает, что выравнивание этих областей правильное. C-концевой цинксвязывающий мотив SEA, который способствует взаимодействию с β-цепью MHC класса II, также, по-видимому, присутствует в SEH. Мотив связывания цинка в SEA, установленный определением структуры рентгеновской дифракции (9, 10), состоит из h325 и D227 в самой внешней С-концевой части SEA вместе с h287. Единичная замена аланином всех трех координирующих цинк остатков в SEA приводит к снижению аффинности связывания MHC класса II, что сопровождается снижением активности SAg in vitro (18).Аминокислотные остатки D167, h306 и D208 в SEH, все потенциальные остатки для координации цинка, совпадают с h287, h325 и D227 в SEA. Координация цинка в SEA почти идентична координации родственного SED, как показано на рентгенограмме структуры (14). Однако в кристалле SED четвертое положение тетраэдрической координации занято h318 из соседнего SED, что приводит к гомодимеру SED. Присутствие гомодимеров SED в растворе было подтверждено экспериментами по ковалентному сшиванию, а также гель-фильтрацией (14).Кроме того, было показано, что однократное замещение аланином всех координирующих цинк остатков, а также отсутствие цинка аннулируют способность SED образовывать гомодимеры в растворе.

    ФИГУРА 1.

    Выравнивание последовательностей SEH, SED, SEE и SEA, созданное программой наложения Genetic Computer Group. Аминокислотные идентичности между SEH и любыми другими SE отмечены рамками. Аминокислоты в SED, SEA и SEE, важные для связывания α-цепи MHC класса II (SED F42 , SEA F47 , SEE F47 , SEA D70 и SEE D70 ), MHC класса II β-цепная связывание (SED D182 , море H287 , см. H287 , SED H32094, SED H325 , см. H325 , SED D222 , SED D227 , и увидеть D227 ) и гомодимеризация SED (SED h318 ).Нумерация аминокислотных остатков основана на последовательности SEA.

    Гомодимеризация открывает новые возможности SED для взаимодействия с MHC класса II и может иметь биологическое значение, на что указывает функциональное перекрестное связывание MHC класса II на моноцитах (21). В SEH аспартат в положении 203 выравнивается с h318 в SED, что указывает на то, что этот остаток может участвовать в сходной цинк-зависимой гомодимеризации. В N-концевой области СЭГ отличается более заметно по сравнению с другими СЭ.Фенилаланин, F44 в SEB и F47 в SEA, который важен для связывания с α-цепью MHC класса II, выравнивается с остатком серина в SEH (S36). Более того, E67 в SEB, взаимодействующий с K39 в α-цепи MHC класса II, и эквивалентный D70 в SEA, вероятно, вовлеченный в подобное взаимодействие (17, 22), выравнивается с остатком лизина в SEH (K56). Различия в этих важных положениях указывают на неспособность SEH взаимодействовать с α-цепью MHC класса II с той же топологией связывания, что и все SE, охарактеризованные до сих пор.

    В этом исследовании мы исследовали свойства связывания SEH с MHC класса II, используя аланин-замещенные молекулы SEH и MHC класса II в чувствительном сцинтилляционном анализе близости, и охарактеризовали влияние связывания MHC класса II на активность in vitro. Мы оцениваем потенциальный мотив связывания цинка, обнаруженный в С-концевом домене SEH, и показываем, что SEH демонстрирует уникальное связывание с MHC класса II.

    Материалы и методы

    Клонирование и конструирование векторов экспрессии SEH

    Аминокислотная последовательность из опубликованной SEH (5) была обратно транслирована с использованием предпочтительных кодонов Escherichia coli для генов с высокой экспрессией.ДцДНК, кодирующая зрелый SEH, была получена с использованием удлинения перекрытия последовательностей на основе ПЦР (27). Чтобы облегчить будущие точечные замены этой последовательности, было введено несколько уникальных сайтов рестрикционных ферментов, молчащих в отношении кодирования аминокислот. Полученный ген, который продуцирует зрелый белок SEH, имеет 72% нуклеотидную идентичность с опубликованной последовательностью (5). Одиночные аминокислотные замены гена SEH были введены с использованием удлинения с перекрыванием последовательностей (27). ПЦР проводили с помощью AmpliTaq (Perkin-Elmer, Foster City, CA) в соответствии с рекомендациями производителя.Сгенерированные ПЦР фрагменты клонировали в ПЦР-скрипт (Stratagene, La Jolla, CA) или PCR-TA (Invitrogen, Leek, Нидерланды). После анализа последовательности с помощью призмы ABI 310 с использованием рекомендованного стандартного протокола (Perkin-Elmer) варианты SEH были клонированы в векторе экспрессии pLR16. Этот вектор содержит точку начала репликации PBR322, промотор стафилококкового белка А, синтетический сигнальный пептид (L.Abrahmsén, неопубликованные результаты) и последовательность устойчивости к канамицину.

    Экспрессия и очистка белков

    Э.coli K12, штамм UL635, содержащий векторы, кодирующие различные варианты SEH, культивировали в течение ночи при 25°C в 2× YT (Difco Laboratories, Detroit, MI) с добавлением канамицина (100 мг/л). Осадки клеток собирали после центрифугирования при 5×10 3 g и затем замораживали. Периплазматическое содержимое высвобождали путем оттаивания осадка клеток в 5 мМ Tris-HCl (ICN Biomedicals, Aurora, OH), pH 7,5, на льду при перемешивании. Периплазматические экстракты осветляли центрифугированием при 1 × 10 4 g и подвергали очистке.

    После корректировки pH периплазматические экстракты наносили на колонку SP Sepharose. Колонку промывали и белки элюировали линейным градиентом от 20 до 500 мМ ацетата аммония (ICN Biomedicals), pH 4,65, содержащим 0,02% Tween 80. Фракции, содержащие SEH, еще раз наносили на колонку SP Sepharose и элюировали с пониженным потоком. и увеличенный объем градиента. Белковые препараты SEH имели чистоту >95% по данным окрашенных кумасси SDS-полиакриламидных гелей, а также жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LCQ) в сочетании с УФ-детектированием.Жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию также использовали для определения молекулярной массы полученных вариантов SEH. Отклонение от теоретической молекулярной массы, рассчитанной по аминокислотной последовательности, составляло менее ±4 Да (0,02%) для всех полученных вариантов SEH.

    Клетки

    Клеточная линия В-клеточной лимфомы человека Raji, карцинома толстой кишки человека Colo205, клетки Ltk , клетки RJ 2.2.5, клетки CHO и линия L-клеток мышиных фибробластов DAP-3, трансфицированные HLA-DR1, культивировались в полной Среда R (RPMI 1640; BioWhittaker, Verviers, Бельгия) с добавлением 10% FCS (HyCrone, Logan, UT), 5 × 10 -5 M 2-ME (Merck, Дармштадт, Германия) и 0.1 мг/мл гентамицина (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль). Клетки DAP, трансфицированные DR1 βH81A , культивировали в полной среде R с добавлением 1 мг/мл генитицина (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA). Трансфектанты DAP были любезно предоставлены R.-P. Секали (26). Трансфектанты CHO, экспрессирующие HLA-DR4, культивировали в полной среде R без L-глутамина с добавлением 1 мМ MSX (Sigma, Сент-Луис, Миссури). РВМС готовили из гепаринизированной крови здоровых доноров. Клетки выделяли центрифугированием с плотностью над Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя.Человеческую SEH-реактивную Т-клеточную линию получали в соответствии со стандартным протоколом (28).

    Анализ пролиферации лимфоцитов

    РВМС человека, 2 × 10 5 клеток на 0,2 мл полной среды R, инкубировали с различными количествами SE в плоскодонных титрационных микропланшетах при 37°C в течение 72 часов. В каждую лунку вводили 5 мкКи [ 3 H]тимидина (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс) в течение 4 часов. Клетки собирали и измеряли пролиферацию путем включения [ 3 H]тимидина в бета-сцинтилляционный счетчик.

    Анализы цитотоксичности

    Цитотоксичность

    измеряли в стандартном 4-часовом анализе высвобождения 51 Cr (28). 51 Cr-меченые клетки Raji человека использовали в качестве клеток-мишеней в количестве 2500 клеток на 0,2 мл полной среды в V-образных лунках для микротитрования. Эффекторные клетки, линии SEH или SEA-реактивных Т-клеток человека, использовали при соотношении E:T 30:1 и с добавлением SE в различных концентрациях. Процент специфической цитотоксичности рассчитывали как 100 × [(экспериментальное высвобождение имп/мин — фоновое высвобождение имп/мин)/(общее высвобождение имп/мин — фоновое высвобождение имп/мин)].

    Анализ связывания

    Влияние цинка на взаимодействие между SEH и MHC класса II было исследовано с помощью комбинированного анализа ELISA и связывания с плазматической мембраной (29). Выделение фракций плазматических мембран из клеток Raji и RJ 2.2.5 человека и приготовление микротитровальных планшетов, покрытых плазматической мембраной, проводили, как описано ранее (29, 30). Биотинилированные СЭ, разведенные в TBS (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl (Merck), pH 7,4) с 1% BSA (Hoffmann-LaRoche, Базель, Швейцария), предварительно инкубировали с 1 мкМ ZnCl 2 (Sigma) или 2 мкМ ЭДТА (ICN Biomedicals).Раствор SE, 0,2 мл/лунку в концентрации, обеспечивающей полумаксимальное связывание, добавляли в лунки, покрытые 0,165 мкг препарата плазматической мембраны. Биотинилирование СЭ NHS-биотином (длинное плечо) проводили в соответствии с рекомендациями производителя (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Взаимодействие между СЭ и МНС класса II выявляли с использованием набора Vectatain ABC (Vector Laboratories) и набора планшетов с субстратом пероксидазы SIGMA FAST OPD (Sigma).

    Сцинтилляционный анализ близости клеток (SPA) был использован для определения кажущейся аффинности между SE и MHC класса II.Отделенные клетки DAP, трансфицированные HLA-DR1 wt и HLA-DR1 βH81A , клетки CHO, трансфицированные HLA-DR4, и клетки Raji дважды промывали в среде с дефицитом лейцина (среда RPMI 1640 без Arg, Cys, Leu, Met , инозитол, глюкоза и L-глутамин (Life Technologies, Миддлсекс, Великобритания) с добавлением 2% FCS, 240 мг/л l-аргинина (Life Technologies), 59,6 мг/л динатрия цистеина (Life Technologies), 15 мг/л L-метионин (Life Technologies), 35 мг/л мио-инозитола (Life Technologies), 2 г/л d-глюкозы (Life Technologies), 300 мг/л l-глютамина (Life Technologies) и 10 мг/л л -лейцин (Life Technologies)).Суспензированные клетки метили радиоактивным изотопом в течение ночи при 37°C в количестве 3×10 6 клеток на 6 мл в среде с дефицитом лейцина, дополненной 1-[4,5- 3 H]лейцином (Movarek Biochemicals, Brea, CA). Сп. действовать. 0,4, 0,5, 0,2 и 0,3 мКи [ 3 H]лейцина на 10 6 клеток использовали для клеток DAP-DR1 wt , DAP-DR1 βH81A , CHO-DR4 и Raji соответственно. Перед использованием клетки открепляли и дважды промывали в буфере для анализа: HBSS (Life Technologies) с добавлением 25 мМ HEPES (BioWhittaker) и 1% BSA.Анализ насыщения проводили с использованием 1,5 мг поли(винилтолуоловых) гранул SPA, покрытых антимышиными IgG Ab (Amersham Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция), 15 × 10 3 радиоактивно меченых клеток и различных концентраций слитых белков C215Fab-SE в общий объем 0,15 мл буфера для анализа на лунку. Гранулы SPA и C215Fab-SE предварительно инкубировали в течение не менее 30 минут перед добавлением клеток. Специфическое связывание рассчитывали путем вычитания фонового сигнала, полученного только при использовании C215Fab. Анализ проводили в 96-луночных изопланшетах (Wallac, Turko, Финляндия).После 8-часовой инкубации при комнатной температуре планшеты подсчитывали на бета-сцинтилляционном счетчике. Клетки Ltk , отрицательные по MHC класса II, клетки CHO и клетки RJ 2.2.5 использовали в качестве отрицательного контроля для клеток DAP-DR1 wt , CHO-DR4 и Raji, соответственно, чтобы гарантировать, что достигнутый сигнал специфичен для связывания МНС класса II. Предполагалось, что все C215Fab-SE связывались с клетками до тех пор, пока не было достигнуто насыщение. Полумаксимум насыщения ( B max1/2 ), оцененный по кривым насыщения, использовали в качестве измерения аффинности связывания.

    Конкуренцию различных SE с C215Fab-SEH wt или C215Fab-SEH D208A за связывание с мечеными радиоактивной меткой клетками, экспрессирующими MHC класса II, проводили с той же системой SPA, как описано выше. Однако гранулы SPA предварительно инкубировали с концентрацией C215Fab-SE, обеспечивающей полумаксимальное связывание на кривой насыщения, перед добавлением конкурентов. Гранулы SPA, C215Fab-SE и SE инкубировали по крайней мере за 30 мин до добавления клеток.

    Результаты

    Активность SEH

    in vitro

    Способность SEH wt стимулировать пролиферацию РВМС человека анализировали путем измерения количества встроенного [ 3 H]тимидина в ДНК.Влияние трех различных замен аланина в SEH, D167A, D203A и D208A также исследовали, чтобы определить вклад этих специфических аминокислотных остатков в биологическую функцию. Следует иметь в виду, что существует риск того, что замены приведут к структурным изменениям в молекуле. Однако в Результаты и Обсуждение мы предполагаем, что эффекты, наблюдаемые на биологической функции, являются следствием измененного аминокислотного остатка. SEH представляет собой мощный митоген Т-клеток, проявляющий дозозависимый пролиферативный ответ с полумаксимальной эффективной концентрацией (EC 50 ) около 0.2 пМ (рис. 2⇓ A ). Эта пролиферативная активность сравнима с активностью SEA (EC 50 ~ 0,2 пМ) у подходящих доноров (рис. 2⇓ B ). Замена аланином в мотиве потенциального связывания цинка, D167A и D208A, соответственно, приводит к 10- и 300-кратному снижению способности индуцировать пролиферацию по сравнению с SEH wt (рис. 2⇓ A и таблица I⇓). . Пролиферативная активность SEH D167A снижается аналогично замене аланином аналогичного аминокислотного остатка в SEA, SEA h287A (фиг.2⇓, A и B и Таблица I⇓). Однако эффект D208A в SEH несколько ниже по сравнению с эквивалентной заменой D227A в SEA (рис. 2⇓, A и B и таблица I⇓), что указывает на то, что остаток D208 менее значим для общей активности . Кроме того, SEH D203A показал пониженную способность индуцировать пролиферацию, сравнимую с таковой у SEH D167A (рис. 2⇓ A и таблица I⇓). Это контрастирует с эквивалентной заменой h318A в SED, проявляющей активность дикого типа как в пролиферации in vitro, так и в цитотоксичности Т-клеток (14).При SED замена h318 влияет только на способность образовывать цинк-зависимые гомодимеры (14, 21). Способность SEH гомодимеризоваться в присутствии цинка исследовали с помощью сшивающих агентов и последующего анализа продукта в SDS-PAGE. В отличие от SED, SEH не проявлял какой-либо способности образовывать гомодимерные продукты в этих условиях (данные не показаны), что указывает на несколько иную биологическую функцию D203 в SEH.

    ФИГУРА 2.

    Пролиферация МКПК человека in vitro.Клетки стимулировали в течение 72 часов, и пролиферацию измеряли по включению [ 3 H]тимидина после 4-часового импульса. Показаны данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

    Таблица I.

    Биологические эффекты замены аланина в SEH и SEA

    Способность SEH wt и его замещенных вариантов индуцировать SAg-зависимую клеточную цитотоксичность путем нацеливания SEH-реактивных ЦТЛ человека на клетки MHC класса II + Raji измеряли в 4-часовом анализе высвобождения 51 Cr (фиг.3⇓ А ). SEH вызывает сильную цитотоксичность со значением EC 50 около 1 пМ. Варианты SEH, SEH D167A и SEH D203A , демонстрируют пониженную способность индуцировать цитотоксичность со значениями EC 50 (таблица I⇑) того же порядка эффективности, что и результаты, полученные при пролиферации РВМС. Однако SEH D208A , по-видимому, в меньшей степени влияет на индукцию цитотоксического эффекта. Перекрестная реактивность наблюдается между SEA- и SEH-реактивными ЦТЛ человека, демонстрируя, что SEH и SEA имеют некоторую общую специфичность TCR Vβ (фиг.3⇓, А и В ).

    РИСУНОК 3.

    SAg-зависимая клеточная цитотоксичность в отношении клеток MHC класса II + Raji была проанализирована в 4-часовом анализе высвобождения 51 Cr с использованием стимулированного SEH ( A ) или стимулированного SEA ( B ) человека. Линия Т-клеток как эффекторные клетки. Показаны данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

    Высокая биологическая активность была также достигнута с помощью слитого белка C215Fab-SEH как в отношении пролиферации in vitro, так и в отношении цитотоксичности Т-клеток (данные не показаны), что демонстрирует, что SE, хотя и слитый с Fab-меткой, сохраняет свою биологическую функцию.Это имеет значение для экспериментов, описанных ниже.

    SEH демонстрирует зависимое от цинка связывание с MHC класса II

    SEA и родственные SED и SEE обладают способностью связывать цинк (10, 14, 19, 20), и координация цинка имеет решающее значение для эффективного связывания этих SE с MHC класса II (17, 18, 19, 20, 21). ). Выравнивание последовательностей SEH с SEA, SED и SEE выявляет консервативный мотив связывания цинка в С-концевом домене SEH, состоящем из D167, h306 и D208 (фиг.1⇑). Проявляет ли SEH цинк-зависимое взаимодействие с MHC класса II, исследовали с помощью модифицированного анализа ELISA (29). Планшеты, покрытые плазматическими мембранами клеток Raji, экспрессирующих MHC класса II, инкубировали с SE в присутствии или в отсутствие цинка (1 мкМ Zn 2+ и 2 мкМ ЭДТА соответственно). В соответствии с SEA и SED, SEH показывает зависимость от цинка для его связывания MHC класса II (рис. 4⇓). SEB не проявляет какой-либо потребности в цинке для связывания MHC класса II, результат, ожидаемый из-за отсутствия мотива связывания цинка в SEB.

    РИСУНОК 4.

    Влияние цинка на взаимодействие между СЭ и МНС класса II. СЭ инкубировали в присутствии или в отсутствие цинка в чашках, покрытых плазматическими мембранами клеток Раджи. Связывание биотинилированных СЭ с МНС класса II выявляли с помощью фермента, конъюгированного со стрептавидином. Показаны данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

    При использовании плазматических мембран, приготовленных из RJ 2.2, не наблюдалось связывания SE.5, MHC II-отрицательная клеточная линия, полученная из клеток Raji (данные не показаны).

    SEH представляет собой связывающее вещество с высоким сродством к MHC класса II

    .

    Для изучения взаимодействия между SEH и MHC класса II использовался однородный SPA в режиме реального времени. C215Fab в слиянии с SEH wt , SEA wt или SEH D208A прикрепляли через фрагмент Fab к сцинтилляционным шарикам, покрытым антимышиными Ig Ab. Эти шарики смешивали с экспрессирующими МНС класса II клетками, метаболически меченными [ 3 H]лейцином.При взаимодействии СЭ с МНС класса II гранулы и меченые клетки оказываются в непосредственной близости, что позволяет передавать энергию радиоактивного распада на клетках в сигнал светового излучения. Кривые насыщения показывают, что SEH связывается с MHC класса II по меньшей мере в 4 раза более высокой аффинностью по сравнению с SEA wt при использовании либо DR1- и DR4-трансфицированных клеточных линий, либо клеток Raji в качестве клеток, экспрессирующих MHC класса II (рис. 5⇓, А–С ). Конкурентные эксперименты, описанные ниже, которые включают SE без C215Fab-метки, показывают стехиометрию, близкую к 1:1, таким образом, исключая вклад фрагмента Fab.Самая высокая аффинность между SEH и MHC класса II, B max1/2 ~ 0,5 нМ, была получена с клетками Raji, экспрессирующими DR10 и DR17 среди других молекул MHC класса II. Аффинность SEA к клеткам Raji была рассчитана как 1,9 нМ. Кроме того, при использовании клеточных линий, трансфицированных специфическими молекулами HLA-DR, SEH демонстрировал более высокую аффинность MHC класса II, чем SEA. Аффинность SEH и SEA к клеткам DAP, трансфицированным DR1, составляла 1,1 и 9 нМ соответственно. При использовании клеток CHO, трансфицированных DR4, SEH и SEA связываются с этими клетками с аффинностью 2.7 и 15 нМ соответственно.

    РИСУНОК 5.

    Характеристики связывания для взаимодействия слитых белков C215Fab-SE с MHC класса II с использованием SPA. Гранулы SPA, покрытые антимышиными Ig Ab, связываются с Fab-частью слитого белка C215Fab-SE, который, в свою очередь, взаимодействует с MHC класса II на поверхности клеток, меченных [ 3 H]лейцином. В качестве Клетки, экспрессирующие МНС класса II.Показаны данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

    Для исследования прямых эффектов аминокислотной замены в предполагаемом мотиве связывания цинка в эксперименты по связыванию также был включен C215Fab-SEH D208A . Со всеми клеточными линиями, экспрессирующими МНС класса II, C215Fab-SEH D208A демонстрирует примерно 75-кратное снижение аффинности по сравнению с C215Fab-SEH wt .

    Связывание не наблюдалось, когда в аналогичных клетках отсутствовала экспрессия MHC класса II (родительские клетки CHO вместе с Ltk и RJ 2.2,5 клетки) (данные не показаны), демонстрируя, что связывание специфично для МНС класса II.

    SEH связывается с β-цепью МНС класса II

    Чтобы охарактеризовать связывание SEH с MHC класса II, мы исследовали способность SEB wt , SEA wt и аланин-замещенных вариантов SEA ингибировать связывание C215Fab-SEH wt с клетками, экспрессирующими DR1. . Использовали тот же анализ связывания, основанный на сцинтилляционной близости, как описано ранее.Различные концентрации SE без C215Fab-метки позволяли конкурировать с 2 нМ C215Fab-SEH wt для определения концентраций, приводящих к 50% ингибированию (IC 50 ). Сам SEH wt оказался наиболее эффективным конкурентом (IC 50 ~ 2,1 нМ) (рис. 6⇓ A ). Необходим 275-кратный избыток SEA wt для ингибирования связывания SEH с MHC класса II в той же степени (IC 50 ~ 570 нМ). Кроме того, SEH оказался примерно в 6 раз более сильным конкурентом, чем сам SEA, при исследовании способности ингибировать связывание MHC класса II с C215Fab-SEA в том же анализе (данные не показаны).Опять же, это демонстрирует, что SEH связывается с MHC класса II с более высокой аффинностью, чем SEA. Тот факт, что SEH и SEA конкурируют за связывание, ясно демонстрирует, что SEH и SEA имеют близкородственные сайты связывания на MHC класса II. Большой избыток SEA, необходимый для ингибирования связывания MHC класса II с SEH (в 275 раз), по сравнению с умеренной разницей в аффинности (в 4 раза), указывает на то, что сайты связывания лишь частично перекрываются.

    РИСУНОК 6.

    Конкуренция неслитых SE с C215Fab-SEH дикого типа или D208A за взаимодействие с клетками, экспрессирующими MHC класса II.SPA использовали путем иммобилизации слитых белков C215Fab-SE на шариках SPA, покрытых антимышиными Ig Ab, в присутствии клеток, меченных [ 3 H]лейцином, и конкурирующих SE. Ингибирование SEH wt , SEA wt и SEB wt вместе с аланин-замещенными вариантами SEH и SEA для связывания 2 нМ C215Fab-SEH wt с HLA-DR1 wt () , от 20 нМ C215Fab-SEH D208A до HLA-DR1 βH81A ( B ), и от 2 нМ C215Fab-SEH wt до HLA-DR1 wt ().B и B 0 указывают на полученное связывание слитого белка C215Fab-SE в присутствии и в отсутствие конкурентов соответственно. Показаны данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

    Взаимодействие между цинк-зависимым сайтом, наблюдаемым в С-концевом домене SEA, и β-цепью MHC класса II имеет большое значение для общего высокоаффинного связывания этого SE с MHC класса II (26, 31, 32). . SEA F47A замещен аланином в ключевом остатке второго сайта связывания MHC класса II в SEA, расположенного в N-концевом домене, и было обнаружено, что он взаимодействует с α-цепью MHC класса II (18, 19, 26). ).Следовательно, считается, что оставшаяся аффинность MHC класса II SEA F47A в основном зависит от взаимодействия с β-цепью MHC класса II. Конкурентные эксперименты показывают, что SEA F47A ингибирует связывание SEH с DR1 со значением IC50 50 , равным 1700 нМ (рис. 6⇑ A и таблица II⇓), и ясно демонстрируют, что SEH также взаимодействует с β-цепью МНС класса II. 3-кратное снижение способности ингибировать связывание SEH по сравнению с SEA wt может указывать на наличие сайта связывания с α-цепью MHC класса II в SEH.Однако это также может быть результатом более низкого общего сродства SEA F47A к MHC класса II.

    Таблица II.

    MHC класса II связывание аланинзамещенных SEH и SEA a

    Замена аланином в положении SEA D227 устраняет способность SEA координировать Zn 2+ и взаимодействовать с β-цепью МНС класса II (18, 19). Следовательно, как SEA D227A , так и SEB wt связываются только с α-цепью МНС класса II.При высоких концентрациях SEB начинает конкурировать со связыванием SEH с MHC класса II, указывая на возможное слабое взаимодействие между SEH и α-цепью MHC класса II (рис. 6⇑ A и таблица II⇑). Поскольку сродство SEA к α-цепи MHC класса II ниже, чем связывание SEB с тем же сайтом, с SEA D227A не достигается ингибирование (рис. 6⇑ A ). Такой же эксперимент проводили с клетками СНО, трансфицированными DR4, обнаруживая почти идентичные паттерны связывания (данные не показаны).

    His в положении 81 β-цепи MHC класса II имеет решающее значение для связывания SEA, SED и SEE (21, 26, 31, 32). Этот остаток, вероятно, функционирует как четвертый остаток, координирующий цинк, при взаимодействии SE-MHC класса II. Чтобы изучить связывание SEH с β-цепью MHC класса II, было проведено исследование связывания с трансфектантами клеток DAP, экспрессирующими аланин-замещенную молекулу DR1, несущую аланин в положении 81 β-цепи (DR1 βH81A ). Исследовали связывание C215Fab-SEH wt , -SEA wt и -SEH D208A с DR1 βH81A и рассчитывали кажущуюся аффинность каждого SE.Как показано ранее для SEA wt (26), C215Fab-SEA wt не обнаруживал связывания с DR1 βH81A (фиг. 5⇑ D ). Сродство C215Fab-SEH wt к DR1 βH81A было примерно в 20 раз снижено ( B max1/2 ~ 23 нМ) по сравнению с DR1 wt . Оставшееся взаимодействие ясно указывает на дополнительное связывание SEH с MHC класса II. Интересно, что C215Fab-SEH D208A демонстрирует такое же хорошее связывание, как и C215Fab-SEH wt , с DR1 βH81A , что указывает на взаимную зависимость между остатками D208 в SEH и H81 в β-цепи МНС класса II при взаимодействии.Небольшая разница в аффинности между C215Fab-SEH wt и C215Fab-SEH D208A , вероятно, незначительна (разница в B max1/2 меньше, чем в 2 раза).

    Для дальнейшего выяснения существования дополнительного связывания MHC класса II в SEH, помимо его взаимодействия через βH81, был проведен конкурентный анализ с использованием клеток DAP, трансфицированных DR1 βH81A , и C215Fab-SEH D208A . При фиксированной концентрации C215Fab-SEH D208A (20 нМ) SEH wt и SEH D208A конкурируют с одинаковой способностью, снова демонстрируя, что эти два SE одинаково хорошо связываются с DR1 β bH81A Инжир.6⇑ B ). Ни белок дикого типа, ни аланинзамещенные варианты SEA не были способны ингибировать связывание C215Fab-SEH D208A , хотя аффинность этого SE к DR1 βH81A снижена в 20 раз по сравнению с SEH wt для DR1 вес. . По аналогии с экспериментом с использованием DR1 wt , некоторое ингибирование наблюдается с SEB wt при высоких концентрациях (рис. 6⇑ B ), что дополнительно указывает на присутствие SEH, связывающегося с α-цепью MHC класса II.

    Аминокислотные остатки D167, D203 и D208 участвуют в связывании SEH с МНС класса II

    Исследовали способность SEH D167A , SEH D203A и SEH D208A конкурировать за связывание C215Fab-SEH wt с клетками DAP-DR1, чтобы охарактеризовать С-концевое связывание SEH с MHC класса II. . Все три варианта SEH продемонстрировали явно сниженное связывание MHC класса II по сравнению с SEH wt (фиг.6⇑ C и Таблица II⇑). Эффект замены D208A был наиболее выражен при 5000-кратном снижении связывания МНС класса II, тогда как более умеренный эффект был получен для D167A и D203A (снижение связывания в 35 и 22 раза соответственно). Следовательно, остатки D167, D203 и D208 все участвуют во взаимодействии с МНС класса II. Остатки D167 и D208 эквивалентны двум Zn 2+ -координирующим остаткам в SEA, SED и SEE, которые важны для способности этих SE образовывать сайт связывания β-цепи MHC класса II (18, 19, 20, 21).Пониженная связывающая активность SEH D167A и SEH D208A указывает на аналогичную функцию этих аминокислотных остатков в SEH. Напротив, остаток D203 в SEH, аналогичный h318 в SED, участвующем в гомодимеризации, по-видимому, непосредственно участвует в связывании MHC класса II.

    Обсуждение

    SE представляют собой группу SAg, демонстрирующих несколько режимов связывания с MHC класса II, которые обеспечивают активацию Т-клеток в различных условиях. Чтобы понять биологические функции SE, необходимо охарактеризовать их взаимодействие с MHC класса II и биологические эффекты этих взаимодействий.Данные, представленные в этой работе, показывают, что SEH связывается с HLA-DR с высокой аффинностью. В нашей серии экспериментов SEH связывается как с DR1-, так и с DR4-трансфицированными клетками, а также с клетками Raji с аффинностью в низком наномолярном диапазоне ( B max1/2 ≤ 3 нМ). Это самое сильное связывание, когда-либо измеренное между SE и MHC класса II, и предполагает, что SEH разделяет предпочтение SEA, SEB, SED, SEE и TSST-1 для изотипа HLA-DR человеческого MHC класса II (33, 34). ). Более высокое сродство SEH к MHC класса II может также позволить SEH взаимодействовать с более широким спектром различных молекул MHC класса II.Биологическую значимость различной аффинности связывания SEs для MHC класса II следует рассматривать в контексте взаимодействия с взаимодействием TCR-SE. Повышенное сродство SE к MHC класса II может компенсировать его слабое сродство к TCR (35). Кроме того, тройной комплекс MHC класса II-SE-TCR также может быть стабилизирован прямым взаимодействием TCR-MHC класса II (36, 37). Однако значение этого взаимодействия может различаться в зависимости от сродства между SE и TCR (35, 36, 37).Сложность этого взаимодействия иллюстрирует SEH, который, несмотря на то, что его сродство к MHC класса II выше, индуцирует ответы Т-клеток, сравнимые с SEA.

    Взаимодействие SEA, SED и SEE с β-цепью MHC класса II придает этим SE способность связывать MHC класса II с более высокой аффинностью по сравнению с членами подсемейства SEB. В этом исследовании мы ясно демонстрируем, что SEH разделяет способность SEA, SED и SEE взаимодействовать с β-цепью MHC класса II.Связывание SEH wt с DR1 wt ингибируется SEA F47A , что свидетельствует о том, что SEH и SEA, по крайней мере частично, перекрываются в их сайтах связывания с β-цепью MHC класса II. Кроме того, SEH демонстрирует пониженную аффинность к DR1 βH81A по сравнению с DR1 wt , что убедительно указывает на важность этого остатка β-цепи для взаимодействия SEH-MHC класса II. Однако при СЭГ эффект замены βH81A в DR1 далеко не так выражен, как при СЭА, при котором связывание с DR1 отменено.Это указывает на дополнительное взаимодействие между SEH и MHC класса II и на то, что роль βH81 в качестве контактного остатка в MHC класса II имеет меньшее значение. Также показано, что остаток D208 в SEH напрямую зависит от βH81, поскольку SEH D208A связывается с той же аффинностью, что и SEH wt , с DR1 βH81A . Взаимодействие между SEH D208A и DR1 wt показывает 75-кратное снижение аффинности по сравнению с SEH wt . Эти данные коррелируют с влиянием SEH D208A на активность in vitro, также демонстрируя менее нарушенную функцию по сравнению с эквивалентно замещенным SEA.Поэтому разумно предположить, что сайт связывания в SEH включает другие аминокислотные остатки, которые частично сохраняют связывание с DR1 βH81A .

    Взаимодействие с цинком имеет большое значение для СЭ подсемейства СЭА. Имеются данные о том, что Zn 2+ находится между SEA и DR1 (19) и что отсутствие Zn 2+ значительно снижает связывание SEA, SED и SEE с MHC класса II (рис. 4⇑) (17). , 19, 20), а также их способность образовывать кластеры МНС класса II на клеточной поверхности (21, 38).Кроме того, Zn 2+ опосредует гомодимеризацию SED, что может привести к различной стехиометрии между молекулами SED и MHC класса II. SEH также демонстрирует зависимое от цинка взаимодействие с MHC класса II. Для SEA было показано, что все три остатка в мотиве связывания цинка (h287, h325 и D227) непосредственно координируют Zn 2+ (19). Потеря связывания цинка при SEA прямо коррелирует со снижением сродства MHC класса II и снижением пролиферативной активности (17, 19, 20). Выравнивание аминокислотной последовательности SEH с родственными SE показывает наличие цинксвязывающего мотива (фиг.1⇑). Важность ионов цинка для взаимодействия SEH-MHC класса II была продемонстрирована в анализе связывания с использованием клеточных мембран из клеток Raji, прикрепленных к планшету для ELISA. Добавление цинка увеличивало связывание SEH, в то время как добавление связующего хелатного комплекса (например, ЭДТА) заметно ухудшало связывание в анализе. Обе аминокислоты D167 и D208 являются потенциальными Zn 2+ -связывающими остатками в SEH. Замена этих остатков аланином снижает связывание SEH с МНС класса II, а также ухудшает биологическую активность in vitro.Разумно полагать, что D167 и D208 в SEH вместе с H81 в β-цепи MHC класса II вносят вклад в координацию одного иона цинка и тем самым в связывание SEH с MHC класса II. Используя ион Zn 2+ для связывания с широко консервативным βH81 в MHC класса II, SEH будет эффективно использовать полиморфную β-цепь для связывания. Однако координация иона Zn 2+ через βH81 не объясняет, почему хелатирование цинка так сильно ухудшает связывание SEH, в то время как замена βH81A оказывает лишь скромное влияние на сродство SEH к MHC класса II.Возможно, что кроме βH81 в молекуле МНС класса II существуют и другие координирующие цинк остатки. Также неизвестно, способен ли пептид, связанный с МНС класса II, координировать цинк или нет. Кроме того, нельзя исключить, что взаимодействие СЭГ с ионом Zn 2+ приводит к аллостерическому изменению структуры молекулы СЭГ, что, в свою очередь, может влиять на способность СЭГ взаимодействовать с МНС класса II.

    Следовательно, связывание через βH81 — не единственное взаимодействие между SEH и β-цепью MHC класса II.Замена аланином D203 в SEH снижает связывание с MHC класса II, а также индукцию пролиферации PBMC и цитотоксичность Т-клеток почти в той же степени, что и D167A в SEH. Однако эквивалентный остаток в SED, h318, влияет только на способность SED к гомодимеризации. В отличие от SED, ковалентное сшивание не показывает гомодимеризацию SEH (данные не показаны). Это демонстрирует уникальную биологическую роль этого остатка в SEH, отличную от роли h318 в SED. Остаток D203, по-видимому, участвует в связывании МНС класса II неизвестным до сих пор образом и может способствовать дополнительному связыванию, наблюдаемому для SEH, с МНС класса II.Заманчиво предположить, что дополнительное связывание SEH с DR1 βH81A зависит от прямого взаимодействия между этим остатком в SEH и β-цепью MHC класса II. Расширение сайтов связывания SEH с MHC класса II можно рассматривать как важную текущую эволюцию SE, направленную на изменение их способности сшивать APC и Т-клетки в различных условиях. СЭ в подсемействе SEB обладают моновалентным связыванием с α-цепью MHC класса II, общим для всех молекул DR. Взаимодействие SEA, SED и SEE с MHC класса II расширено до мультивалентного связывания за счет использования полиморфной β-цепи.Дополнительное уникальное связывание SEH является дальнейшим расширением взаимодействия MHC класса II и может представлять собой дальнейшую адаптацию SEH для преодоления изменчивости хозяина MHC класса II. Более того, есть доказательства того, что пептиды, ассоциированные с MHC класса II, влияют на презентацию SAg Т-клеткам (24, 39), а различное связывание SEH может приводить к меньшему влиянию пептида. Усиленное взаимодействие также может быть способом преодоления различий в MHC класса II между видами.

    Все исследованные SE обладают общей способностью взаимодействовать с α-цепью МНС класса II.Данные, представленные в этом исследовании, предполагают, что такое взаимодействие также присутствует между SEH и MHC класса II, несмотря на неблагоприятные аминокислотные различия в ключевых остатках. Остаток лизина в положении 39 в α-цепи MHC класса II является важным остатком для взаимодействия с SE (24, 26) и образует солевой мостик с E67 в SEB, а также, вероятно, взаимодействует с аналогичным D70 в SEA (17). , 22). При использовании клеток DAP, трансфицированных DR1 αK39E в SPA, аффинность C215Fab-SEH wt снижается примерно в 2 раза по сравнению с DR1 wt (данные не показаны), что еще больше подтверждает указание на взаимодействие между SEH и α-цепь МНС класса II.E67 в SEB и D70 в SEA соответствуют K56 в SEH, аминокислоте, которая не способствует прямому взаимодействию с K39 в α-цепи MHC класса II. Следовательно, во взаимодействии должны участвовать другие регионы SEH. Эволюцию SEs с разными сайтами связывания с MHC класса II можно рассматривать как стратегию для бактерий, продуцирующих SE, для удовлетворения изменчивости хозяина и, таким образом, увеличения их способности к выживанию. Однако вклад этого взаимодействия в общее сродство к МНС класса II должен быть незначительным.Для достижения какого-либо ингибирования при любом связывании SEH необходим 1000-кратный избыток SEB, что указывает на то, что N-концевой сайт в SEH имеет слабое сродство к MHC класса II, аналогичное аналогичному сайту в SEA. Тем не менее, второй сайт связывания, хотя и с низким сродством, все же имеет значение для биологической функции SEH. Мультивалентное связывание позволяет SEH взаимодействовать с MHC класса II различными способами. Например, было показано, что две молекулы SEA могут образовывать тримерный комплекс с одной молекулой DR в растворе (40).Более того, SEA, SED и SEE способны сшивать MHC класса II с активацией APC в результате (21, 38). Следовательно, поливалентное связывание SEH повысит его эффективность и облегчит взаимодействие SEH с большим количеством молекул различных классов MHC. Существование множества сайтов связывания с различной аффинностью как на SEH, так и на MHC класса II также предполагает, что стехиометрия комплекса может варьироваться в зависимости от концентраций. Различные способы связывания SEH с MHC класса II будут влиять на тип комплекса, который будет взаимодействовать с TCR.Это может расширить специфичность TCR Vβ, а также повысить активность SEH. Кроме того, из-за его более высокой аффинности связывания MHC класса II SEH может быть способен связывать молекулы MHC класса II также на клетках, экспрессирующих только низкие уровни рецептора. Это позволит SEH взаимодействовать и активировать более широкий спектр APC на разных стадиях активации.

    Потребуются дальнейшие исследования, чтобы объяснить сложное взаимодействие SEH с MHC класса II. Структурная информация из недавно разрешенной кристаллической структуры SEH (Maria Håkansson et al., рукопись в процессе подготовки) значительно облегчит понимание и интерпретацию возможных областей контакта в SEH с MHC класса II.

    Благодарности

    Мы благодарим Э. Эрландссона, И. Андерссона, Х. Арозениуса и А. Каваллина за квалифицированную техническую помощь, а также доктора Р.-П. Sékaly за предоставление трансфектантов DAP. Мы благодарны докторам. Г. Форсбергу и В. Эйвери за полезные обсуждения.

    Сноски

    • ↵1 Корреспонденцию и запросы на перепечатку направляйте Хелен Нильссон, Active Biotech Research AB, Box 724, S-220 07 Lund, Sweden.Адрес электронной почты: helen.nilsson{at}activebiotech.com

    • ↵2 Сокращения, используемые в этой статье: SAg, суперантиген; B max1/2 , половина максимума насыщения; CHO, яичник китайского хомячка; SE, стафилококковый энтеротоксин; SEA/B/C/D/E/G/H/I/J, стафилококковый энтеротоксин A/B/C/D/E/G/H/I/J; SPA, сцинтилляционный анализ близости; TSST-1, токсин-1 синдрома токсического шока; вес, дикий тип.

    • Поступила в редакцию 5 мая 1999 г.
    • Принято 23 сентября 1999 г.
    • Copyright © 1999 Американской ассоциации иммунологов

    Ссылки

    1. Деллабона, П., Дж. Пеку, Дж. Капплер, П. Маррак, К. Бенуа, Д. Матис. 1990. Суперантигены взаимодействуют с молекулами MHC класса II за пределами антигенной бороздки. Сотовый 62: 1115

    2. Чой, Ю.В., А. Герман, Д. ДиДжусто, Т.Уэйд, П. Маррак, Дж. Капплер. 1990. Остатки вариабельной области β-цепи Т-клеточного рецептора, которые взаимодействуют с суперантигенами токсина S. aureus . Природа 346: 471

    3. Маррак, П., Дж. Капплер. 1990. Стафилококковые энтеротоксины и их родственники. Наука 248: 705

    4. Винеке, А. А., Д. Робертс, Р. Дж. Гилберт. 1993. Стафилококковое пищевое отравление в Соединенном Королевстве, 1969–1990 годы.Эпидемиол. Заразить. 110: 519

    5. Рен, К., Дж. Д. Баннан, В. Панчоли, А. Л. Чунг, Дж. К. Роббинс, В. А. Фишетти, Дж. Б. Забриски. 1994. Характеристика и биологические свойства нового стафилококкового экзотоксина. Дж. Эксп. Мед. 180: 1675

    6. Су, Ю. К., А. К. Вонг. 1995. Идентификация и очистка нового стафилококкового энтеротоксина, H. Appl. Окружающая среда. микробиол.61: 1438

    7. Мансон, С. Х., М. Т. Тремейн, М. Дж. Бетли, Р. А. Уэлч. 1998. Идентификация и характеристика стафилококковых энтеротоксинов типов G и I из Staphylococcus aureus . Заразить. Иммун. 66: 3337

    8. Чжан С., Дж. Дж. Яндоло, Г. К. Стюарт. 1998. Плазмида энтеротоксина D Staphylococcus aureus кодирует вторую детерминанту энтеротоксина (sej).ФЭМС микробиол. лат. 168: 227

    9. Шад Э. М., Зайцева И., Зайцев В. Н., Дольстен М., Калланд Т., Шливерт П. М., Олендорф Д. Х., Свенссон Л. А. 1995. Кристаллическая структура суперантигена стафилококкового энтеротоксина типа А. EMBO J. 14: 3292

    10. Сандстрем, М., Д. Халлен, А. Свенссон, Э. Шад, М. Дольстен, Л. Абрамсен. 1996. Сокристаллическая структура стафилококкового энтеротоксина типа А с Zn 2+ at 2.Разрешение 7 Å: последствия для связывания главного комплекса гистосовместимости класса II. Дж. Биол. хим. 271: 32212

    11. Папагеоргиу, А.С., Х.С. Трантер, К.Р. Ачарья. 1998. Кристаллическая структура микробного суперантигена стафилококкового энтеротоксина B с разрешением 1,5 Å: значение для распознавания суперантигена молекулами MHC класса II и рецепторами Т-клеток. Дж. Мол. биол. 277: 61

    12. Сваминатан, С., В. Фьюри, Дж. Плетчер, М. Сакс. 1992. Кристаллическая структура стафилококкового энтеротоксина В, суперантигена. Природа 359: 801

    13. Папагеоргиу, А.С., К.Р. Ачарья, Р. Шапиро, Э.Ф. Пассалаква, Р.Д. Брем, Х.С. Трантер. 1995. Кристаллическая структура суперантигена энтеротоксина C2 из Staphylococcus aureus показывает сайт связывания цинка. Структура 3: 769

    14. Сандстрем, М., Л. Абрамсен, П. Антонссон, К. Мехиндате, В. Мурад, М. Дольстен. 1996. Кристаллическая структура стафилококкового энтеротоксина типа D обнаруживает Zn 2+ -опосредованную гомодимеризацию. ЕМБО Дж. 15: 6832

    15. Ачарья, К. Р., Э. Ф. Пассалаква, Э. Ю. Джонс, К. Харлос, Д. И. Стюарт, Р. Д. Брем, Х. С. Трантер. 1994. Структурная основа действия суперантигена, выведенная из кристаллической структуры токсина-1 синдрома токсического шока. Природа 367: 94

    16. Прасад, Г.С., К.А. Эрхарт, Д.Л. Мюррей, Р.П. Новик, П.М. Шливерт, Д.Х. Олендорф. 1993. Структура токсина синдрома токсического шока 1. Биохимия 32: 13761

    17. Ульрих, Р. Г., С. Бавари, М. А. Олсон. 1995. Стафилококковые энтеротоксины А и В имеют общий структурный мотив для связывания молекул главного комплекса гистосовместимости класса II. Нац. Структура биол. 2: 554

    18. Абрамсен, Л., М. Дольстен, С. Сегрен, П. Бьорк, Э. Йонссон, Т. Калланд. 1995. Характеристика двух различных сайтов связывания MHC класса II в суперантигене стафилококкового энтеротоксина A. EMBO J. 14: 2978

    19. Хадсон, К. Р., Р. Э. Тидеманн, Р. Г. Урбан, С. К. Лоу, Дж. Л. Стромингер, Дж. Д. Фрейзер. 1995. Стафилококковый энтеротоксин А имеет два кооперативных сайта связывания на главном комплексе гистосовместимости класса II. Дж. Эксп. Мед. 182: 711

    20. Фрейзер, Дж.Д., Р. Г. Урбан, Дж. Л. Строминджер, Х. Робинсон. 1992. Цинк регулирует функцию двух суперантигенов. проц. Натл. акад. науч. США 89: 5507

    21. Аль-Даккак Р., К. Мехиндате, Ф. Дамдуми, П. Этонг-Майер, Х. Нильссон, П. Антонссон, М. Сандстром, М. Долстен, Р. П. Секали, В. Мурад. 1998. Стафилококковый энтеротоксин D представляет собой беспорядочный суперантиген, предлагающий несколько способов взаимодействия с рецепторами MHC класса II. Дж.Иммунол. 160: 225

    22. Ярдецки, Т. С., Дж. Х. Браун, Дж. К. Горга, Л. Дж. Стерн, Р. Г. Урбан, Ю. И. Чи, К. Штауффахер, Дж. Л. Стромингер, Д. К. Уайли. 1994. Трехмерная структура молекулы гистосовместимости класса II человека в комплексе с суперантигеном. Природа 368: 711

    23. Ким, Дж., Р. Г. Урбан, Дж. Л. Стромингер, Д. К. Уайли. 1994. Токсин-1 синдрома токсического шока в комплексе с главной молекулой гистосовместимости класса II HLA-DR1.Наука 266: 1870

    24. Тибодо, Дж., И. Клотье, П. М. Лавуа, Н. Лабрек, В. Мурад, Т. Жардецки, Р. П. Секали. 1994. Подмножества молекул HLA-DR1, определяемые связыванием SEB и TSST-1. Наука 266: 1874

    25. Чинтагумпала, М. М., Дж. А. Моллик, Р. Р. Рич. 1991. Стафилококковые токсины связываются с разными участками HLA-DR. Дж. Иммунол. 147: 3876

    26. Тибодо, Дж., М. Дольстен, И. Клотье, П. М. Лавуа, П. Бьорк, Ф. Мишель, К. Левей, В. Мурад, Т. Калланд, Р. П. Секали. 1997. Молекулярная характеристика и роль в Т-клеточной активации стафилококкового энтеротоксина А, связывающегося с α-цепью HLA-DR. Дж. Иммунол. 158: 3698

    27. Хо, С. Н., Х. Д. Хант, Р. М. Хортон, Дж. К. Пуллен, Л. Р. Пиз. 1989. Сайт-направленный мутагенез путем удлинения перекрытия с использованием полимеразной цепной реакции. Гена 77: 51

    28. Розендаль, А., К. Кристенссон, К. Рисбек и М. Долстен. 1999. Анализы цитотоксичности Т-клеток для изучения функционального взаимодействия между суперантигеном SEA и TCR. В Бактериальные токсины Методы и протоколы . О. Холст, изд. Humana Press, Тотова, в печати .

    29. Фатер, К. А., К. Рейд, Л. М. Бартл, В. С. Гольдмахер. 1995. Характеристика связывания антител с антигенами клеточной поверхности с использованием анализа на плазматических мембранах.Анальный. Биохим. 224: 39

    30. Massague, J. 1987. Очистка трансформирующего фактора роста типа α из трансформированных клеток. Методы Энзимол. 146: 103

    31. Карп, Д. Р., Э. О. Лонг. 1992. Идентификация остатков β-цепи HLA-DR1, критических для связывания стафилококковых энтеротоксинов A и E. J. Exp. Мед. 175: 415

    32. Герман А., Н. Лабрек, Дж. Тибодо, П. Маррак, Дж. В. Капплер, Р. П. Секали. 1991. Идентификация сайта связывания суперантигена стафилококкового энтеротоксина А в домене β1 человеческого антигена гистосовместимости HLA-DR. проц. Натл. акад. науч. США 88: 9954

    33. Херрманн Т., Р. С. Акколла, Х. Р. Макдональд. 1989. Различные стафилококковые энтеротоксины преимущественно связываются с различными изотипами главного комплекса гистосовместимости класса II.Евро. Дж. Иммунол. 19: 2171

    34. Моллик, Дж. А., М. Чинтагумпала, Р. Г. Кук, Р. Р. Рич. 1991. Стафилококковая экзотоксиновая активация Т-клеток: роль аффинности связывания экзотоксин-MHC класса II и изотипа класса II. Дж. Иммунол. 146: 463

    35. Ледер Л., А. Ллера, П. М. Лавуа, М. И. Лебедева, Х. Ли, Р. П. Секалы, Г. А. Бохач, П. Дж. Гар, П. М. Шливерт, К. Карьялайнен, Р.А. Мариуцца. 1998. Мутационный анализ связывания стафилококковых энтеротоксинов B и C3 с β-цепью Т-клеточного рецептора и главным комплексом гистосовместимости класса II. Дж. Эксп. Мед. 187: 823

    36. Лабрек, Н., Ж. Тибодо, В. Мурад, Р. П. Секали. 1994. Взаимодействие Т-клеточного рецептора и главного комплекса гистосовместимости класса II необходимо для ответа Т-клеток на бактериальные суперантигены. Дж. Эксп. Мед. 180: 1921

    37. Декхут, А.М., Ю. Чиен, М. А. Блэкман, Д. Л. Вудленд. 1994. Доказательства функционального взаимодействия между β-цепью главного комплекса гистосовместимости класса II и α-цепью Т-клеточного рецептора во время распознавания бактериального суперантигена. Дж. Эксп. Мед. 180: 1931

    38. Мехиндате, К., Дж. Тибодо, М. Долстен, Т. Калланд, Р. П. Секали, В. Мурад. 1995. Перекрестное связывание молекул главного комплекса гистосовместимости класса II суперантигеном стафилококкового энтеротоксина А является необходимым условием для экспрессии гена воспалительного цитокина.Дж. Эксп. Мед. 182: 1573

    39. Вен Р., Г. А. Коул, С. Сурман, М. А. Блэкман, Д. Л. Вудленд. 1996. Пептиды, ассоциированные с главным комплексом гистосовместимости класса II, контролируют презентацию бактериальных суперантигенов Т-клеткам. Дж. Эксп. Мед. 183: 1083

    40. Тидеманн, Р. Э., Р. Дж. Урбан, Дж. Л. Стромингер, Дж. Д. Фрейзер. 1995. Выделение тримеров HLA-DR1 (стафилококковый энтеротоксин А)2 в растворе.проц. Натл. акад. науч. США 92: 12156

    Различные требования к экспрессии и стратегии восстановления для BEST1 мутаций потери и приобретения функции

    В этом исследовании мы сравнили влияние 10 мутаций BEST1 , полученных от пациентов, включая одну аутосомно-рецессивную мутацию, шесть аутосомно-доминантных мутаций с потерей функции и три аутосомно-доминантных мутации с усилением функции, на активность канала. BEST1 в временно трансфицированных клетках HEK293.Хотя рецессивные мутации и мутации с приобретением функции действительно демонстрировали ожидаемое рецессивное и доминантное поведение соответственно, аутосомно-доминантные мутации с потерей функции доминировали над WT BEST1 только в лучшем соотношении 4:1, но не в каноническом 1 отношение :1 (рис. 1). Поскольку большинство из более чем 250 задокументированных BEST1 болезнетворных мутаций являются аутосомно-доминантными и демонстрируют потерю функции при тестировании in vitro , наши результаты указывают на важную роль аллель-специфического эпигенетического контроля в развитии бестрофинопатий.В подтверждение этого открытия, несбалансированная транскрипция двух эндогенных аллелей BEST1 была обнаружена в донорских иПСК-РПЭ и нативных клетках РПЭ (таблица 1), что согласуется с предыдущим наблюдением, согласно которому BEST1 является одним из наследственных аллелей сетчатки. гены болезни с AEI в транскриптоме сетчатки человека (Llavona et al., 2017).

    Было доказано, что

    AEI является обычным явлением у млекопитающих (Yan et al., 2002b). Исследование 602 генов человека на основе массива SNP показало, что более половины генов демонстрируют AEI (Lo et al., 2003), в то время как отдельное исследование, анализирующее транскриптом мыши, показало, что ~ 20% генов предрасположены к AEI тканеспецифическим образом (Pinter et al., 2015). Более того, AEI соматических мутаций хорошо задокументирован в контексте рака (Bielski et al., 2018; Rhee et al., 2017; Yan et al., 2002a; Bielski and Taylor, 2021), представляя собой важный механизм онкогенеза. . Однако значение AEI при моногенных заболеваниях плохо изучено. Насколько нам известно, связь между наследственной миссенс-мутацией и ОКИ в патогенезе еще не установлена.Наши результаты показывают, что бестрофинопатии, вызванные аутосомно-доминантными мутациями BEST1 , могут служить парадигмой для устранения влияния AEI на менделевские расстройства.

    Традиционно BEST1 аутосомно-доминантные мутации идентифицируют, когда мутация присутствует только в одном из двух BEST1 аллелей у пациента с бестрофинопатией. Однако эта классификация принимает во внимание только дозу геномного гена, но не учитывает уровень аллельной транскрипции/экспрессии.Все шесть аутосомно-доминантных мутаций потери функции, протестированных в этом исследовании, ведут себя рецессивно в клетках HEK293 при совместной экспрессии с WT BEST1 в соотношении 1:1, тогда как значительно сниженная активность канала BEST1 в клетках iPSC-RPE, полученных от пациентов. связан с более высоким уровнем транскрипции мутантного аллеля по сравнению с аналогом WT, что отражает скорее доминантно-негативный эффект, чем канонический доминантный эффект. Следовательно, мы ожидаем, что часть вызывающих бестрофинопатию мутаций, ранее классифицированных как аутосомно-доминантные, являются де-факто рецессивными и проявляют доминантно-негативный фенотип, когда их экспрессия превышает экспрессию аллеля WT in vivo .Это согласуется с нашим предыдущим выводом о том, что генной аугментации достаточно для спасения BEST1 мутаций с потерей функции независимо от характера их наследования (Ji et al., 2019b), и объясняет неполную пенетрантность и переменную клиническую экспрессивность в пациенты, несущие те же мутации BEST1 (Sodi et al., 2012; Cohn et al., 2011; Arora et al., 2016).

    Внутренняя функциональность BEST1 в качестве CaCC, физиологическая локализация в RPE и патологическая связь с дегенеративными бестрофинопатиями сетчатки убедительно свидетельствуют о том, что BEST1 является первичным CaCC при RPE.В соответствии с этой идеей мы ранее сообщали о незаменимой роли BEST1 в генерации Ca 2+ -зависимых Cl токов в донорских клетках iPSC-RPE (Li et al., 2017). Тем не менее, другие кандидаты, в том числе TMEM16A и TMEM16B, также были предложены в качестве физиологических СаСС в РПЭ свиньи или мыши и клетках ARPE-19, полученных из РПЭ человека (Schreiber and Kunzelmann, 2016; Keckeis et al., 2017). ). Наши результаты для изогенных нокаутных клеток hPSC-RPE показали, что токи Ca 2+ -зависимых Cl были снижены в клетках BEST1 -/- и остались интактными в TMEM16A -/- , , , Клетки TMEM16B -/- или LRRC8A -/- (рис. 3).Следовательно, мы заключаем, что BEST1 является добросовестным CaCC в РПЭ человека.

    Ранее мы создали модель «заболевание в чашке», в которой фибробласты кожи, собранные у носителей различных мутаций BEST1 , были перепрограммированы в линии иПСК, а затем дифференцированы в соответствующие клетки иПСК-РПЭ для функциональных исследований ( Рисунок 3а, рисунок 3—дополнение к рисунку 3а–в; Li et al., 2017; Kittredge et al., 2018). Эта модель на основе iPSC-RPE сохраняет генетический фон пациентов и, таким образом, имеет прямое отношение к заболеваниям сетчатки, связанным с BEST1 , но ограничена доступностью образцов пациентов.Например, некоторые мутации BEST1 встречаются реже, чем другие, и носитель (носители) может не захотеть или не иметь логистической возможности предоставить образец. Здесь мы расширили объем нашей модели «болезни в чашке», основанной на сконструированной линии hPSC (h2-iCas9), которая позволяет удобно вводить желаемые мутации BEST1 с помощью технологии редактирования генома, опосредованной CRISPR/Cas9. , генерируя изогенные линии hPSC, которые можно дифференцировать в изогенные клетки hPSC-RPE (рис. 3–4). Важно отметить, что почти идентичные Ca 2+ -зависимые токи Cl были зарегистрированы для BEST1 WT/WT hPSC-RPE по сравнению с таковыми для BEST1 WT/WT iPSC-RPE (рис. 3а), проверка hPSC-RPE как универсального инструмента для моделирования мутаций BEST1 .

    Поскольку канал BEST1 представляет собой пентамерную сборку, количество мутантных протомеров, необходимых для проявления фенотипа, теоретически может составлять 1, 2, 3, 4 или 5. Интересно, что было задокументировано пять подтипов бестрофинопатий, что подразумевает потенциальную корреляцию между «сила» мутаций и вызванных ими болезней. Подтверждая эту гипотезу, БРА вызывается аутосомно-рецессивными мутациями BEST1 , которые представляют собой «самый слабый» класс, для которого требуется, чтобы пять мутантных протомеров в пентамере канала были фенотипическими (рис. 1h, рис. 1 — дополнение к рисунку 1).С другой стороны, мутации с усилением функции, такие как D203A, I205T и Y236C, представляют собой «самый сильный» класс, который преобладает над WT BEST1 даже при соотношении 1:4 (предположительно, один протомер на канал, рис. 2a–c). и рис. 2 — дополнение к рисунку 1b), хотя остается неясным, связаны ли они конкретно с определенным типом бестрофинопатии. Аутосомно-доминантные мутации с потерей функции, вероятно, представляют «промежуточные» классы, которым требуется 2–4 протомера в канале BEST1 для проявления мутантного фенотипа.Например, шесть мутаций с потерей функции, протестированных в этом исследовании (A10T, R218H, L234P, A243T, Q293K и D302A), могут представлять класс 4-мутантных протомеров, поскольку они являются доминантно-отрицательными только при соотношении 4:1. соотношение с WT в клетках HEK293, в то время как Y85H, R92C, R218S и G299E могут представлять класс(ы) мутантных протомеров 2/3, поскольку ранее было показано, что они доминируют над WT в соотношении 1:1 в Клетки HEK293 (Sun et al., 2002). Однако соотношение эндогенного мутанта BEST1 и молекулы WT в RPE пациентов с бестрофинопатией с аутосомно-доминантными мутациями до сих пор неизвестно из-за отсутствия количественного подхода, позволяющего отличить миссенс-варианты BEST1 от аналога WT на уровне белка.

    Все три мутации с усилением функции BEST1 в этом исследовании демонстрируют сильный доминантный эффект, подавляя WT даже при соотношении 1:4 (рис. 2a–c, рис. 2 — дополнение к рисунку 1b). Это говорит о том, что для эффективной генной аугментационной терапии общий уровень белка WT BEST1, поставляемого как эндогенно, так и экзогенно, должен быть по крайней мере в четыре раза выше, чем у эндогенного мутанта BEST1. Однако мы показали, что даже с промотором CMV, который продуцирует явно более высокий уровень экзогенного белка BEST1 по сравнению с эндогенным BEST1, фенотип с усилением функции у BEST1 I205T/WT и BEST1 Y236C/ Клетки WT hPSC-RPE не могут быть спасены (рис. 4b и e, рис. 4 — дополнение к рисунку 1a).Таким образом, кажется непрактичным спасать BEST1 от мутаций с усилением функции только путем аугментации гена, особенно учитывая, что для клинического применения может потребоваться использование нативного промотора BEST1 , который, по-видимому, не так силен, как промотор CMV. Структурно три мутации с приобретением функции (D203A, I205T и Y236C) расположены в шейке или в непосредственной близости от нее (I76, F80 и F84) или апертуры (I205) канала (рис. 1— дополнение к рисунку 2) и участвуют в открытии по крайней мере одного из этих двух Ca 2+ -зависимых ворот (Ji et al., 2019а; Чжан и др., 2018). Например, мутация I205T, заменяющая громоздкий изолейцин треонином с меньшей боковой цепью в апертуре (рис. 1 — дополнение к рисунку 2), вызывает Ca 2+ -независимую «утечку» из-за увеличения сужения канала ( Рисунок 2b, Рисунок 4a-c; Ji et al., 2019a). Напротив, мутации с потерей функции локализуются в различных областях канала (Ji et al., 2019b).

    Существуют две общие стратегии преодоления сильного доминантного эффекта мутаций с усилением функции: (1) специфическое подавление эндогенного мутантного аллеля и (2) неселективное подавление обоих эндогенных аллелей в сочетании с аугментацией гена WT.Мы применили последний подход в этом исследовании, используя вектор сайленсинга генов на основе CRISPR/Cas9 (BVSi) для подавления эндогенной экспрессии BEST1 (Tsai, 2018). Поскольку геномный локус BEST1 , распознаваемый нашим BVSi, не имеет каких-либо зарегистрированных вызывающих заболевание мутаций или полиморфизмов, этот дизайн BVSi универсально подходит для подавления BEST1 у пациентов с бестрофинопатией, независимо от того, где их мутации расположены в гене. Примечательно, что хотя аугментации одного гена вполне достаточно для спасения мутаций, приводящих к потере функции (Ji et al., 2019b), одновременное подавление эндогенного BEST1 не препятствует функциональному восстановлению. Таким образом, наша комбинированная стратегия замалчивания плюс аугментация потенциально может быть использована для лечения всех бестрофинопатий.

    Знакомство с пангеаром

    Знакомство с пангеаром

    pangaear — это интерфейс поиска данных для Всемирного центра данных PANGEA (https://www.pangaea.de/). Архивы PANGEA опубликовали данные наук о Земле и окружающей среде по следующим темам: сельское хозяйство, атмосфера, биологическая классификация, биосфера, химия, криосфера, экология, рыболовство, геофизика, человеческие измерения, озера и реки, поверхность земли, литосфера, океаны и палеонтология.

    Установка

    Если вы еще не установили его, установите из CRAN:

      install.packages("pangaear")
      

    Или версия для разработчиков:

      devtools::install_github("ropensci/pangaear")
      

    Загрузить пангеар

      библиотека ("пангеар")
      

    Поиск данных

    pg_search — это тонкая оболочка вокруг интерфейса поиска GUI на странице https://www.pangaea.де/. Все, что вы можете сделать там, вы можете сделать здесь.

    Например, запросите термин «вода» с ограничивающей рамкой и верните только три результата.

      pg_search(запрос = 'вода', bbox = c(-124,2, 41,8, -116,8, 46,1), количество = 3)
      
      #> # Набор символов: 3 x 6
    #> оценка дои размер size_measure цитирование дополнение_…
    #>      
    #> 1 20.0 10.1594/PANGAEA.812094 2.00 наборы данных Симонян… Симонян А…
    #> 2 11.0 10.1594/PANGAEA.736010 9.00 наборы данных Archer, … Archer, DE;…
    #> 3 10,9 10,1594/PANGAEA.874893 4152 точки данных Uhlig, C… Uhlig, C; Л…
      

    Полученный data.frame содержит сведения о различных исследованиях, и вы можете использовать DOI (цифровые идентификаторы объектов) для получения данных и метаданных для любых интересующих вас исследований.

    Другой вариант поиска

    Есть еще один вариант поиска с функцией pg_search_es .Это интерфейс к интерфейсу Pangea Elasticsearch. Это обеспечивает очень гибкий интерфейс для поиска данных Pangea, хотя он отличается от того, к чему вы привыкли на веб-сайте Pangea.

      (разрешение <- pg_search_es())
      
      #> # Таблица: 10 x 42
    #> `_ind… `_typ… `_id` `_sc… `_so… `_sour… `_sour… `_so… `_so… `_so… `_so…
    #> *           
    #> 1 панга… панмд 7847… 1.00 2017… 5.00e⁻¹ Оуэнс …  2 panga… panmd 8453… 1.00 2017… 1.10e⁺¹ Maturi…  3 panga… panmd 3806… 1.00 2017… 1.00e⁺¹ König-…  4 panga… panmd 8467… 1.00 2017… 2.00e⁺⁰ Colle …  5 panga… panmd 8467… 1.00 2017… 2.00e⁺⁰ Denn F…  6 panga… panmd 7077… 1.00 2017… 4.91e⁺² Vuille…  7 panga… panmd 67642 1.00 2017… 1.00e⁻² Hebbel…  8 panga… panmd 8373… 1.00 2017… 1.39e⁺⁰ WOCE H…  9 panga… panmd 8469… 1.00 2017… 2.00e⁺⁰ Long C…  10 panga… panmd 8469… 1.00 2017… 2.00e⁺⁰ Tamlyn…  # ... с еще 31 переменной: `_source.agg-author` ,
    #> # `_source.eastBoundLongitude` , `_source.URI` ,
    #> # `_source.agg-pubYear` , `_source.minDateTime` ,
    #> # `_source.agg-geometry` , `_source.xml-thumb` ,
    #> # `_source.agg-mainTopic` <список>, `_source.xml` ,
    #> # `_source.elevationGeocode` , `_source.maxDateTime` ,
    #> # `_source.xml-sitemap` , `_source.agg-topic` ,
    #> # `_source.westBoundLongitude` , `_source.agg-project` ,
    #> # `_source.northBoundLatitude` , `_source.sp-dataStatus` ,
    #> # `_source.sp-hidden` , `_source.agg-location` <список>,
    #> # `_source.internal-source` , `_source.agg-basis` ,
    #> # `_source.southBoundLatitude` , `_source.idDataSet` ,
    #> # `_source.boost` , `_source.agg-device` ,
    #> # `_source.maxElevation` , `_source.parentURI` ,
    #> # `_source.parentIdDataSet` , `_source.oaiSet` ,
    #> # `_source.meanPosition.lat` , `_source.meanPosition.lon` 
      

    Возвращенный data.frame имеет много столбцов. Вы можете ограничить столбцы, возвращаемые параметром source .

    В data.frame есть атрибуты, которые дают вам общее количество найденных результатов, а также максимальный найденный балл.

      атрибутов (разрешение)
      
      #> $имя
    #> [1] "_index" "_type"
    #> [3] "_id" "_score"
    #> [5] "_source.внутренняя отметка даты" "_source.minElevation"
    #> [7] "_source.sf-authortitle" "_source.techKeyword"
    #> [9] "_source.geocodes" "_source.sp-loginOption"
    #> [11] "_source.agg-кампания" "_source.agg-автор"
    #> [13] "_source.eastBoundLongitude" "_source.URI"
    #> [15] "_source.agg-pubYear" "_source.minDateTime"
    #> [17] "_source.agg-геометрия" "_source.xml-thumb"
    #> [19] "_source.agg-mainTopic" "_source.XML"
    #> [21] "_source.elevationGeocode" "_source.maxDateTime"
    #> [23] "_source.xml-карта сайта" "_source.agg-topic"
    #> [25] "_source.westBoundLongitude" "_source.agg-project"
    #> [27] "_source.northBoundLatitude" "_source.sp-dataStatus"
    #> [29] "_source.sp-hidden" "_source.agg-location"
    #> [31] "_source.internal-source" "_source.agg-basis"
    #> [33] "_source.southBoundLatitude" "_source.idDataSet"
    #> [35] "_source.boost" "_source.agg-устройство"
    #> [37] "_source.maxElevation" "_source.parentURI"
    #> [39] "_source.parentIdDataSet" "_source.oaiSet"
    #> [41] "_source.meanPosition.lat" "_source.meanPosition.lon"
    #>
    #> $row.names
    #> [1] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    #>
    #> $класс
    #> [1] "tbl_df" "tbl" "data.frame"
    #>
    #> всего $
    #> [1] 370634
    #>
    #> $max_score
    #> [1] 1
      
      attr(res, "всего")
      
      #> [1] 370634
      
      attr(res, "max_score")
      
      #> [1] 1
      

    Чтобы получить DOI для каждого исследования, используйте

      gsub("https://doi.org/", "", res$`_source.URI`)
      
      #> [1] "10.1594/ПАНГЕЯ.784764" "10.1594/ПАНГЕЯ.845354"
    #> [3] "10.1594/ПАНГЕЯ.380654" "10.1594/ПАНГЕЯ.846724"
    #> [5] "10.1594/ПАНГЕЯ.846729" "10.1594/ПАНГЕЯ.707787"
    #> [7] "10.1594/ПАНГЕЯ.67642" "10.1594/ПАНГЕЯ.837347"
    #> [9] "10.1594/ПАНГЕЯ.846977" "10.1594/ПАНГЕЯ.846979"
      

    Получить данные

    Функция pg_data выбирает наборы данных для исследований по их DOI.

      res <- pg_data(doi = '10.1594/ПАНГЕЯ.807580')
    разрешение [[1]]
      
      #> <данные Pangaea> 10.1594/PANGAEA.807580
    #> родитель doi: 10.1594/PANGAEA.807580
    #> URL-адрес: https://doi.org/10.1594/PANGAEA.807580
    #> цитирование: Schiebel, Ralf; Ванек, Джоанна Дж.; Борк, Матиас; Хемлебен, Кристоф (2001): Физическая океанография во время круиза МЕТЕОР М36/6. PANGAEA, https://doi.org/10.1594/PANGAEA.807580, в дополнение к: Schiebel, R et al. (2001): Производство планктонных фораминифер, стимулированное перераспределением хлорофилла и захватом питательных веществ.Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 48(3), 721-740, https://doi.org/10.1016/S0967-0637(00)00065-0
    #> путь: /Users/sckott/Library/Caches/pangaear/10_1594_PANGAEA_807580.txt
    #> данные:
    #> # Тиббл: 32 179 x 13
    #> Event `Dat… Lati… Long… `Ele… `Dep… `Pre… `Tem… Sal `Tpo… `Sig… `Sig…
    #>            
    #> 1 М36/… 1996… 49.0 -16,5 -4802 0 0 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 2 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 0,990 1 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 3 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 1,98 2 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 4 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 2,97 3 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 5 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 3,96 4 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 6 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 4,96 5 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 7 M36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 5.95 6 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 8 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 6,94 7 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 9 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 7,93 8 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> 10 М36/… 1996… 49,0 -16,5 -4802 8,92 9 15,7 35,7 15,7 26,4 26,4
    #> # ... с еще 32 169 строками и еще 1 переменной: `Cond [мСм/см]` 
      

    Найдите данные, затем передайте один или несколько DOI функции pg_data .

      res <- pg_search(query = 'вода', bbox = c(-124.2, 41,8, -116,8, 46,1), количество = 3)
    pg_data(res$doi[3])[1:3]
      
      #> [[1]]
    #> <Данные Pangaea> 10.1594/PANGAEA.874893
    #> родительский doi: 10.1594/PANGAEA.874893
    #> URL-адрес: https://doi.org/10.1594/PANGAEA.874893
    #> цитата: Улиг, Кристиана; Loose, Brice (2017): Окисление метана в арктической морской воде, Уткиагвик, Аляска. PANGAEA, https://doi.org/10.1594/PANGAEA.874893, Дополнение к: Uhlig, C; Loose, B (2017): Использование стабильных изотопов и концентраций газа для независимых ограничений микробного окисления метана при температурах Северного Ледовитого океана.Лимнология и методы океанографии, 15 стр., https://doi.org/10.1002/lom3.10199
    #> путь: /Users/sckott/Library/Caches/pangaear/10_1594_PANGAEA_874893.txt
    #> данные:
    #> # Таблица: 270 x 22
    #> Event `Date… Latit… Longi… `Dep… `Dep… `Dep… `Sam… Treat `N [… `Durat…
    #>           
    #> 1 Элсон… 2016-… 71,3 -156 1,50 НП НП 7 0,2x… 2 0.0100
    #> 2 Элсон… 2016-… 71,3 -156 1,50 НП НП 7 0,2x… 3 6,03
    #> 3 Элсон… 2016-… 71,3 -156 1,50 НП НП 7 0,2x… 2 8,88
    #> 4 Элсон… 2016-… 71,3 -156 1,50 НП НП 7 0,2x… 4 10,8
    #> 5 Utqia… 2016-… 71,4 -157 6,50 НП НП 10 0,2x 2 0,0100
    #> 6 Utqia… 2016-… 71,4 -157 6,50 НП НП 10 0,2x 2 6,15
    #> 7 Utqia… 2016-… 71,4 -157 6,50 НП НП 10 0,2x 2 8,99
    #> 8 Utqia… 2016-… 71.4 -157 6,50 НП НП 10 0,2x 2 10,8
    #> 9 Utqia… 2016-… 71,4 -157 5,00 НП НП 13 0,2x 2 0,0100
    #> 10 Utqia… 2016-… 71,4 -157 5,00 НП НП 13 0,2x 2 6,15
    #> # ... с еще 260 строками и еще 11 переменными: `Duration std dev [±]`
    #> # , `Ch5 [нмоль/л]` , `Ch5 std dev [±]` , `ln(Ch5) [нмоль]`
    #> # , `ln(Ch5) std dev [±]` , `d13C Ch5 [на мил PDB]` ,
    #> # `d13C Ch5 std dev [±]` , `Высокое среднее по оси Y` , `Высокое по оси Y
    #> # std dev [±]` , `Низкое среднее по оси Y` , `Низкое стандартное отклонение по оси Y [±]`
    #> # 
    #>
    #> [[2]]
    #> НУЛЬ
    #>
    #> [[3]]
    #> НУЛЬ
      

    Метаданные OAI-PMH

    OAI-PMH — это стандартный протокол для обслуживания метаданных объектов, в данном случае наборов данных.Если вы уже знакомы с OAI-PMH, вам повезло, так как вы можете использовать здесь то, что знаете. Если не знакомо, то относительно прямолинейно.

    Обратите внимание, что с помощью этих функций нельзя получить данные, а только метаданные о наборах данных.

    Идентифицировать службу

      pg_identify()
      
      #> <Пангея>
    #> Имя репозитория: PANGEA — издатель данных для науки о Земле и окружающей среде
    #> базовый URL: https://ws.pangaea.de/oai/провайдер
    #> Версия протокола: 2.0
    #> adminЭлектронная почта: [email protected]
    #> adminЭлектронная почта: [email protected]
    #> самая ранняя отметка даты: 2015-01-01T00:00:00Z
    #> удаленная запись: временная
    #> степень детализации: ГГГГ-ММ-ДДTчч:мм:ссZ
    #> сжатие: gzip
    #> описание: oaipangaea.de:oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.999999
      

    Список форматов метаданных

      pg_list_metadata_formats()
      
      #> схема metadataPrefix
    #> 1 oai_dc http://www.openarchives.org/OAI/2.0/oai_dc.xsd
    #> 2 pan_md http://ws.pangaea.de/schemas/pangaea/MetaData.xsd
    #> 3 различия http://gcmd.gsfc.nasa.gov/Aboutus/xml/dif/dif_v9.4.xsd
    #> 4 iso19139 http://www.isotc211.org/2005/gmd/gmd.xsd
    #> 5 iso19139.iodp http://www.isotc211.org/2005/gmd/gmd.xsd
    #> 6 datacite3 http://schema.datacite.org/meta/kernel-3/metadata.xsd
    #> пространство имен метаданных
    #> 1 http://www.openarchives.org/OAI/2.0/oai_dc/
    #> 2 http://www.pangaea.de/MetaData
    #> 3 http://gcmd.gsfc.nasa.gov/Aboutus/xml/dif/
    #> 4 http://www.isotc211.org/2005/gmd
    #> 5 http://www.isotc211.org/2005/gmd
    #> 6 http://datacite.org/schema/kernel-3
      

    Список идентификаторов

      pg_list_identifiers(от = Sys.Date() - 2, до = Sys.Date())
      
      #> # Текст: 390 x 6
    #> идентификатор дата… setS… setS… setS… setS…
    #>      
    #> 1 табличка: пангея.de:doi:10.1594/PANGAEA.870867 2017… cita… cita… supp… 
    #> 2 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.724540 2017… cita… cita… supp… 
    #> 3 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.149999 2017… cita… cita… supp… 
    #> 4 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.816714 2017… cita… cita… deNB… supp…
    #> 5 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.817715 2017… cita… cita… deNB… supp…
    #> 6 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.819855 2017… cita… cita…  
    #> 7 oai: пангея.de:doi:10.1594/PANGAEA.820004 2017… cita… cita… supp… 
    #> 8 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.858878 2017… cita… cita… deNB… supp…
    #> 9 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.880113 2017… cita… cita… supp… 
    #> 10 oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.884462 2017… cita… cita… supp… 
    #> # ... еще 380 строк
      

    Наборы списков

      pg_list_sets()
      
      #> # Текст: 262 x 2
    #> setSpec setName
    #> <хр> <хр>
    #> 1 ACD Техническое ключевое слово PANGEA 'ACD' (2 набора данных)
    #> 2 Техническое ключевое слово ASPS PANGEA «ASPS» (59 наборов данных)
    #> 3 AWIXRFraw PANGEA tech-keyword 'AWIXRFraw' (1 набор данных)
    #> 4 BAh2960 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2960' (2 набора данных)
    #> 5 BAh2961 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2961' (2 набора данных)
    #> 6 BAh2962 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2962' (7 наборов данных)
    #> 7 BAh2963 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2963' (7 наборов данных)
    #> 8 BAh2964 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2964' (7 наборов данных)
    #> 9 BAh2965 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2965' (7 наборов данных)
    #> 10 BAh2966 Техническое ключевое слово PANGEA 'BAh2966' (6 наборов данных)
    #> # ... еще 252 строки
      

    Список записей

      pg_list_records (от = Sys.Date() - 1, до = Sys.Date())
      
      #> # Текст: 44 x 37
    #> ident… date… setS… setS… setS… setS… title cre… cre… cre… cre… cre…
    #>            
    #> 1 oai:… 2017… cita… cita… deNB… supp… Geoc… Pirr… Händ… Mert… Enge… Pudl…
    #> 2 oai:… 2018… cita… cita… supp…  Mult… Bart… Tits… Fahl… Stei… Seid…
    #> 3 oai:… 2018… supp…    Hous… Teys… Rouf… Sale… Stru… Matt…
    #> 4 oai:… 2017… deNB… supp…   Biom… Rama… Marb… Prad… Pero… Lard…
    #> 5 oai:… 2017… supp…    Cont… Welc… Mund…   
    #> 6 oai:… 2018…     Pore… Paul… Kosc…   
    #> 7 oai:… 2018…     Мете… Олеф…    
    #> 8 oai:… 2018…     Мете… Олеф…    
    #> 9 oai:… 2018…     Basi… Olef…    
    #> 10 oai:… 2018…     Мете… Олеф…    
    #> # ... с еще 34 строками и еще 25 переменными: создатель.5 , создатель.6
    #> # , источник , издатель , дата , тип , формат
    #> # , идентификатор.2 , идентификатор.1 , описание ,
    #> # язык , права , права.1 , покрытие , тема
    #> # , создатель.7 , создатель.8 , отношение , создатель.9
    #> # , создатель.10 , создатель.11 , отношение.1 ,
    #> # отношение.2 , отношение.3 , отношение.4 
      

    Получить запись

      pg_get_record (идентификатор = "oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.788382")
      
      #> $`oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.788382`
    #> $`oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.788382`$header
    #> # Таблица: 1 x 3
    #> идентификатор datestamp setSpec
    #> <хр> <хр> <хр>
    #> 1 табличка: пангея.de:doi:10.1594/PANGAEA.788382 2017-08-08T17:50:18Z цитируемый;…
    #>
    #> $`oai:pangaea.de:doi:10.1594/PANGAEA.788382`$metadata
    #> # Таблица: 1 x 13
    #> title cre… sour… publ… date type form… iden… desc… lang… righ… cove…
    #>            
    #> 1 Trace… Demi… P.P.… PANG… 2012… Data… appl… http… Bioa… en CC-B… MEDI…
    #> # ... с еще 1 переменной: subject 
      

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.