Минископ: Steiner Miniscope 8х22 минископ – купить в Москве по цене 7 000 руб. в интернет-магазине Фотогора

Содержание

Микроскопы

Микроскопы

 

При исследовании документов и атрибутов таможенного обеспе­чения к микроскопам прибегают в тех случаях, когда увеличение, создаваемое лупой, — недоста­точно. Микроскоп — это комбинация двух оптических систем (из одной или нескольких линз) — объектива и окуляра. Исследуемый объект или участок документа помещается вблизи переднего фо­куса объектива, дающего действительное увеличенное перевёрну­тое изображение, которое рассматривается с помощью окуляра, иг­рающего роль лупы.

В практике работы таможенных органов применяются в основном две модели миниатюрных микроскопов. Это — «Минископ», модель 1171, (торговая фирма Германии — «Helling»), внешний вид которого представлен на Рис.1.2. «Минископ» имеет 30-ти кратное увеличение, линейное поле зрения — 5мм, размеры — длина 125мм, диаметр 15мм, встроенной подсветки — не имеет. Корпус прибора представляет собой металлическую трубку, нижняя часть которой срезана и покрыта изнутри белой краской для повышения осве­щённости объекта за счёт отражения от неё падающего света.

Объектив «Минископа» находится внутри корпуса, наводка на резкость осуществляется с помощью пластмассового фокусировочного кольца, жестко скреплённого с объективом и надетого на корпус в нижней части прибора. Окуляр, смонтированный в трубке диаметром 14мм и длиной 30мм,свободно вставлен в трубку кор­пуса сверху.

При исследовании документов «Минископ» устанавливается перпендикулярно плоскости объекта срезом трубки в сторону света, причём нижний край его устанавливается так, чтобы про­дольная ось симметрии прибора проходила через центр исследу­емой зоны документа. При этом будет наблюдаться увеличенное в 30 раз перевёрнутое изображение наблюдаемого участка.

В случае применения «Минископа» для контроля целостности пломб исследование вынуждено проводиться на весу, т.к. мини­мальная высота объекта, который может быть рассмотрен при уста­новке пломбы и прибора на одну плоскость, составляет всего 5мм при выдвинутом окуляре до 9 мм, что требует достаточно хорошей практической подготовки оперативных работников при работе с этого вида техникой.

По отзывам сотрудников таможенных служб, «Минископ» не находит широкого применения из-за указанного недостатка, а также из-за отсутствия возможности подсветки исследуемого объекта; неудобно для восприятия и перевёрнутое изо­бражение.

Более совершенной и удобной в эксплуатации моделью миниатюрного микроскопа является модель «FF-393», японского производства (фирма-поставщик «Helling».Германия). Его внешний вид представлен на Рис. 1.3.

Микроскоп «FF-393» имеет увеличение 30 крат, габариты 140х48х22мм, вес всего 30г. Питание встроенной лампочки под­светки обеспечивает непрерывную работу в течение 3-х часов (2 никель-кадмиевых аккумулятора типа Р-60АА, напряжением 1,2В ёмкостью — 0,6 А/ч). Особенность конструкции данной модели зак­лючается в том, что исследование участка документа можно осу­ществлять как при естественном освещении (для чего служит прозрачный пластмассовый колпачок), так и без него, используя возможность включения лампочки местной подсветки. Освещение включается только тогда, когда пластмассовая трубка, где находятся источники питания, наклоняется на определённый угол относительно оптической оси микроскопа в месте её стыковки с цилиндром-корпусом, где установлен микровыключатель.

Для фоку­сировки наблюдаемого изображения используется фокусирующее кольцо.

Сравнение двух минископов, Переделываем стандартное айфоновское крепление под своей телефон. Special Microscope 60X Currency Detecting with LED Microscope for iPhone 4G 4S HMM-84759

Всем привет:) решил сделать сравнение двух микроскопов (как их гордо называются китайцы) а по факту минископов, заодно и попробуем приделать его к камере своего телефона. Обзор получился излишние переполненный фото и текстом, уж простите, но и так ужимал как мог.


Был у меня один микроскоп, вот такой tinydeal.com/60x-100x-zoom-pocket-illuminated-microscope-p-12731.html
Все хорошо, увеличивает, можно менять кратность, но проблема что на телефон зацепить возможности нет, поэтому приобрел еще один, с креплением на айфон, думал переделаю крепление под свой, и буду цеплять свой черный микроскопик, как оказалось я ошибался:)
Фото микроскопов, дешманских чехлов из вонючего дермантина я наверное не буду делать, все прекрасно видно на картинках магазина,
ограничюсь общим фото:

 

И наконецто перейдем к сути:
Для начала попробуем примастырить микроскопы к телефону, дабы облегчить наглядное измерение кратности.
В комплекте с первым минископоп (назовем его условно «Белый» для простоты восприятия)
идет вот такой фиксатор переходник:

Телефон у меня devdb.ru/motorola_atrix_4g
Камера расположена с той же стороны что и у айфона, но чуть смещена вниз, и сам телефон толще и шире.

Для подгонки нам понадобиться

нож


 

и моя любимая горелочка с динодиректа.


 

Принцип простой, лишнее срезаем, оставшиеся нагреваем гладящими движениями, вытягиваем руками, опять нагреваем, быстро одеваем на телефон, пальцами пригибаем где надо, главный нюанс, греть только снаружи если нагреть внутри, мягкая пластмасса может прилипнуть к телефону. Не торопиться, Не перегревать, Не допускать возгорания.
Подгоняем к окошку камеры, по возможности центруем:

 

Получаем вот такую кракозяблю в сравнении с новой:

 


 

(у меня два минископа таких, есть еще один переходник для сравнения.
В процессе слегка заплавил и деформировал разьем куда вставляется минископ (Держиться просто трением) Но не проблема, нагреваем, вставляем, все норм:)

В результате должно получить вот так:

 


 

Пол дела сделано, теперь можно без проблем получить вот такие фото:

 


 


 

Переходим к сложному этапу, придумать как зафиксировать мощный «черный» минископ, изначальная задумка не получилось, в фиксатор от белого не влазит, «разьемы» разные по диаметру:

 


 

Да еще и форма у черного какаято овальная. Чещем в затылки, думаем, думаем, придумали:) ищем старый жесткий чехол, сразу же прицеливаемся:

 

В принципе можно просто приклеить к чехлу минископ, но тогда не получиться использовать комфортно отдельно от телефона его. Так что делаем другой вариант: приклеиваем разьем к чехлу.

Нашел вот такую полителеновую хреновинку,

 

но она слишком мягкая, решил пойти нестандартным способом и «закалить» ее, для этого нагрел в кипятке, потом бросил в воду с льдом, и на удивлении получилось, полителен стал жестким:)

Обрезаем лишнее

 

Безопасность превыше всего, одеваем перчатки, подлаживаем на стол целофан, сверху бумагу т.к. цианокрилатный клей не застывает на целофане,

 

Сам процесс наклейки:
Телефон кутаем в целофан, одеваем сверху чехол, капаем клей, центруем разьем, дышим на него, чтобы быстрее застыл.
и клееим, по кругу армируем изолентой и цианокрилатом, на чехол для жесткости клеим кусочек пластика от обычной бутылки.

 

Вставляем минископ:

 

Держиться собака:)))
Теперь можно попробывать оценить кратность, фотаем линейку:

 

Делаем снимок на минимальном увелечении черного на той же высоте:

 

на максимальном:

 

Белый минископ:

 

Собстно расчеты (возможно я не прав, кто лучше разбирается поправьте):
Без увеличения мы видим 120мм линейки, в белом минископе видно 5мм, 120/5=24 получаем кратность 24? для черного 120/2,5 = 48 для черного с выдвинутым фокусом: 120/1,5 = 80. В прочем, есть еще зум у телефона, с зумом можно получить вот такую картинку с белого:

 

Практическое применение можно посмотреть в моем прошлом обзоре:
mysku.ru/blog/tinydeal/16507.html
Спасибо за внимание:)
Понравился опус:)? хотите сделать автору приятно? нажмите «обзор понравился» и кнопку «планирую купить» вам мелочь, а мне приятно:)

Разработка новых методов, технологий, экспериментальных подходов и моделей для оптического исследования активности нейронов мозга в динамике поведения. — НИР

1 9 января 2017 г.-29 декабря 2017 г. Разработка новых методов, технологий, экспериментальных подходов и моделей для оптического исследования активности нейронов мозга в динамике поведения.
Результаты этапа: Работа успешно выполнена. В 2017 году получено 2 патента. Опубликованы 4 статьи по теме в журналах, индексируемых в WoS и Scopus, сделано несколько докладов на конференциях.
2 5 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка новых методов, технологий, экспериментальных подходов и моделей для оптического исследования активности нейронов мозга в динамике поведения.
Результаты этапа: Этап успешно выполнен. По результатам исследований опубликованы статьи в Журнале высшей нервной деятельности им. И.П.Павлова — https://istina.msu.ru/publications/article/153959979/, в журнале Neuroscience and Behavioral Physiology — https://istina.msu.ru/publications/article/158470425/, в сборнике научных трудов Первой Всероссийской конференции и Школы с международным участием «Оптогенетика и оптофармакология» под общ.редакцией М.Л.Фирсова — https://istina.msu.ru/publications/article/140311451/. Были сделаны два доклада на Первой Всероссийской конференции и Школе с международным участием «Оптогенетика и оптофармакология» - https://istina.msu.ru/publications/article/140311167/ https://istina.msu.ru/publications/article/140311451 Получены два патента (правообладатель МГУ) — https://istina.msu.ru/patents/97688136/ https://istina.msu.ru/patents/119508941/
3 1 января 2019 г.-28 декабря 2019 г. Разработка новых методов, технологий, экспериментальных подходов и моделей для оптического исследования активности нейронов мозга в динамике поведения.
Результаты этапа: Задачи, поставленные в ходе 3-го этапа работы по НИР, выполнены. Результаты проводимых исследований регулярно обсуждались на теоретическом семинаре Института перспективных исследований мозга, докладывались на российских и международных конференциях, в том числе на конференции «Ломоносовские чтение»на секции нейронаук и конитивных наук, организованной институтом. В общей сложности по теме НИР представлено 9 докладов. По данной теме планировалось подготовить 4 статьи, подготовлено 6,в том числе в высокорейтинговых журналах (статьи прикреплены к НИР в системе Истина). Отчет по этапу выполнен и введен в систему Истина.
4 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Разработка новых методов, технологий, экспериментальных подходов и моделей для оптического исследования активности нейронов мозга в динамике поведения.
Результаты этапа: Запланированные показатели успешно выполнены, отражены в отчете, который загружен в Истину. В работе, проведенной в 2020 г., была разработана поведенческая модель для оценки топологических свойств нейронного кодирования животными исследуемого пространства — арена типа «открытое поле» с изменяемым числом препятствий. В этой модели были проведены съёмки поведения и нейронной активности бодрствующих мышей с помощью минископа NVista HD при исследовании животными новой обстановки. Полученные данные были проанализированы с использованием программных средств, разработанных на предыдущем этапе, в результате чего были извлечены местоположения и временные ряды отдельных нейронов, а также траектории животных. Кроме того, были разработаны программные средства для удобной синхронизации и визуализации видеопотоков данных, получаемых при одновременной съёме нейронной активности и поведения животных. По теме исследования подготовлены три статьи, прикреплены к разделу НИР, результаты исследований представлены на секции нейронаук и когнитивных наук конференции «Ломоносовские чтения» (18 ноября 2020 г), а также в рамках проведенного Институтом перспективных исследований мозга МГУ I Национального конгресса по когнитивной науке, искусственному интеллекту и нейроинформатике (10-16 октября 2020). Дальнейшую работу по проекту решено продолжить в рамках укрупненной задачи путем объединения двух тем института, выполняемых по госзаданию, что продиктовано логикой развития института и проводимых им исследований.

Как доехать до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi в Burhaniye, Üsküdar на автобусе, поезде, канатной дороге или метро?

Общественный транспорт до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi в Burhaniye, Üsküdar

Не знаете, как доехать до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi в Burhaniye, Üsküdar, Турция? Moovit поможет вам найти лучший способ добраться до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi от ближайшей остановки общественного транспорта, используя пошаговые инструкции.

Moovit предлагает бесплатные карты и навигацию в режиме реального времени, чтобы помочь вам сориентироваться в городе. Открывайте расписания, поездки, часы работы, и узнайте, сколько займет дорога до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi с учетом данных Реального Времени.

Ищете остановку или станцию около Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi? Проверьте список ближайших остановок к пункту назначения: Ferah Caddesi; Ferah Caddesi / Altunizade Yönü; Fidanlık.

Вы можете доехать до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi на автобусе, поезде, канатной дороге или метро. У этих линий и маршрутов есть остановки поблизости: (Автобус) 11ÜS, 11Y, 129T, 14R, 320, 522 (Метро) M4 (Канатная дорога) MİNİBÜS: C-56

Хотите проверить, нет ли другого пути, который поможет вам добраться быстрее? Moovit помогает найти альтернативные варианты маршрутов и времени. Получите инструкции, как легко доехать до или от Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi с помощью приложения или сайте Moovit.

С нами добраться до Miniskop Bilim Ve Sanat Atölyesi проще простого, именно поэтому более 930 млн. пользователей доверяют Moovit как лучшему транспортному приложению. Включая жителей Burhaniye, Üsküdar! Не нужно устанавливать отдельное приложение для автобуса и отдельное приложение для метро, Moovit — ваше универсальное транспортное приложение, которое поможет вам найти самые обновленные расписания автобусов и метро.

На конференции ИЭФБ РАН представлена технология анализа паттернов мозговой активности лабораторных мышей для исследований в области нейродегенеративных заболеваний

21 октября на XVI Всероссийской конференции «Совещание по эволюционной физиологии имени академика Л.А. Орбели» (Орбели-2020), организованной Институтом эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии наук, состоялся доклад «Методы анализа данных, полученных с использованием минископа».

В докладе были представлены результаты проекта «Исследование изменений активности нейронных сетей, вызванных нейродегенеративными заболеваниями, с применением методов искусственного интеллекта» [1], выполнявшегося сотрудниками Лаборатории «Промышленные системы потоковой обработки данных» Центра НТИ СПбПУ и российско-китайской «Laboratory of Basic and Translational Neuroscience», созданной на базе Института биомедицинских систем и технологий (ныне ВШБСиТ ИБСиБ) СПбПУ.

Докладчиком выступил руководитель проекта Илья Борисович Безпрозванный, доктор биологических наук, заведующий Лабораторией молекулярной нейродегенерации СПбПУ, профессор ВШБСиТ ИБСиБ СПбПУ, именной профессор кафедры физиологии и руководитель лаборатории Юго-западного Медицинского центра университета Техаса в Далласе (США). В авторский коллектив доклада вошли А.И. Ерофеев, Е.И. Герасимов, С.А. Пушкарева, Д.С. Баринов, М.В. Болсуновская и О.Л. Власова.

И.Б. Безпрозванный

Одной из задач проекта стало создание нового цифрового инструмента для математического анализа данных, полученных в результате эксперимента. Новое ПО было призвано дополнить и развить технологию визуализации активности нейронов головного мозга у свободно движущихся мышей с помощью миниатюрного флуоресцентного микроскопа (минископа), имплантируемого в мозг животных.

Использование минископа позволяло получать изображения ранее недоступных популяций нейронов в глубине мозга и регистрировать активность нейрональной сети у бодрствующих свободно движущихся животных в течение продолжительного промежутка времени. В ходе видеозаписи генерировался огромный массив данных, представляющих собой дискретные сигналы флуоресценции нейронов. Данная технология была интегрирована в Лаборатории молекулярной нейродегенерации ВШБСиТ ИБСиБ СПбПУ под руководством И.Б. Безпрозванного.

Огромный потенциал полученной информации был очевиден, однако для дальнейшего анализа сигналов с целью определения скрытых закономерностей требовалось специализированное ПО.

Программный пакет NeuroInfoViewer, разработанный ведущим программистом лаборатории ПСПОД Центра НТИ СПбПУ Дмитрием Бариновым, позволяет проводить высокоуровневый анализ и построение корреляционной зависимости активности нейронов. В качестве исходных данных выступают результаты работы сторонних ПО для первичной обработки видеозаписи алгоритмами улучшения качества видео, детектирования нейронов и выделения сигналов флуоресценции (CNMF_E и MIN1PIPE).

Интерфейс прототипа NeuroInfoViewer и результаты обработки данных одного из экспериментов

Усовершенствованная технология поможет исследователям получить качественно новые данные о механизме патогенеза нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств, что в дальнейшем позволит сделать выводы о причинах и потенциально возможных способах лечения и предотвращения таких недугов, как болезни Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона и т.п.

 

________________________

[1]  Работа выполнена при поддержке субсидии на реализацию проектов Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого в рамках Программы повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров (Проект 5-100-2020) на 2020 г. и при поддержке гранта РНФ 19-15-00184 (И.Б). Период реализации: март – октябрь 2020.

РАЗРАБОТКА ПЛАГИНА ДЛЯ ВЫСОКОУРОВНЕВОГО АНАЛИЗА НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ, ЗАРЕГИСТРИРОВАННОЙ ВО ВРЕМЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИНИСКОПА Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

7. Dougherty SE, Reeves JL, Lesort M, et. al. Purkinje cell dysfunction and loss in a knock-in mouse model of Huntington disease. Experimental neurology. 2013;240:96-102.

8. Kasumu AW, Hougaard C, Rode F, et al. Selective positive modulator of calcium-activated potassium channels exerts beneficial effects in a mouse model of spinocerebellar ataxia type 2. Chem Biol. 2012;19 (10):1340—53.

9. Egorova PA, Zakharova OA, Vlasova OL, et. al. In vivo analysis of cerebellar Purkinje cell activity in SCA2 transgenic mouse model. Journal of neurophysiology. 2016;115 (6):2840—51.

10. Egorova PA, Gavrilova AV, Bezprozvanny IB. Ataxic Symptoms in Huntington’s Disease Transgenic Mouse Model Are Alleviated by Chlorzoxazone. Frontiers in neuroscience. 2020;14:279.

11. Egorova P. A. Gavrilova AV, Bezprozvanny I. B. In vivo analysis of the spontaneous firing of cerebellar Purkinje cells in awake SCA2—58Q mice. In preparation (Cell Calcium). 2020.

12. Alvina K, Khodakhah K. The therapeutic mode of action of 4-amino-pyridine in cerebellar ataxia. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 2010;30 (21):7258—68.

Ерофеев А.И. 1, Герасимов Е.И. 1, Пушкарева С.А. 1, Баринов Д.С. 2, Болсуновская М.В. 2, Ян Сянью 3, Ян Хаою 3, Чжоу Чэнбинь3, Власова О.Л.1, Ли Уейдонг 3, Безпрозванный И.Б. 12

1 — Лаборатория молекулярной нейродегенерации Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия

2 — Лаборатория «Промышленные системы потоковой обработки данных» Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия

3 — Отделение физиологии юго-западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, США

4 — Основная лаборатория генетики развития и психоневрологических расстройств, Шанхайский университет Цзяо Тонг, Шанхай, Китай e-mail: [email protected]/[email protected]

РАЗРАБОТКА ПЛАГИНА ДЛЯ ВЫСОКОУРОВНЕВОГО АНАЛИЗА НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ, ЗАРЕГИСТРИРОВАННОЙ ВО ВРЕМЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИНИСКОПА

Миниатюрный флуоресцентный микроскоп (минископ) является перспективным средством визуализации активности нейронов [1]. Использование минископа позволяет получать изображения ранее недоступных популяций нейронов в глубине мозга свободно движущихся животных. Тем не менее, обработка первичных данных, полученных с помощью минископа, имеет ряд трудностей: экстракция нейронной активности и ее последующий анализ, в том числе высокоуровневый.

В связи с тем, что в открытых источниках не удалось найти инструмент, позволяющий провести высокоуровневый анализ нейронной активности [2], было предложено разработать собственный программный модуль, объединяющий возможности первичной обработки видеозаписи с использованием алгоритмов CNMF_E [3], процедуру регистрации нейронов для нескольких экспериментов с использованием алгоритма CellReg [4], а также высокоуровневый анализ изменений нейронной активности от эксперимента к эксперименту.

В качестве платформы для разработки была выбрана среда MATLAB (MathWorks), позволяющая с одной стороны, легко объединить алгоритмы и реализации других исследователей, а с другой — использовать разработанный инструмент и его исходный код для дальнейших модификаций. На данный момент разработана версия программного модуля, позволяющая импортировать данные обработки видеопоследовательности одного эксперимента, проводить корреляционный анализ и представлять результат в графическом виде. Графический интерфейс программного модуля содержит несколько виджетов (рис. 1). Виджет слева иллюстрирует активность нейронов для выбранного кадра единичной видеопоследовательности. Для идентификации нейронов, каждому из них присваивается уникальный индекс. Виджет справа иллюстрирует

тепловую карту корреляции активности нейронов. Внизу графического интерфейса расположены: инструмент выбора диапазона кадров для расчета корреляционной зависимости, позволяющий выбирать кадры из несколько экспериментов, и инструмент выбора кадра в видеозаписи для отображения.

Показатель корреляционной зависимости нейрона i от нейрона j, вычисляется, где — количество кадров видео последовательности, для которых активности нейронов i и j превышают некоторое пороговое значение, а — количество кадров, для которых активность нейрона i превышала некоторое пороговое значение. Пример проанализированных данных представлен на рисунке 2.

Следующим шагом в разработке плагина планируется добавить реализацию вычисления изменений в корреляционной зависимости между сериями экспериментов и доработать программный модуль до конечного программного продукта. Впоследствии с его помощью исследователи смогу получать новые сведения о нейронной активности в целом, а также о взаимодействии нейронов между собой.

Рис. 1. Графический интерфейс прототипа плагина: слева — активность нейронов для выбранного кадра единичной видеопоследовательности, справа — тепловая карта корреляции активности нейронов, внизу слева — инструмент выбора диапазона кадров и инструмент выбора кадра в видеозаписи, внизу справа — выбор индекса конкретного нейрона.

20 -10 M to 1М 1Я> 440 Its ISO Я» so 100 ISO 200

Рис. 2. Корреляция активности нейронов для серии из трех экспериментов. Слева — тепловая карта корреляции активности нейронов, по осям x и y представлены индексы нейронов. Индекс нейрона — порядок его обнаружения в процессе анализа видеопоследовательности. Чаще всего нейроны, имеющие смежные индексы, физически расположены близко друг к другу. Справа — пространственное расположение наиболее активных пар нейронов.

Работа выполнена при поддержке субсидии на реализацию проектов Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого в рамках Программы повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров (Проект 5—100—2020) на 2020 г и при поддержке гранта РНФ 19—15—00184 (И. Б. Безпрозванный).

Список литературы:

1. B. A. Flusberg, A. Nimmerjahn, E. D. Cocker, et al. Nature Methods 5, 935—938, (2008).

2. C. Blanco-Centurion, S. Luo, D. J. Spergel, et al. Journal of Neuroscience 39, 4986—4998, (2019).

3. P. Zhou, S. L. Resendez, J. Rodriguez-Romaguera, et al. Elife 7, (2018).

4. L. Sheintuch, A. Rubin, N. Brande-Eilat, et al. Cell Reports 21, 1102— 1115, (2017).

Каталог уникальных научных установок

 Вольер для содержания морских млекопитающих
Фирма-изготовитель:  Россия, ООО «Тротуар-дизайн»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Содержание и обучение животных в условиях, приближенных к естественным.

 Гидрофон ЦГП-4
Фирма-изготовитель:  Россия, ООО «Мониторинг»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Регистрация подводных звуков, издаваемых китообразными и ластоногими., оценка характеристик экспериментальных, техногенных, природных звуковых раздражителей при определении степени их воздействия на поведение животных, для исследования сенсорных систем водных животных

pH-метр ph250-МИ
Фирма-изготовитель:  Россия, НПО «Измеритель-ная техника ИТ»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для определения кислотности растворов и биологических жидкостей при проведении биохимических исследований

Автоклав
Фирма-изготовитель:  Израиль, Tuttnauer
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Израиль
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для стерилизации лабораторной посуды и инструментов при проведении микробиологических исследований морских млекопитающих и среды их обитания

Аккумулятор 6ст-190
Фирма-изготовитель:  Россия, ООО «Дентон-СК»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Обеспечение научного оборудования электроэнергией в полевых условиях.

Анализатор биохимический ROKI в комплекте
Фирма-изготовитель:  Белоруссия, Ольвекс Диагностикум
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Белоруссия
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Термостатируемый полуавтоматический колориметр с преобразованием и регистрацией данных в цифровой форме. Применяется для определения содержания различных метаболитов в плазме крови тюленей.

Анализатор газов крови электролитов Gastatnavi
Фирма-изготовитель:  Techno Medica
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Япония
Год выпуска:  2012
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для определения гематологических параметров тюленей в небольших количествах крови в полевых и лабораторных условиях

Анализатор гематологический
Фирма-изготовитель:  Австрия, DIATRON
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Австрия
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Определение в автоматическом режиме параметров крови в малых объемах (0.01-0.05 мл).

Бинокулярный микроскоп Микмед 2 вар.2
Фирма-изготовитель:  Россия, ОАО “ЛОМО”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2002
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: НИР с препаратами крови морских млекопитающих.

Весы BFS-05
Фирма-изготовитель:  Ю.Корея, CAS Corp.
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Китайская Народная Республика (КНР)
Год выпуска:  2003
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Контроль за изменением веса морских млекопитающих, использующихся в составе биотехнических систем.

Видеокамера Contour GPS MegaPack
Фирма-изготовитель:  Contour
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  3
Назначение, краткая характеристика: Для регистрации особенностей поведения тюленей на суше и под водой

Видеокамера Drift innovation HD 170 Stealth
Фирма-изготовитель:  Drift innovation
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Канада
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  2
Назначение, краткая характеристика: Для регистрации особенностей поведения тюленей на суше

Видеокамера HDHDD Panasonic
Фирма-изготовитель:  ООО «Техно-центр-север», Япония
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Япония
Год выпуска:  2010
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Регистрация особенностей поведения экспериментальных животных

Видеокамера для подводной съемки VIDIOCOM VC4
Фирма-изготовитель:  Германия, «MARISCOPE MEERESTECHNIK”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Регистрация поведенческих актов морских млекопитающих.

Вольер для содержания морских млекопитающих
Фирма-изготовитель:  Россия, ИП Перцев
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Содержание и обучение животных в условиях, приближенных к естественным.

Вольер для содержания морских млекопитающих + Садки (4 шт)
Фирма-изготовитель:  Россия, АрктикСалман
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2000
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Содержание и обучение животных в условиях, приближенных к естественным.

Вольер пластиковый в комплектe с садками
Фирма-изготовитель:  Россия, ИП Перцев
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Содержание и исследование водных животных

Гидроакустические колонки Clark
Фирма-изготовитель:  ООО «Рива», Германия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2010
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Излучение акустических сигналов при исследовании слуховой системы тюленей

Гидроакустический измерительный канал
Фирма-изготовитель:  ООО «АСМ тесты и измерения», Германия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2010
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Определение характеристик звуков,воздействующих на морских млекопитающих и издаваемых ими

Инфракрасная камера MobR M8
Фирма-изготовитель:  Диагност
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Китайская Республика (Тайвань)
Год выпуска:  2012
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для оценки состояния экспериментальных животных бесконтактным способом

Колориметр КФК-2МП
Фирма-изготовитель:  Россия, “Медформ”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2000
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: НИР с биологическим материалом, от животных, использующихся в составе биотехнических систем.

Лодка надувная QS-430HD
Фирма-изготовитель:  Ю. Корея, “Quicksilver”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Китайская Народная Республика (КНР)
Год выпуска:  2001
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Работа с животными на акватории.

Лодка Онего 390A
Фирма-изготовитель:  Россия, «Раст»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2003
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Работа с животными на акватории.

Микроскоп МБС-10
Фирма-изготовитель:  Россия, ОАО “ЛОМО”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2001
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: НИР с препаратами крови морских млекопитающих.

Микроскоп МИКМЕД1 вар2 (медтех)
Фирма-изготовитель:  Россия, ОАО “ЛОМО”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2001
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: НИР с препаратами крови морских млекопитающих.

Моноблок ZANOTTI BGM 22002F
Фирма-изготовитель:  «Россия» ООО «БОСС-М»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Морозильный агрегат для хранения рыбы-корма для морских млекопитающих

Оптический микроскоп с цифровой камерой
Фирма-изготовитель:  Германия, «Karl Zeiss»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Регистрация микроскопических изображений и количественный анализ клеток крови биообъектов.

Программно-аппаратный комплекс
Фирма-изготовитель:  Россия, ГОУ ВПО “Санкт-Петербургский государственный университет аэрокосми-ческого приборо-строения”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2005
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Исследование физиологических параметров и оперативного контроля функционального состояния морских млекопитающих, использующихся в составе биотехнических систем.

Садок для морских млекопитающих
Фирма-изготовитель:  ИП Перцев Н.А.
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  4
Назначение, краткая характеристика: Для содержания и исследования тюленей

Система аквариумных стерилизаторов
Фирма-изготовитель:  Россия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для обеспечения чистой водой бассейна (ванны) для содержания и лечения больных тюленей

Система видеонаблюдения
Фирма-изготовитель:  ООО «Техно- сервис», Япония
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Япония
Год выпуска:  2009
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Круглосуточное наблюдения за тюленями, содержащимися в УСУ «Океанариум»

Система подачи, очистки и хранения воды в комплекте
Фирма-изготовитель:  Россия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Обеспечение чистой водой бассейна (ванны) для содержания и лечения больных тюленей

Телефакс PANASONIC KX-FT962
Фирма-изготовитель:  Китай, «Техноцентр Север»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Китайская Республика (Тайвань)
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Оперативная связь при работах на экспериментальном биополигоне.

Термостат TC-1
Фирма-изготовитель:  20СПУ
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  0
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: 2007

Термостат TW-2-02
Фирма-изготовитель:  Латвия, ELMI
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Латвия
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Термостат водяной. Снабжен системой интенсивного перемешивания термостатируемой жидкости (температура — до 100ºС). Используется при определении активности ферментов в плазме и сыворотке крови морских млекопитающих (при 37ºС), концентрации мочевины (при 100ºС)

Упряжь для морских млекопитающих
Фирма-изготовитель:  ООО «Торговый дом Океан»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  4
Назначение, краткая характеристика: Для крепления оборудования и приборов, управления поведением тюленей

Усилитель Nad C-356BEE
Фирма-изготовитель:  Белоруссия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Белоруссия
Год выпуска:  2011
Количество единиц:  2
Назначение, краткая характеристика: Для исследования слуховой системы тюленей в воздухе и в воде

Установка шкафная газобаллонная
Фирма-изготовитель:  Россия, ОАО «Мурман-облгаз»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Обеспечение лаборатории полигона тепловой энергией

Фотоаппарат Olimpus M115
Фирма-изготовитель:  Япония, “Olympus”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Япония
Год выпуска:  2002
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Съемка экспериментально-научных исследований, работы с животными,  использующихся в составе биотехнических систем.

Холодильная машина МХВ-6-2-4 с воздухоохл. ВО-20
Фирма-изготовитель:  Россия, Московский завод холодильного машино-строения «Искра»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2000
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Хранение замороженной морской продукции, необходимой для кормления животных.

Холодильная система для АКМТ 40-АДКМ
Фирма-изготовитель:  ЗАО «Коминвест-АКМТ»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2012
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для обеспечения исследования влияния изменений условий среды обитания на состояние организма арктических тюленей

Цветная Цифровая видеокамера САМ V 200
Фирма-изготовитель:  Австрия, VISION
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Австрия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для регистрации результатов визуального исследования клеточных элементов крови  животных и последующего морфометрического анализа микроструктур

Центрифуга STATSPIN DIFFSPIN 2
Фирма-изготовитель:  США, Statspin, Inc.
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Соединённые Штаты Америки
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Для изготовления стандартных препаратов крови и лейкоцитарного концентрата ластоногих

Центрифуга клиническая СМ-6-М
Фирма-изготовитель:  Латвия, ELMI
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Латвия
Год выпуска:  2008
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Подготовка образцов крови морских млекопитающих и других экспериментальных животных к биохимическому анализу

Шкаф суховоздушный ШС-80-01СПУ
Фирма-изготовитель:  Россия, «Смоленское СКТБ СПУ»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2007
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Сушильный шкаф. Поддерживает температуру до 250ºС. Используется для быстрой сушки лабораторной посуды

щенки серого тюленя — 4 особи
Фирма-изготовитель:  Россия
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2005
Количество единиц:  4
Назначение, краткая характеристика: объекты экспериментально-научных исследований

Электрогардиограф CARDIOVIT АТ-1VET
Фирма-изготовитель:  Швейцария, «Техноинфо» ЛТД
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Швейцария
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Исследование сердечной деятельности тюленей в стационарных условиях.

Электрокардиограф АЛЬТОН-03С
Фирма-изготовитель:  Россия, Альтоника ООО
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2005
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: ЭКГ исследования морских млекопитающих в научных и ветеринарных целях для оперативного контроля функционального состояния животных в составе биотехнических систем.

Электрокардиограф ЭК1Т-05
Фирма-изготовитель:  Россия, ОАО “Аксион”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Россия
Год выпуска:  2002
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: ЭКГ исследования морских млекопитающих в научных и ветеринарных целях для оперативного контроля за функциональным состоянием животных, использующихся в составе биотехнических систем.

Электрокардиоскоп MINISKOP MS-3
Фирма-изготовитель:  Швейцария, “SCHILLER”
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Швейцария
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Исследование сердечной деятельности тюленей в полевых условиях.

Электростанция дизельная ECE404 YSOieset
Фирма-изготовитель:  Германия, ООО «Спец»
Страна происхождения фирмы-изготовителя:  Германия
Год выпуска:  2006
Количество единиц:  1
Назначение, краткая характеристика: Обеспечение научного оборудования электроэнергией в условиях акваполигона.

границ | Исследования схем с помощью миниатюрных микроскопов с открытым исходным кодом: прошлое, настоящее и будущее

Введение

За последние 5 лет произошел шквал разработки с открытым исходным кодом миниатюрных флуоресцентных микроскопов (минископов) для нейробиологических приложений, дальнейшего развития уже существующих технологий и расширения доступа к гораздо более широкой научной базе пользователей (Cai et al., 2016; Liberti et al., 2016, 2017; Jacob et al., 2018b; Juneau et al., 2018; Liang et al., 2018; Скотт и др., 2018; Skocek et al., 2018; Zhang et al., 2018). Открытый исходный код текущих проектов мини-микроскопов позволяет быстро обмениваться конструкциями, модификациями и идеями в сообществе нейробиологов. Это привело к резкому ускорению инноваций, в результате чего появились мини-микроскопы, способные контролировать активность клеточных популяций, одновременно визуализируя нейронную активность свободно движущихся позвоночных, различая отдельные популяции клеток с помощью двухцветных версий (Jacob et al., 2018b; Leman et al., 2018), картографирование больших полей зрения (Leman et al., 2018), получение объемов изображений с частотой кадров видео (Skocek et al., 2018) и одновременная запись вокализации животных (Liberti et al., 2017) или ускорение головы (De Groot et al., 2018). В этой обзорной статье мы суммируем и сравниваем различные текущие разработки с открытым исходным кодом и их потенциал для нейробиологических исследований. Основная движущая сила развития миниатюрных микроскопов — это, прежде всего, их способность регистрировать активность множества нейронов с определенной топологией у животного, которое не сдерживается и может демонстрировать свое естественное врожденное поведение.Факторы, влияющие на поведение, такие как повышенный уровень стресса у животных с фиксированной головой и отсутствие вестибулярной информации, вероятно, повлияют на зарегистрированные паттерны нейронной активности и, таким образом, на выводы, которые можно сделать о функции мозга в более естественных состояниях (Thurley and Ayaz, 2017). Кроме того, минископы позволяют увидеть нервную активность, лежащую в основе поведения, в большом количестве поведенческих анализов, разработанных за последние десятилетия (Morris, 1984; Graeff et al., 1998; Nadler et al., 2004; Gomez-Marin et al., 2014). В результате для понимания того, как активность, записанная в целевых регионах, может коррелировать с поведением. Кроме того, возможность записи из более чем одного региона путем отбора проб из более крупных областей визуализации или использования нескольких устройств визуализации с уменьшенной площадью и весом (De Groot et al., 2018) должна раскрыть, как межрегиональная передача сигналов разыгрывается в течение нескольких естественное поведение.

Миниатюрные микроскопы с однофотонным возбуждением

Были опробованы и протестированы самые разные подходы для визуализации нейронной активности у свободно ведущих животных. Многие из начальных разработанных систем основывались на оптоволоконных системах (Helmchen et al., 2001; Helmchen, 2002; Göbel et al., 2004; Flusberg et al., 2005, 2008) — с возбуждающим светом, подаваемым внутрь, и флуоресцентным светом, собираемым на удалении. от корпуса микроскопа — до разработки миниатюрного микроскопа, устанавливаемого на голову, в котором возбуждение и детектирование флуоресценции были объединены на корпусе микроскопа (Ghosh et al., 2011). Компоненты такого миниатюрного микроскопа преодолели ограничения стоимости настольных лазеров и дорогих детекторов и вместо этого использовали относительно доступные технологии, такие как датчики изображения CMOS, светодиоды в качестве источника света, стандартные оптические компоненты и градиентный показатель преломления. (или GRIN) линзы. Типичная конструкция такого миниатюрного микроскопа показана на рисунке 1. Оптический путь очень похож на оптический путь обычного широкопольного флуоресцентного микроскопа, с заметной разницей в использовании одной линзы или набора линз GRIN.Линзы GRIN обеспечивают оптический интерфейс с мозгом благодаря небольшому рабочему расстоянию, плоскому дну и диапазону длин и диаметров. Для визуализации поверхностного мозга одну линзу GRIN помещают непосредственно на поверхность мозга. Для доступа к более глубоким областям линза объектива GRIN сочетается с релейной линзой GRIN меньшего диаметра, имплантированной над интересующими нейронами, как правило, за счет более ограниченного поля зрения. По сравнению с двухфотонным возбуждением, однофотонное возбуждение особенно чувствительно к расфокусированной флуоресценции и плохому оптическому секционированию.Несмотря на этот очевидный недостаток, оказалось возможным извлекать сигналы от отдельных нейронов с помощью аналитических методов, включая комбинацию анализа главных и независимых компонентов (PCA / ICA) и недавней ограниченной неотрицательной матричной факторизации (CNMF) с добавленным членом моделируют изменяющийся во времени фоновый сигнал флуоресценции (Mukamel et al., 2009; Lu et al., 2018; Zhou et al., 2018). Таким образом, миниатюрные налобные флуоресцентные микроскопы используют дешевые компоненты, но при этом позволяют получать изображения с клеточным разрешением у бодрствующих животных.Доступность таких мини-микроскопов у коммерческих поставщиков уже привела к множеству исследований, которые позволили лучше понять активность нейронных цепей, лежащих в основе последовательности действий, беспокойства, вокализации — у птиц -, социальных воспоминаний и сна (Markowitz et al., 2015; Okuyama et al., 2016; Klaus et al., 2017; Chen et al., 2018; Jimenez et al., 2018). Выпуск планов строительства мини-микроскопов с открытым исходным кодом привел к еще более широкому применению этой технологии в последние несколько лет и, вероятно, обеспечит консолидированную платформу для будущих итераций инструментов, позволяющих понять, как топологически определенные паттерны активности в мозге влияют на поведение. (Ахарони и др., 2019). Расширенное применение минископов для визуализации нейронной активности у бодрствующих животных было бы невозможным без достижений в развитии флуоресцентных репортеров активности. Например, производные генетически кодируемого белка индикатора кальция (GECI) GCaMP (Chen et al., 2013) позволили специфично нацеливать сенсоры активности на клетки в сочетании с улучшенным детектированием нейронной активности и субклеточным нацеливанием таких сенсоров (Dana et al., 2013). ., 2016). Более того, предпринимаются шаги по разработке более чувствительных датчиков напряжения, которые могут быть нацелены с клеточной специфичностью in vivo (Bando et al., 2019; Quicke et al., 2019). Также стали доступны флуоресцентные датчики для переходных процессов с глутаматом и дофамином, позволяющие получать изображения высвобождения нейромедиаторов у бодрствующих животных (Marvin et al., 2018; Patriarchi et al., 2018). Таким образом, различные аспекты функции уровня схемы теперь можно исследовать с помощью минископов во время необузданного поведения. Есть предостережения, связанные с использованием миниатюрных флуоресцентных микроскопов. Использование линз GRIN для доступа к более глубоким структурам требует введения линз в мозг, что связано с повреждением тканей, несмотря на некоторые признаки того, что осторожные хирургические процедуры могут ограничивать влияние на поведение — по крайней мере, у мышей (Lee et al., 2016). В любом случае следует позаботиться о том, чтобы воспалительные реакции уменьшились после трепанации черепа для доступа к мозгу и установки линз GRIN (Bocarsly et al., 2015). Более того, по соображениям стоимости, а также простоты использования в большинстве миниатюрных флуоресцентных микроскопов используется возбуждение одиночным фотоном, что ограничивает оптические сечения и затрудняет извлечение сигналов из одного источника. Последнее требует апостериорных алгоритмических извлечений сигналов, которые включают модели расфокусированной флуоресценции, которые сами по себе основаны на предположениях.Несмотря на эти явные недостатки, минископы и их версии с открытым исходным кодом открыли возможности для изучения больших ансамблей нейронов во время естественного поведения. Поскольку стоимость больше не является ограничением для проведения таких экспериментов, сейчас хорошее время, чтобы сделать обзор доступности и применимости проектов с открытым исходным кодом, которые сделали эту технологию доступной. Требование к поведенческому картированию, прямому контролю над активностью на уровне схемы, а также более детальному считыванию субпопуляций нейронов внутри схемы привело к тому, что несколько лабораторий разработали новые итерации минископов для удовлетворения этих потребностей.Поэтому мы не только обсудим существующие в настоящее время проекты с открытым исходным кодом, но и подробно остановимся на будущих итерациях и технологиях, направленных на улучшение и расширение общей функциональности минископов.

Рисунок 1 . Миниатюрная конструкция микроскопа с однофотонным возбуждением. (A) Типичная конструкция миниатюрного микроскопа с однофотонным возбуждением, используемого в сочетании с линзами с градиентным показателем преломления (GRIN). Он состоит из возбуждающего светодиодного источника света, светового коллиматора с полушаровыми линзами и возбуждающего фильтра (см.фильтр) и дихроичное зеркало для отражения возбуждающего света вниз к образцу и передачи испускаемой флуоресценции до детектора изображения. Излучаемый свет фокусируется на датчик изображения CMOS с помощью ахроматической линзы после прохождения через эмиссионный фильтр (Em. Фильтр). Использование линз GRIN позволяет получать изображения как поверхностных (слева), так и глубоко лежащих (справа) структур мозга. Регулировка фокальной плоскости в образце достигается перемещением датчика изображения по направлению к ахроматической линзе или от нее.Для поверхностной визуализации линза объектива GRIN размещается непосредственно на поверхности мозга, для глубокой визуализации головного мозга линза объектива GRIN устанавливается внутри эндоскопа и сочетается с более тонкой ретрансляционной линзой GRIN, которая имплантируется в мозг для получения изображения от клеток, преобразованных с помощью репортер флуоресцентной активности (зеленые точки). (B) Минископ UCLA первого поколения с открытым исходным кодом, который устанавливается через опорную пластину на мышь на время сеанса записи. Мыши несут эти 3-граммовые минископы без какого-либо явного влияния на общее поведение, хотя кабельные версии могут влиять на социальное взаимодействие с другими мышами.Масштабная линейка ~ 10 мм.

Проекты с открытым исходным кодом Miniscope

Минископ UCLA

Поскольку несколько лабораторий разрабатывали уникальные версии миниатюрных микроскопов (рис. 2), которые впоследствии были выпущены в общественное достояние, проект UCLA Miniscope, вероятно, оказался наиболее эффективным с точки зрения охвата: более 400 лабораторий по всему миру построили и применили эти устройства для визуализации в своих исследованиях за последние 3 года. Это широкое распространение было достигнуто через онлайн-документацию и учебные пособия по закупке деталей, сборке и экспериментальному применению, а также через многочисленные личные семинары (подробности см. На сайте: http: // miniscope.org). Первое поколение минископов Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, которые впервые использовались, чтобы показать, что воспоминания, сформированные близко по времени, демонстрируют большее перекрытие нейронных ансамблей CA1 (Cai et al., 2016), можно построить за небольшую часть стоимости их коммерческих аналогов. весит около 3 г, имеет поле зрения 700 на 450 мкм (752 на 480 пикселей, размер пикселя 6 мкм), позволяет получать одноканальные флуоресцентные изображения с максимальной частотой до 60 Гц и одновременный мониторинг поведения с дополнительным USB-камера. Оптическая конструкция включает ахроматную линзу (Edmund Optics 49-923), которая фокусирует почти коллимированный свет от линзы объектива GRIN на датчик CMOS и набор настраиваемых оптических фильтров (Chroma ET470 / 40x, T495lpxr, ET525 / 50 м). .Корпус изготовлен на станке с ЧПУ из черного Delrin, а специальная электроника используется для управления и считывания светодиодного источника света возбуждения (Luxeon LXML-PB01-0030) и датчика изображения CMOS (On Semiconductor MT9V032C12STM, динамический диапазон> 55 дБ). Этот датчик изображения CMOS был выбран из-за его относительно небольшого размера на момент разработки, низкой стоимости, большого размера пикселя и доступности при небольших количествах заказа. Кроме того, ранее было показано, что аналогичный датчик изображения CMOS может разрешать флуоресцентную динамику GECI (Ghosh et al., 2011). Для поверхностной визуализации линза объектива GRIN имплантируется поверх поверхности мозга. Металлическая опорная пластина, прикрепленная к черепу с помощью стоматологического цемента, позволяет установить минископ. Для визуализации более глубоких областей мозга может быть имплантирована вторая более тонкая ретрансляционная линза GRIN. В этом случае линза объектива GRIN устанавливается внутри минископа и располагается над линзой реле для фокусировки клеток (рис. 1). Фокусировка происходит с помощью линейного ползунка, высота которого регулируется вручную, с сохранением ориентации нейронов между сеансами визуализации.Уникальной особенностью проекта UCLA Miniscope является кабельная разводка, соединяющая налобный осциллограф и внешнее оборудование для сбора данных. Питание, связь и передача данных достигаются с помощью одного гибкого коаксиального кабеля в сочетании с поддерживающим оборудованием (TI DS90UB913A / DS90UB914A и фильтры Power-Over-Coax). Благодаря общему диаметру кабеля до 0,3 мм (Molex 100065-0023) и совместимости с пассивными коммутаторами с низким крутящим моментом такая конструкция сводит к минимуму влияние кабелей на поведение животных.

Беспроводная версия минископа UCLA (4.5 g) также был разработан и использован для регистрации клеток места CA1 во время навигации по лабиринту у мышей с эпилепсией (Shuman et al., 2018). Эта система включает литий-полимерный аккумулятор (~ 1 г) для питания, карту MicroSD для локального хранения данных (~ 0,5 г) и энергоэффективный датчик изображения (E2V JADE EV76C454). Чтобы сохранить низкое энергопотребление, данные записываются с разрешением 320 на 320 пикселей с использованием двукратной субдискретизации пикселей. Хотя более тяжелый, чем проводной аналог, использование беспроводной конструкции привело к социальному поведению, сравнимому с поведением мышей без минископа, тогда как более легкая проводная версия фактически показала меньшее социальное исследование (дополнительные данные в Shuman et al., 2018).

FinchScope

Проект FinchScope, начатый в Бостонском университете (Liberti et al., 2017), привел к созданию микроскопа с открытым исходным кодом примерно в то же время, что и Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. В этом проекте используются детали с высоким разрешением, напечатанные на 3D-принтере (низкофлуоресцентные смолы FGPBLK01 и FGPBLK02 на настольном принтере Form 2), а также дешевые стандартные аппаратные компоненты, такие как интегрированная система камеры с датчиком CMOS с микрофоном (MC900, третий глаз электроника, динамический диапазон: 48 дБ) и плата Arduino Mega для аппаратного управления.Он имеет поле зрения 800 на 600 мкм (640 на 480 пикселей) с использованием оптической конструкции, аналогичной конструкции минископа UCLA первого поколения с линзой GRIN в качестве объектива и ахроматической линзой для фокусировки изображения на объективе. Датчик изображения CMOS. Датчик камеры позволяет снимать с частотой 30 Гц, а использование компонентов, напечатанных на 3D-принтере, позволяет быстро создавать прототипы и создавать более легкие конструкции с меньшими затратами по сравнению с обработанными деталями. Этот зонд FinchScope включает револьверную головку с резьбой для фокусировки, весит около 1 штуки.8 г. Программное обеспечение позволяет осуществлять обратную связь с малой задержкой для запуска записи во время вокализации птиц и сыграло решающую роль в открытии нейронной динамики, лежащей в основе стабильных двигательных паттернов (Liberti et al., 2016). Благодаря дополнительному беспроводному передатчику 2 г и литий-полимерному аккумулятору FinchScope может полностью выполнять беспроводную запись и передачу данных.Дополнительный вес способствует его применению у более крупных животных, способных нести дополнительный вес, и разработчики заявили об успехе, используя беспроводную версию для мышей.

miniScope

Проект miniScope, разработанный в Национальном институте злоупотребления наркотиками (NIDA), представляет собой минископ массой 2,4 г, который использовался для изучения прямого и непрямого пути движения полосатого тела, исследуя, как активность коррелирует с текущим двигательным поведением (Barbera et al., 2016) а также то, как паттерны активности в медиальной префронтальной коре связаны с социальной значимостью и новизной во время поведения (Liang et al., 2018; Zhang et al., 2018). Корпус miniScope был напечатан на 3D-принтере снаружи с использованием SLArmor с никелевым покрытием, прочного, легкого и светонепроницаемого материала (Protolabs). Как и FinchScope, miniScope имеет турель с резьбой для фокусировки. Он использует ахроматическую дуплетную линзу для фокусировки на датчике изображения CMOS и асферическую линзу в сочетании с релейной линзой GRIN для достижения глубоких целей. Поле зрения большое, 1,1 на 1,1 мм, проецируется на поверхность с разрешением 400 на 400 пикселей стандартного КМОП-сенсора (MT9V022IA7ATM, On Semiconductor, динамический диапазон> 55 дБ) с частотой кадров 10 Гц.Сбор данных происходит через плату программируемой вентильной матрицы (FPGA) Opal Kelly, которая обеспечивает быстрое управление считыванием видеоданных и управление возбуждающим светодиодным источником света.

ЧЭндоскоп

В Университете Торонто была разработана конструкция минископа под названием Чендоскоп. Этот минископ имеет корпус, который можно напечатать на 3D-принтере (Jacob et al., 2018b), и он используется с 5-мегапиксельным интегрированным модулем камеры 1,5 г (MU9PC-MBRD, Ximea, динамический диапазон: 38 дБ), что дает общий вес прицела. к 4.5 г. Для достижения дискретизации 20 Гц используется объединение пикселей для достижения эффективной области изображения 648 на 486 пикселей, что соответствует полю обзора примерно 500 мкм в поперечнике. Фокусировка достигается за счет револьверной головки, как в FinchScope и miniScope. Источник питания минископа необходимо регулировать вручную, в то время как видеоданные собираются через программный интерфейс Python, установленный на стандартном ПК. Простота конструкции, в которой используется коммерчески доступное оборудование для обработки изображений, такое как FinchScope, делает его привлекательным вариантом для исследователей, которые предпочитают использовать готовые компоненты, а не специальные печатные платы (PCB).

Обсуждаемые выше минископы отличаются простотой сборки, форм-фактором и функциональностью, что позволяет удовлетворить особые потребности исследователей. Из-за природы этих проектов с открытым исходным кодом и их относительно простых компонентов это не является серьезной проблемой, поскольку модификации могут быть легко реализованы, что сокращает цикл разработки. Ниже мы сосредоточимся на некоторых способах дальнейшего улучшения функциональности минископа.

Улучшение функциональности минископов с открытым исходным кодом

Линзы электросмачивания

Линзы для электросмачивания (EWLs, a.к.а. Жидкие линзы) состоят из границы раздела двух несмешивающихся жидкостей (обычно воды и масла), которые под действием напряжения деформируются и действуют как линзы, позволяющие осуществлять электронную фокусировку без необходимости ручной настройки (Рисунок 3). Это особенно важно для продольных исследований, когда экспериментатору необходимо восстановить ранее использовавшуюся фокальную плоскость, а один и тот же минископ используется либо для нескольких животных, либо для разных областей одного и того же животного. Более того, меньшая потребность в механическом обращении с чувствительными компонентами минископа обеспечивает более длительный срок хранения.Дополнительным преимуществом является возможность быстрой регулировки оптической мощности EWL в пределах типичной частоты кадров, используемой с минископами (30 Гц), что можно использовать, если кто-то хочет выполнять запись с чередованием из разных фокальных плоскостей. Коммерческие поставщики начали внедрять электронную фокусировку в свои мини-микроскопы, а миниатюризация и доступность этих линз (например, Varioptic Arctic 16F0) позволили использовать их в мини-микроскопах с открытым исходным кодом. Например, прикрепленный к голове микроскоп с двухфотонным возбуждением и оптоволоконным соединением включает EWL, позволяющий вести многоплоскостную запись у мышей без ограничений (Ozbay et al., 2018), и минископы на основе однофотонного возбуждения последуют этому примеру.

Рисунок 3 . Электросмачивающие линзы (EWL). (A) Изображение объекта, сфокусированное с помощью EWL. (B) Имеющиеся в продаже миниатюрные EWL весят всего 0,2 г при внешнем диаметре ~ 6 мм. (C) Пример использования EWL (Varioptic Arctic 25H0) для фокусировки на испытательной цели ВВС США 1951 года со сдвигом фокусного расстояния ± 200 мкм.

Двухцветная флуоресценция

При наличии генетически кодируемых репортеров активности, флуоресцирующих на спектрально разделимых длинах волн (Chen et al., 2013; Dana et al., 2016), становится возможным нацеливать различные клеточные популяции для визуализации, обеспечивая понимание того, как динамика двух нейрональных популяций коррелирует с конкретным поведением (Jennings et al., 2019). Одним из способов реализации двухцветного изображения в минископе является добавление дополнительного дихроичного зеркала на пути излучения для разделения флуоресцентного света от двух флуорофоров на два детектора, которые могут быть расположены независимо друг от друга. Это решение, реализованное коммерческим поставщиком миниатюрных микроскопов, позволяет обойти проблему хроматической аберрации, присущую линзам GRIN.Такие аберрации приводят к фокальному смещению (до ~ 100 мкм для линз GRIN большего диаметра и в зависимости от оптической конфигурации), что вызывает выборку флуоресценции различных длин волн из разных фокальных плоскостей (рис. 4). В качестве альтернативы, для коррекции аберраций можно использовать оптические элементы, расположив плоско-выпуклую линзу непосредственно за укороченной линзой GRIN (Leiner and Prescott, 1983), полностью заменив линзу объектива GRIN ахроматическим стеком линз, или с помощью с использованием дифракционных оптических элементов (требующих нестандартной оптики).Одновременное получение двухцветных изображений также может быть достигнуто с помощью одного датчика изображения с измененным оптическим трактом минископа. Два чередующихся источника света в сочетании с двумя полосовыми фильтрами и дихроичным фильтром используются для генерации и объединения спектрально разделенных возбуждений. Двухполосный дихроичный и эмиссионный фильтр используются на пути эмиссии для передачи излучаемой флуоресценции. Обнаружение различных длин флуоресцентных волн достигается за счет чередующихся считываний с одного датчика, синхронизированного с чередующимися источниками света.Датчики цветного изображения, которые используют фильтр Байера RGB, также могут использоваться для визуализации двух флуорофоров, но с компромиссом разрешения изображения для спектральной информации и часто требуют дополнительной автономной обработки, чтобы изолировать отдельные длины волн от спектрально перекрывающейся записи RGB. Первые попытки разработки двухцветных мини-микроскопов с открытым исходным кодом уже начались и привели к созданию двухцветных мини-микроскопов с открытым исходным кодом с некоторой коррекцией хроматических аберраций (Jacob et al., 2018a; Leman et al., 2018). Хотя коррекция хроматической аберрации может быть реализована путем замены линзы объектива GRIN ахроматической оптикой, для доступа к более глубоким структурам может потребоваться ретрансляционная линза GRIN, которая вносит свои собственные аберрации.

Рисунок 4 . Смещение фокуса из-за хроматических аберраций. Схема, показывающая смещение фокуса стержневой линзы GRIN при отображении двух цветов.

Оптогенетика

Используя управляемые светом каналы, которые имеют минимально перекрывающиеся спектры с флуоресцентным репортером активности, можно создать минископ с одновременной нейронной визуализацией и возможностями манипулирования в поле зрения (Stamatakis et al., 2018). Этого можно достичь, используя путь двойного возбуждения, аналогичный описанному в предыдущем разделе. В зависимости от выбранного опсина и репортера флуоресцентной активности эти минископы с оптогенетической функцией могут уменьшить, но не полностью устранить перекрестные помехи между каналами. Например, Stamatakis et al. продемонстрировали в своей коммерческой реализации миниатюрного оптогенетического микроскопа, что источник света для визуализации ослабляет оптогенетический ответ, который может быть вызван при приготовлении теста на срез.Это продемонстрировало, что при настройке источника возбуждающего света для визуализации следует действовать осторожно, чтобы обеспечить хороший компромисс между отношением сигнал-шум и минимальным кроссовером сигнала. Альтернативный подход состоит в том, чтобы стимулировать поле зрения вне поля зрения визуализации, что возможно путем имплантации оптических волокон или беспроводных имплантируемых микро-светодиодов (Shin et al., 2017). Однако для этого требуется отдельный драйвер светодиода, синхронизированный с мини-микроскопом. Альтернативная реализация могла бы использовать дополнительный драйвер светодиода на самом минископе в сочетании с имплантатом для оптогенетической стимуляции (De Groot et al., 2018).

Широкопольное изображение

До недавнего времени поля зрения существующих мини-микроскопов с открытым исходным кодом с разрешением одной ячейки расширялись до максимального заявленного поля зрения ~ 1 на 1 мм с использованием ахроматического объектива (Zhang et al., 2018). В области относительно небольших микроскопов, которые могут носить с собой мыши, датчики изображения большего размера могут быть объединены с набором плосковыпуклых линз и двойной вогнутой линзы для получения большего (3 на 4 мм 2 ) поля зрения. мнение (Leman et al., 2018). Для визуализации позвоночных животных крупнее мышей cScope (33 г), разработанный в Принстонском университете, дает возможность значительно расширить поле зрения (до 7,8 мм × 4 мм) и исследовать паттерны внутрикортикальной активности во время свободного передвижения. поведение при разрешении менее одной клетки (Scott et al., 2018). Благодаря использованию электроники формирования изображений и сбора данных минископа Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе большое поле зрения cScope было достигнуто за счет оптимизированной оптики макроскопа и сопоставления изображений, полученных при различных угловых положениях датчика изображения (рис. 5).В общем, заменой объектива GRIN и выбором линз с коррекцией аберрации можно получить более широкое поле зрения: тенденция, которая будет реализована в будущих мини-микроскопах с открытым исходным кодом.

Рисунок 5 . Макроскоп cScope разработан в Принстонском университете. Схема, показывающая оптику, используемую для увеличения поля зрения налобного микроскопа. Схема любезно предоставлена ​​С.Ю. Тиберж, Принстонский университет.

Нейроваскулярное соединение

Гемодинамические сигналы загрязняют сигналы флуоресценции, полученные с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.В дополнение к светодиодному источнику света 480 нм для флуоресцентной визуализации, конструкция микроскопа cScope включает светодиодную подсветку (530 нм) для измерения собственного оптического сигнала (OIS). Последний обеспечивает измерение оксигенации крови, которое можно использовать для коррекции сигнала флуоресценции, возникающего в результате нейронной активности. Таким образом, cScope можно использовать не только для мониторинга нейрональной активности в больших областях мозга и вычитания гемодинамического сигнала, но и для получения информации о нейроваскулярном взаимодействии.Для изучения этого на мышах недавно был разработан 9-граммовый мини-микроскоп с системой снижения веса, ограничивающей переносимый на голову вес до 3 граммов (Senarathna et al., 2019). В этом микроскопе используется светодиод 452 нм для возбуждения флуоресценции, светодиод 570 нм для визуализации OIS и лазерный диод 680 нм для измерения поглощения дезоксигемоглобина. Набор оранжевых светодиодов используется для синхронизации сигналов осциллографа с периферийным оборудованием.

Объемная визуализация

Принцип, лежащий в основе светопольной микроскопии, заключается в сборе угловой информации вместе с позиционной информацией о световых лучах, излучаемых из объема (например,g., их интенсивность, направление, длину волны или поляризацию) и использовать вычислительные методы для восстановления объемной информации post hoc из информации, содержащейся в 2D-изображении (Cohen et al., 2014; Prevedel et al., 2016). Одна из распространенных реализаций светопольной микроскопии использует матрицу микролинз (MLA) для фокусировки света, идущего под разными углами, на разные пиксели датчика изображения. MLA был реализован в реконфигурированном минископе UCLA (MiniFLM) для достижения объема 700 на 600 на 360 мкм 3 , который мог быть получен при 16 Гц (Skocek et al., 2018). Процедура итеративного извлечения источника (Seed-Iterative Demixing, SID) была разработана специально для использования с визуализацией светового поля в рассеивающей ткани (Nöbauer et al., 2017) и может использоваться в сочетании с микроскопом MiniLFM для надежного извлечения сигналов от нейронов. разделены на 15 мкм и более. Некоторые сложности возникают при использовании MiniFLM, поскольку сложнее исправить артефакты движения и некоторая пространственная информация обменивается на угловую, но общее увеличение объема данных, которые могут быть собраны при визуализации объемов с частотой кадров видео (например,g., в сочетании с клеточно-специфическим нацеливанием репортеров активности) может быть значительным по сравнению с широкопольной визуализацией.

Запись по беспроводной и беспроводной сети

Разработаны беспроводные (Liberti et al., 2017) и беспроводные (Shuman et al., 2018) мини-микроскопы с открытым исходным кодом

. Оба работают от бортовых литий-полимерных батарей, которые придают конструкции микроскопа значительный вес. Потребляемая мощность зависит от полосы пропускания данных и является одним из ограничивающих факторов при разработке миниатюрного беспроводного микроскопа из-за требований к размеру батареи и весу.Энергоэффективные CMOS-датчики изображения могут использоваться вместе с объединением пикселей или субдискретизацией пикселей для минимизации энергопотребления при сохранении поля зрения, сопоставимого с проводными мини-микроскопами. Большинство датчиков изображения, используемых в миниатюрных микроскопах, имеют более высокую плотность пикселей, чем требуется, по сравнению с рассчитанной функцией рассеяния точки для их оптического пути и пониженным пространственным разрешением из-за рассеяния в ткани. Таким образом, выбирается более низкое или субдискретизированное разрешение сенсора для увеличения времени записи при сохранении приемлемых требований к весу.Кроме того, беспроводное питание миниатюрной конструкции с низким энергопотреблением возможно с беспроводной передачей мощности в ближнем поле, аналогичной тем, которые уже реализованы для беспроводной оптогенетической стимуляции (Montgomery et al., 2015; Park et al., 2015; Shin и др., 2017).

Электрофизиология

В рамках проекта UCLA Miniscope разрабатываются различные реализации минископов, которые поддерживают одновременную внеклеточную запись и визуализацию. Это может быть достигнуто с помощью автономной записывающей системы ephys, синхронизированной с минископом, или путем полного включения записывающего оборудования ephys в систему Miniscope с использованием микросхем цифрового электрофизиологического интерфейса (например,г., Интана RHD2132 / 64). Для крыс в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе был разработан блок для записи на микроприводе с количеством каналов до 18 (OvalDrive 18-ES), который позволяет проводить одновременные электрофизиологические записи или вольтамперометрию и визуализацию у крыс. Кроме того, могут быть вставлены канюли для инъекций жидкости и оптические волокна, позволяющие управлять активностью во время визуализации через минископ у свободно движущихся крыс.

Поведенческое считывание

Записи с минископа

можно комбинировать с камерами, которые фиксируют поведение животных, но хранение, обработка и аннотирование таких наборов поведенческих данных часто является нетривиальной задачей и требует много времени.Платформа для обработки потоков данных под названием Bonsai (Lopes et al., 2015) помогает автоматизировать части такого анализа, и был разработан модуль для поддержки UCLA Miniscope. Альтернативный способ регистрации поведенческого состояния животного — интегрировать инерциальный измерительный блок (IMU) в минископ для измерения трехмерного ускорения и ориентации головы (De Groot et al., 2018). Поведение, связанное с уходом, приемом пищи и выращиванием, связано с различными моделями ускорения, которые можно использовать для классификации поведения (Venkatraman et al., 2010; Паске и др., 2016; Wilson et al., 2018). Для более сложных систем отслеживания поведения использовались многокамерные системы, например, для отслеживания положения тела в 3D (Mimica et al., 2018), но для этого требуются значительные ресурсы, которые могут быть доступны не для всех лабораторий. Другая платформа отслеживания (3D Tracker) использует четыре камеры измерения глубины RealSense TM и является относительно недорогой и эффективной для отслеживания позы и социальных взаимодействий у крыс, но требует значительной пост-обработки (Matsumoto et al., 2013; Накамура и др., 2016). Достижения в области машинного обучения приведут к автоматическому анализу поведенческих мотивов, зафиксированных в данных камеры, например, при извлечении временной структуры позы животного (Wiltschko et al., 2015; Pereira et al., 2019) или к безмаркерного отслеживания животных ( Mathis et al., 2018). Open Ephys, которая разрабатывает инструменты с открытым исходным кодом для нейробиологии, сделала шаг вперед с решением для отслеживания поведения с использованием систем отслеживания, изначально разработанных для потребительских игр: отслеживания SteamVR TM от Valve.Он использует ортогональные лазерные излучатели в базовой станции, которые охватывают пространство (два сканирования 2pi / 360 °) вместе с фотодиодами и IMU на отслеживаемом объекте (например, минископе) для получения информации об ориентации, скорости и угловой скорости отслеживаемых объектов. в реальном времени. Эта система выгодна тем, что не требует такой же постобработки, как в вышеупомянутых системах, доступна по цене и может быть интегрирована с другими периферийными устройствами Open Ephys.

Двухфотонное возбуждение

Двухфотонное возбуждение предлагает хорошо известные преимущества по сравнению с однофотонным возбуждением, включая небольшой объем возбуждения, повышенное проникновение в ткани и снижение фототоксичности за счет использования более длинных волн возбуждения.Небольшой фемтолитровый объем возбуждения значительно улучшает оптическое сечение образца и тем самым гарантирует, что собранный свет исходит только от клеточных и субклеточных структур, расположенных вдоль фокальной плоскости. Первая задокументированная попытка создать миниатюрный микроскоп с двухфотонным возбуждением на основе волокна (Helmchen et al., 2001) продемонстрировала его полную осуществимость, даже несмотря на то, что не удалось получить функциональное изображение нейронов во время поведения, отчасти из-за сильных артефактов движения.Микроскоп был также сравнительно тяжелым и большим (25 г, 70 мм в высоту), что ограничивало его применение, связанное с естественным поведением мелких животных. Первоначально пьезоэлектрический элемент использовался для возбуждения колебаний в усиленном волокне для создания диаграммы сканирования Лиссажу (Helmchen, 2002; Flusberg et al., 2005, 2008). Дальнейшие усовершенствования, основанные на аналогичной конструкции, привели к значительно более легким портативным микроскопам с двухфотонным возбуждением (Göbel et al., 2004; Flusberg et al., 2008; Sawinski et al., 2009), используемым для изображения свободно движущихся мышей и крыс (см. также Озбай и др., 2018). Также были разработаны альтернативные конструкции сканирования, основанные на зеркалах микроэлектромеханических систем (МЭМС) (Piyawattanametha et al., 2006; Zong et al., 2017). Среди них портативный сканирующий микроскоп с двухфотонным возбуждением весом около 2 г использовался для изучения энторинальной коры у свободно ведущих мышей (Zong et al., 2017; Obenhaus et al., 2018). Дорогие настольные лазеры используются для достижения двухфотонного возбуждения и объединяются в одно оптическое волокно, в то время как флуоресценция собирается через оптическое волокно для обнаружения.Стоимость высокочастотного импульсного лазера и других периферийных устройств (например, фотоумножителей, изготовленных на заказ оптических волокон для повышения эффективности сбора и гибкости) может ограничить повсеместное использование двухфотонных микроскопов по сравнению с миниатюрными микроскопами с однофотонным возбуждением. Кроме того, недавнее комплексное исследование, сравнивающее двухфотонную визуализацию кальция с однофотонным возбуждением, с использованием настольного двухфотонного микроскопа и миниатюрного однофотонного микроскопа с возбуждением, показало, что настройка ориентации одних и тех же идентифицированных нейронов была сопоставимой независимо от типа используемого флуоресцентного возбуждения. (Glas et al., 2018). Таким образом, несмотря на ключевые преимущества микроскопии с двухфотонным возбуждением, миниатюрные флуоресцентные микроскопы с однофотонным возбуждением остаются полезными и доступными инструментами для получения изображений с разрешением клеток при неограниченном поведении. Это тем более справедливо для высокомобильных животных, таких как птицы и летучие мыши, где волоконная связь возбуждающего и испускаемого света непрактична.

Анализ данных

Мозг животных движется во время свободного передвижения, а это означает, что перед извлечением сигнала требуется коррекция движения.Хотя были реализованы различные типы алгоритмов коррекции движения (Dombeck et al., 2007; Greenberg and Kerr, 2009; Dubbs et al., 2016; Mitani and Komiyama, 2018), кусочно-жесткая реализация, адаптированная для флуоресцентных эндоскопических данных, особенно зарекомендовала себя. эффективен при исправлении нежестких деформаций (Пневматикакис и Джованнуччи, 2017). Более поздний подход, использующий структуру иерархической регистрации видео для различения стабильных кадров от кадров с большим межкадровым сдвигом, может обеспечить еще более надежную регистрацию изображений (Lu et al., 2018). Как только кадры зарегистрированы, необходимо извлечь и демиксировать сигналы из обнаруженных ячеек. Первоначально подход PCA / ICA использовался для данных, полученных с помощью миниатюрных флуоресцентных микроскопов (Mukamel et al., 2009), но этот подход в основном был заменен более точными методами, основанными на CNMF, с добавленной моделью для оценки и учета изменяющегося во времени фона. флуктуации флуоресценции под названием CNMF-E (Zhou et al., 2018). Было высказано предположение, что, хотя алгоритм CNMF-E точен при обнаружении клеток, он может иметь более высокий уровень ложных срабатываний, чем подход MIN1PIPE, разработанный Лу и др.(2018), в котором используется альтернативный метод устранения фоновых колебаний флуоресценции и усиления нейронных сигналов. Выходной сигнал обычно представляет собой масштабированную версию частичного изменения флуоресценции, которая может быть нормализована путем деления на стандартное отклонение или оценку базового шума. Деконволюция необработанного сигнала часто выполняется для подавления сигнала и оценки времени событий, которые отражают базовую нейронную активность.

Будущие разработки

Сообщество мини-микроскопов с открытым исходным кодом находится на грани выпуска широкого спектра мини-микроскопов второго поколения, которые включают в себя ETL для фокусировки, двухцветное обнаружение флуоресценции, большее поле обзора, меньшие следы и возможности оптогенетического и поведенческого считывания. .Какие события ждут впереди?

Эксперименты с замкнутым циклом

Доступность плат FPGA (Ciliberti and Kloosterman, 2017; Siegle et al., 2017; Buccino et al., 2018) позволяет проводить быстрые эксперименты с замкнутым циклом (Ahrens et al., 2012; Clancy et al., 2014; Packer et al., 2018). al., 2014; Prsa et al., 2017), дающие представление, например, о сенсомоторном и протезном обучении в нейронных цепях, которые имеют отношение к разработке интерфейсов мозг-машина. Обнаружение в реальном времени определенного типа поведения или паттерна активности можно использовать для непосредственного управления входными путями или целевыми клеточными сборками.Затем можно исследовать клеточные субстраты, лежащие в основе выражения поведения или взаимодействия между мозгом, телом и окружающей средой (Buckley and Toyoizumi, 2018). Системы с замкнутой петлей также можно использовать для обнаружения и подавления развития эпилептиформной активности (Сорокин и др., 2017) и определения клеточных механизмов, лежащих в основе эффективной глубокой стимуляции мозга (Парастарфейзабади и Кузани, 2017; Гасеми и др., 2018). . Фреймворки с открытым исходным кодом, такие как Open Ephys, уже разработали аппаратную интеграцию FPGA для экспериментов с замкнутым циклом с малой задержкой (Siegle et al., 2017), и такие возможности замкнутого цикла могут быть перенесены на мини-микроскопы с открытым исходным кодом. Учитывая расширение функциональных возможностей минископа и сопутствующее увеличение количества каналов данных, которые необходимо обрабатывать, использование ПЛИС упростит обработку данных и управление. При наличии мини-микроскопов, позволяющих получать объемные изображения и необходимости демультиплексирования сигналов, такая технология также может способствовать эффективному извлечению данных.

Пользовательская оптика

Использование набора ахроматических линз вместо объектива GRIN помогает уменьшить, но не полностью удалить хроматические аберрации в большинстве конфигураций двухцветных минископов.Одним из решений является использование дифракционного элемента или аксикона, корректирующего хроматическую аберрацию на оптическом пути. Нанолитография позволяет печатать на 3D-принтере специальные оптические элементы, в том числе корректирующие хроматические аберрации (Schmid et al., 2018), коллиматический свет (Thiele et al., 2016) и выступающие в качестве линз высокого разрешения (Gissibl et al., 2016). ). Миниатюризация этих оптических компонентов в сочетании с компактным CMOS-датчиком может привести к созданию значительно более легких и меньших мини-микроскопов, позволяющих вести запись из нескольких регионов одновременно с использованием более чем одного налобного мини-микроскопа.Более того, резонансные плазмонные метаповерхности в сочетании с материалами с фазовым переходом могут использоваться для создания миниатюрных нанооптических элементов, которые действуют как бифокальные зум-линзы и могут управлять светом (Yin et al., 2017). Трехмерная печать оптики по-прежнему опирается на дорогие двухфотонные лазеры, которые наращивают компоненты слой за слоем в процессе, отнимающем много времени, что ограничивает их широкое распространение в настоящее время в мини-микроскопах с открытым исходным кодом. Тем не менее, ряд академических институтов начали предоставлять платную инфраструктуру нанолитографии, которая могла бы сделать эту технологию достаточно распространенной, чтобы начать интеграцию оптических элементов, напечатанных на 3D-принтере, в минископы.Более того, после тестирования окончательной 3D-печатной оптической конструкции, изготовленную на заказ оптику, вдохновленную этими конструкциями, можно будет заказать через специализированных подрядчиков по микрооптике.

Изображение без линз

Важные шаги в направлении дальнейшей миниатюризации устройств формирования изображений для флуоресцентной микроскопии были сделаны путем замены фокусирующих элементов в минископах диффузором или маской на пути излучения флуоресценции (Adams et al., 2017; Antipa et al., 2017). Рассеивающий элемент с оптимизированной амплитудной маской в ​​сочетании с расчетным разделением сигналов позволяет восстанавливать сигналы из объема на основе информации, содержащейся в 2D-изображениях (аналогично тому, что использовалось для построения изображений светового поля с включением MLA).Безлинзовые мини-микроскопы могут значительно снизить вес и занимаемую площадь для головных систем визуализации, а также увеличить их поле зрения. Одно из предостережений в настоящее время заключается в том, что источники света должны быть интегрированы в систему, чтобы обеспечить возбуждение флуоресценции. В принципе, это можно сделать, разместив μLED вокруг датчика изображения или имплантировав оптические волноводы, которые могут создавать управляемые световые пучки и листы. Еще одно предостережение заключается в том, что, как и в случае с микроскопом MiniLFM, коррекция движения может быть трудной для реализации.Однако идея безлинзового мини-микроскопа многообещающа и может привести к созданию гораздо более легких портативных флуоресцентных микроскопов с большим полем поля.

Захват с высокой частотой кадров

Большинство минископов в настоящее время используются в сочетании с GECI, которые имеют — в дополнение к Ca 2+ , обеспечивающему косвенное измерение текущей активности — относительно медленную кинетику. Таким образом, обычно достаточно типичной частоты кадров 30 Гц. С быстрым улучшением генетически кодируемых индикаторов напряжения и их потенциала для клеточно-специфического нацеливания in vivo (Flytzanis et al., 2014; Marshall et al., 2016; Пяткевич и др., 2018; Bando et al., 2019; Quicke et al., 2019) становится актуальным достижение более высокой частоты кадров с помощью высокочувствительных датчиков изображения. Доступные в настоящее время CMOS-датчики изображения, достаточно малые для интеграции в минископы, часто могут достигать частоты кадров в несколько сотен Гц, достаточной для наблюдения за колебаниями напряжения на уровне населения (Marshall et al., 2016), за счет комбинации субдискретизации пикселей, объединения пикселей и уменьшения количество активных строк пикселей.Для достижения разрешения с одной ячейкой и с одним потенциалом действия, вероятно, потребуется разработать как более яркие индикаторы напряжения, так и меньшие научные КМОП-сенсоры с задней подсветкой. Учитывая дальнейшую миниатюризацию электроники, необходимо решить проблему нагрева. Тепло может быть отведено за счет обеспечения достаточной конвекции воздуха или через металлические радиаторы, оба из которых могут добавить значительный вес конструкции мини-микроскопа. Работа с более высокими частотами дискретизации потребляет больше энергии и, как правило, требует дополнительного рассеивания тепла, что устанавливает ограничение на использование этой высокой частоты кадров, особенно в беспроводных или беспроводных конфигурациях.

Заключительные замечания

Разработка мини-микроскопов с открытым исходным кодом дала большой импульс нейробиологам, которым нужны доступные, доступные и понятные инструменты для визуализации мозга позвоночных во время естественного поведения. Проекты с открытым исходным кодом обычно имеют относительно простые планы проектирования с модульными компонентами, которые легко доступны или могут быть изготовлены на заказ с использованием 3D-принтеров. Низкая стоимость этих компонентов и сравнительная простота сборки таких оптических прицелов привели к их повсеместной адаптации.Хотя многие из этих систем достаточно просты, чтобы их можно было распространить и довольно легко внедрить, по-прежнему сложно интегрировать более сложные, менее распространенные технологии в мини-микроскопы с открытым исходным кодом в большом масштабе. К счастью, доступ к доступным, высококачественным линиям с небольшими партиями для производства нестандартных печатных плат, оптики, станков с ЧПУ и деталей, изготовленных литьем под давлением, в последние годы значительно расширился и, вероятно, сохранится. Компоненты, которые всего несколько лет назад были громоздкими и дорогими, теперь уменьшены в размерах и доступны по цене, например, EWL для быстрой электрической фокусировки, высокоскоростные CMOS-датчики с задней подсветкой и маломощные IMU, которые можно интегрировать в минископы для считывания ускорения головы. и ориентация.Следуя этой тенденции, даже такие технологии, как нанолитография, которые в настоящее время кажутся несколько экзотическими для проекта разработки с открытым исходным кодом, через несколько лет могут стать более обычным явлением. Возможность создания легких мини-микроскопов с небольшой площадью основания будет способствовать благополучию животных и улучшит считывание нейронной активности в естественных условиях. Сообщество с открытым исходным кодом имеет сильные стороны, и постоянный открытый обмен новыми идеями приведет к улучшению минископов (например, чувствительности, поля зрения и экспериментального контроля с обратной связью), более широкому распространению и лучшему пониманию мозга поскольку он взаимодействует с окружающей средой.

Авторские взносы

DA и TH подготовили рисунки и написали рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана Health ~ Holland (LSHM18001-H001; TH) и NSF Neurotech Hub (1700408; DA).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Благодарим Уилла Либерти III, А.Джейкоб и С. Thiberge за предоставление схем FinchScope, CHEndoscope и cScope соответственно.

Сноски

  1. https://github.com/PrincetonUniversity/cScope
  2. https://goo.gl/aJxJQy
  3. https://github.com/jonnew/Bonsai.Miniscope
  4. http://www.3dtracker.org
  5. http://www.open-ephys.org/
  6. https://github.com/flatironinstitute/NoRMCorre
  7. https: // github.ru / zhoupc / CNMF_E
  8. https://github.com/JinghaoLu/MIN1PIPE

Список литературы

Адамс, Дж. К., Боминатан, В., Авантс, Б. В., Веркоса, Д. Г., Е, Ф., Баранюк, Р. Г. и др. (2017). Однокадровая трехмерная флуоресцентная микроскопия с использованием сверхминиатюрного безлинзового микроскопа FlatScope. Sci. Adv. 3: e1701548. DOI: 10.1126 / sciadv.1701548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ахарони Д., Хах Б. С., Силва А.Дж., Гольшани П. (2019). Свет, который мы видим: новая эра миниатюрной микроскопии. Нац. Методы 16, 11–13. DOI: 10.1038 / s41592-018-0266-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аренс, М. Б., Ли, Дж. М., Орджер, М. Б., Робсон, Д. Н., Шиер, А. Ф., Энгерт, Ф. и др. (2012). Общемозговая динамика нейронов во время двигательной адаптации у рыбок данио. Природа 485, 471–477. DOI: 10.1038 / природа11057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Антипа, Н., Kuo, G., Heckel, R., Mildenhall, B., Bostan, E., Ng, R., et al. (2017). DiffuserCam: трехмерное изображение с однократной экспозицией без линз. arXiv [Препринт] 1710.02134 [cs.CV]. Доступно в Интернете по адресу: http://arxiv.org/abs/1710.02134

Google Scholar

Бандо Ю., Сакамото М., Ким С., Айзенштат И. и Юсте Р. (2019). Сравнительная оценка генетически закодированных показателей напряжения. Cell Rep. 26, 802.e4–813.e4. DOI: 10.1016 / j.celrep.2018.12.088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барбера, Г., Лян, Б., Чжан, Л., Герфен, К. Р., Кулурчиелло, Э., Чен, Р. и др. (2016). Пространственно компактные нервные кластеры в спинном полосатом теле кодируют информацию, имеющую отношение к движению. Neuron 92, 202–213. DOI: 10.1016 / j.neuron.2016.08.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бокарсли М. Э., Цзян В.-К., Ван К., Дудман Дж. Т., Цзи Н. и Апонте Ю. (2015). Минимально инвазивная система микроэндоскопии для in vivo функциональной визуализации глубоких ядер головного мозга мыши. Биомед. Опт. Экспресс 6, 4546–4556. DOI: 10.1364 / boe.6.004546

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Буччино, А. П., Лепперёд, М. Э., Драгли, С.-А., Хефлигер, П., Файн, М., и Хафтинг, Т. (2018). Модули с открытым исходным кодом для отслеживания поведения животных и стимуляции с обратной связью на основе Open Ephys и Bonsai. J. Neural Eng. 15: 055002. DOI: 10.1088 / 1741-2552 / aacf45

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бакли, К.Л., Тойоидзуми Т. (2018). Теория того, как активное поведение стабилизирует нейронную активность: модуляция усиления нейронов с помощью обратной связи с окружающей средой. PLoS Comput. Биол. 14: e1005926. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1005926

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cai, D. J., Aharoni, D., Shuman, T., Shobe, J., Biane, J., Song, W., et al. (2016). Общий нейронный ансамбль связывает различные контекстные воспоминания, закодированные во времени. Природа 534, 115–118.DOI: 10.1038 / природа17955

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, T.-W., Wardill, T.J., Sun, Y., Pulver, S.R., Renninger, S.L., Baohan, A., et al. (2013). Сверхчувствительные флуоресцентные белки для визуализации активности нейронов. Природа 499, 295–300. DOI: 10.1038 / природа12354

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, K.-S., Xu, M., Zhang, Z., Chang, W.-C., Gaj, T., Schaffer, D.V., et al. (2018).Гипоталамический переключатель для быстрого и медленного сна. Neuron 97, 1168.e4–1176.e4. DOI: 10.1016 / j.neuron.2018.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клэнси, К. Б., Коралек, А. К., Коста, Р. М., Фельдман, Д. Э., и Кармена, Дж. М. (2014). Произвольная модуляция оптически записанных сигналов кальция во время обучения нейропротезам. Нац. Neurosci. 17, 807–809. DOI: 10.1038 / nn.3712

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коэн, Н., Янг, С., Андалман, А., Брокстон, М., Гросеник, Л., Дейссерот, К. и др. (2014). Повышение производительности микроскопа светового поля с помощью кодирования волнового фронта. Опт. Экспресс 22, 24817–24839. DOI: 10.1364 / OE.22.024817

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дана, Х., Мохар, Б., Сан, Ю., Нараян, С., Гордус, А., Хассеман, Дж. П., и др. (2016). Чувствительные индикаторы кальция красного белка для визуализации нервной активности. Элиф 5: e12727. DOI: 10.7554 / eLife.12727

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Гроот, А., Бос, Дж., Ван Велдхейзен, Дж., Коппенс, Дж., Ходемакер, Х., Де Зееу, К. И., и др. (2018). «Минископы уменьшенного размера для визуализации нескольких областей мозга при естественном поведении», номер аннотации : F18–1717. Fens Forum 2018 Берлин, Германия.

Домбек Д. А., Хаббаз А. Н., Коллман Ф., Адельман Т. Л. и Танк Д. В. (2007). Визуализация крупномасштабной нейронной активности с клеточным разрешением у бодрствующих мобильных мышей. Neuron 56, 43–57. DOI: 10.1016 / j.neuron.2007.08.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флусберг, Б.А., Юнг, Дж. К., Кокер, Э. Д., Андерсон, Э. П., и Шнитцер, М. Дж. (2005). In vivo Визуализация мозга с помощью портативного двухфотонного флуоресцентного микроэндоскопа весом 3,9 грамма. Опт. Lett. 30, 2272–2274. DOI: 10.1364 / ol.30.002272

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флусберг, Б.A., Nimmerjahn, A., Cocker, E. D., Mukamel, E. A., Barretto, R. P. J., Ko, T. H., et al. (2008). Высокоскоростная миниатюрная флуоресцентная микроскопия у свободно движущихся мышей. Нац. Методы 5, 935–938. DOI: 10.1038 / nmeth.1256

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Flytzanis, N. C., Bedbrook, C. N., Chiu, H., Engqvist, M. K. M., Xiao, C., Chan, K. Y., et al. (2014). Варианты архаэродопсина с повышенной чувствительностью к напряжению флуоресценции в нейронах млекопитающих и Caenorhabditis elegans . Нац. Commun. 5: 4894. DOI: 10.1038 / ncomms5894

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гасеми П., Сахраи Т. и Мохаммади А. (2018). Замкнутая и разомкнутая глубокая стимуляция мозга: методы, проблемы, текущие и будущие аспекты. J. Biomed. Phys. Англ. 8, 209–216. DOI: 10.31661 / jbpe.v8i2.898

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гош, К. К., Бернс, Л. Д., Кокер, Э. Д., Ниммерьян, А., Зив Ю., Гамаль А. Э. и др. (2011). Миниатюрная интеграция флуоресцентного микроскопа. Нац. Методы 8, 871–878. DOI: 10.1038 / nmeth.1694

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гиссибл, Т., Тиле, С., Херкоммер, А., и Гиссен, Х. (2016). Двухфотонная прямая лазерная запись сверхкомпактных многолинзовых объективов. Нац. Фотоника 10, 554–560. DOI: 10.1038 / nphoton.2016.121

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Глас, А., Хюбенер, М., Бонхёффер, Т., и Гольтштейн, П. М. (2018). Сравнение миниатюрной микроскопии с двухфотонной визуализацией кальция с использованием настройки ориентации отдельных клеток в зрительной коре головного мозга мышей. bioRxiv [Препринт] 494641. doi: 10.1101 / 494641

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гебель, В., Керр, Дж. Н. Д., Ниммерьян, А., и Хельмхен, Ф. (2004). Миниатюрный двухфотонный микроскоп на основе гибкого когерентного пучка волокон и линзового объектива с градиентным показателем преломления. Опт. Lett. 29, 2521–2523. DOI: 10.1364 / ol.29.002521

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гомес-Марин, А., Патон, Дж. Дж., Кампфф, А. Р., Коста, Р. М., и Майнен, З. Ф. (2014). Большие поведенческие данные: психология, этология и основы нейробиологии. Нац. Neurosci. 17, 1455–1462. DOI: 10.1038 / nn.3812

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Graeff, F.G., Netto, C.F., and Zangrossi, H.Младший (1998). Поднятый Т-образный лабиринт как экспериментальная модель тревожности. Neurosci. Biobehav. Ред. 23, 237–246. DOI: 10.1016 / s0149-7634 (98) 00024-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гринберг, Д. С., Керр, Дж. Н. Д. (2009). Автоматическая коррекция артефактов быстрого движения для двухфотонной визуализации бодрствующих животных. J. Neurosci. Методы 176, 1–15. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2008.08.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Helmchen, F., Фи, М.С., Танк, Д.В., и Денк, В. (2001). Миниатюрный налобный двухфотонный микроскоп, позволяющий получать изображения мозга свободно движущихся животных с высоким разрешением. Neuron 31, 903–912. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (01) 00421-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джейкоб, А. Д., Рамсаран, А. И., Мокл, А. Дж., Тран, Л. М., Ян, К., Франкленд, П. В. и др. (2018a). Двухцветная система для визуализации кальциевых популяций инграмм in vivo. Программа № 511.05.Планировщик встреч по неврологии на 2018 год. Сан-Диего, Калифорния: Общество неврологии.

Джейкоб, А. Д., Рамсаран, А. И., Мокл, А. Дж., Тран, Л. М., Ян, К., Франкленд, П. В. и др. (2018b). Компактный налобный эндоскоп для визуализации in vivo и кальция у свободно ведущих мышей. Curr. Protoc. Neurosci. 84: e51. DOI: 10.1002 / cpns.51

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дженнингс, Дж. Х., Ким, К. К., Маршел, Дж. Х., Раффи, М., Ye, L., Quirin, S., et al. (2019). Взаимодействующие нейронные ансамбли в орбитофронтальной коре головного мозга для социального и пищевого поведения. Природа 565, 645–649. DOI: 10.1038 / s41586-018-0866-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хименес, Дж. К., Су, К., Голдберг, А. Р., Луна, В. М., Биан, Дж. С., Ордек, Г. и др. (2018). Тревожные клетки в цепи гиппокампа-гипоталамуса. Neuron 97, 670.e6–683.e6. DOI: 10.1016 / j.neuron.2018.01.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джуно, Дж., Дюре, Дж., Робинсон, Дж., И Кемере, К. (2018). «Усовершенствованный модуль датчика изображения для налобных микроскопов», в материалах Proceedings of the 40th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC) (IEEE: Honolulu, HI), 826–829.

Google Scholar

Клаус А., Мартинс Г. Дж., Пайшао В. Б., Чжоу П., Панински Л. и Коста Р. М. (2017). Пространственно-временная организация полосатого тела кодирует пространство действия. Нейрон 95, 1171.e7–1180.e7. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.08.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С. А., Холли, К. С., Возиянов, В., Виллаба, С. Л., Тонг, Р., Григсби, Х. Э. и др. (2016). Микролинза с градиентным индексом, имплантированная в префронтальную кору головного мозга мыши, не влияет на выполнение поведенческих тестов с течением времени. PLoS ONE 11: e0146533. DOI: 10.1371 / journal.pone.0146533

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леман, Д. П., Чен, И.A., Yen, W. W., Markowitz, J. E., Perkins, L. N., Liberti, W. A., et al. (2018). Расширенный набор инструментов с открытым исходным кодом для широкоугольной визуализации кальция у свободно ведущих животных. Программа № 338.20. Планировщик встреч по неврологии на 2018 год. Сан-Диего, Калифорния: Общество неврологии.

Liang, B., Zhang, L., Barbera, G., Fang, W., Zhang, J., Chen, X., et al. (2018). Отчетливые и динамические нейронные ансамбли включения и выключения в социальном исследовании кода префронтальной коры. Нейрон 100, 700.e9–714.e9. DOI: 10.1016 / j.neuron.2018.08.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Liberti, W. A. ​​III., Markowitz, J. E., Perkins, L. N., Liberti, D. C., Leman, D. P., Guitchounts, G., et al. (2016). Нестабильные нейроны лежат в основе стабильного усвоенного поведения. Нац. Neurosci. 19, 1665–1671. DOI: 10.1038 / nn.4405

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Либерти, В. А., Перкинс, Л. Н., Леман, Д. П., и Гарднер, Т.Дж. (2017). Миниатюрная микроскопическая система с открытым исходным кодом и возможностью беспроводного подключения. J. Neural Eng. 14: 045001. DOI: 10.1088 / 1741-2552 / aa6806

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лопес, Г., Бонакки, Н., Фразао, Дж., Нето, Дж. П., Аталлах, Б. В., Соареш, С. и др. (2015). Бонсай: событийный фреймворк для обработки и управления потоками данных. Фронт. Нейроинформ. 9: 7. DOI: 10.3389 / fninf.2015.00007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу, Дж., Ли, К., Сингх-Альварадо, Дж., Чжоу, З. К., Фрёлих, Ф., Муни, Р. и др. (2018). MIN1PIPE: конвейер извлечения сигнала изображения кальция с помощью минископа на основе 1-фотона. Cell Rep. 23, 3673–3684. DOI: 10.1016 / j.celrep.2018.05.062

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марковиц, Дж. Э., Либерти, В. А. III., Гитчаунтс, Г., Велью, Т., Лоис, К., и Гарднер, Т. Дж. (2015). Мезоскопические паттерны нейронной активности поддерживают корковые последовательности певчих птиц. PLoS Biol. 13: e1002158. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1002158

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маршалл, Дж. Д., Ли, Дж. З., Чжан, Ю., Гонг, Ю., Сен-Пьер, Ф., Лин, М. З. и др. (2016). Оптическая запись динамики мембранного напряжения у свободно движущихся мышей с учетом конкретных типов клеток. Ячейка 167, 1650.e15–1662.e15. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.11.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марвин, Дж.S., Scholl, B., Wilson, D. E., Podgorski, K., Kazemipour, A., Müller, J. A., et al. (2018). Стабильность, сродство и хроматические варианты сенсора глутамата iGluSnFR. Нац. Методы 15, 936–939. DOI: 10.1038 / s41592-018-0171-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Матис А., Мамиданна П., Кьюри К. М., Эйб Т., Мурти В. Н., Матис М. В. и др. (2018). DeepLabCut: безмаркерная оценка позы определенных пользователем частей тела с глубоким обучением. Нац. Neurosci. 21, 1281–1289. DOI: 10.1038 / s41593-018-0209-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мацумото, Дж., Уракава, С., Такамура, Ю., Малчер-Лопес, Р., Хори, Э., Томаз, К., и др. (2013). Компьютерный анализ социальных и сексуальных взаимодействий у крыс на основе 3D-видео. PLoS One 8: e78460. DOI: 10.1371 / journal.pone.0078460

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мимика, Б., Данн, Б.А., Томбаз, Т., Боджа, В. П. Т. Н. С., и Уитлок, Дж. Р. (2018). Эффективное кортикальное кодирование трехмерной позы у свободно ведущих крыс. Наука 362, 584–589. DOI: 10.1126 / science.aau2013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Митани, А., Комияма, Т. (2018). Обработка данных двухфотонного изображения кальция в реальном времени, включая коррекцию артефактов бокового движения. Фронт. Нейроинформ. 12:98. DOI: 10.3389 / fninf.2018.00098

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Монтгомери, К.L., Yeh, A. J., Ho, J. S., Tsao, V., Mohan Iyer, S., Grosenick, L., et al. (2015). Полностью внутренняя оптогенетика с беспроводным питанием для мозга, спинного мозга и периферических контуров у мышей. Нац. Методы 12, 969–974. DOI: 10.1038 / nmeth.3536

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мукамель, Э.А., Ниммерьян, А., и Шнитцер, М. Дж. (2009). Автоматический анализ клеточных сигналов на основе крупномасштабных данных визуализации кальция. Нейрон 63, 747–760.DOI: 10.1016 / j.neuron.2009.08.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Надлер, Дж. Дж., Мой, С. С., Долд, Г., Транг, Д., Симмонс, Н., Перес, А. и др. (2004). Автоматизированный аппарат для количественной оценки поведения мышей при социальном подходе. Genes Brain Behav. 3, 303–314. DOI: 10.1111 / j.1601-183x.2004.00071.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Накамура, Т., Мацумото, Дж., Нисимару, Х., Бретас, Р.В., Такамура Ю., Хори Э. и др. (2016). Безмаркерная 3D компьютеризированная система захвата движения, включающая модель скелета обезьяны. PLoS One 11: e0166154. DOI: 10.1371 / journal.pone.0166154

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нёбауэр, Т., Скочек, О., Перния-Андраде, А. Дж., Вайльгуни, Л., Трауб, Ф. М., Молодцов, М. И. и др. (2017). Объемное изображение Ca2 + на видеоизображении коры головного мозга с использованием микроскопии с итеративным демиксированием (SID) с посевом. Нац.Методы 14, 811–818. DOI: 10.1038 / nmeth.4341

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Обенхаус, Х.А., Роуз, Т., Зонг, В., Цао, А., Донато, Ф., Хёйдал, А. и др. (2018). Миниатюрная двухфотонная микроскопия позволяет изучить топографию функциональной сети в медиальной энторинальной коре головного мозга. Программа № 689.06. Планировщик встреч по неврологии 2018 (Сан-Диего, Калифорния: Общество неврологии), доступно в Интернете по адресу: https://www.abstractsonline.com/pp8/#!/4649/presentation/9606

Окуяма, Т., Китамура, Т., Рой, Д.С., Итохара, С., и Тонегава, С. (2016). Вентральные нейроны CA1 хранят социальную память. Наука 353, 1536–1541. DOI: 10.1126 / science.aaf7003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Озбай, Б. Н., Футия, Г. Л., Ма, М., Брайт, В. М., Гопинат, Дж. Т., Хьюз, Э. Г. и др. (2018). Трехмерное двухфотонное изображение мозга свободно движущихся мышей с использованием миниатюрного оптоволоконного микроскопа с активным осевым сканированием. Sci.Отчет 8: 8108. DOI: 10.1038 / s41598-018-26326-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пакер А. М., Рассел Л. Э., Далглиш Х. У. П. и Хойссер М. (2014). Одновременная полностью оптическая манипуляция и регистрация активности нейронных цепей с клеточным разрешением in vivo . Нац. Методы 12, 140–146. DOI: 10.1038 / nmeth.3217

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, С. И., Бреннер, Д.С., Шин, Г., Морган, К. Д., Копиц, Б. А., Чанг, Х. У. и др. (2015). Мягкие, эластичные, полностью имплантируемые миниатюрные оптоэлектронные системы для беспроводной оптогенетики. Нац. Biotechnol. 33, 1280–1286. DOI: 10.1038 / NBT.3415

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паске, М. О., Тихи, М., Гуржон, А., Помпили, М. Н., Годсил, Б. П., Лена, К. и др. (2016). Беспроводное инерционное измерение кинематики головы свободно движущихся крыс. Sci.Отчет 6: 35689. DOI: 10.1038 / srep35689

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Patriarchi, T., Cho, J. R., Merten, K., Howe, M. W., Marley, A., Xiong, W.-H., et al. (2018). Сверхбыстрая нейронная визуализация динамики дофамина с помощью разработанных генетически закодированных сенсоров. Наука 360: eaat4422. DOI: 10.1126 / science.aat4422

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перейра, Т. Д., Алдарондо, Д. Э., Уиллмор, Л., Кислин, М., Ван, С.-Х., Мурти, М. и др. (2019). Быстрая оценка позы животных с использованием глубоких нейронных сетей. Нац. Методы 16, 117–125. DOI: 10.1038 / s41592-018-0234-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пяткевич, К. Д., Юнг, Э. Э., Штрауб, К., Линху, К., Парк, Д., Сук, Х.-Дж., и др. (2018). Роботизированный многомерный подход направленной эволюции применяется к флуоресцентным репортерам напряжения. Нац. Chem. Биол. 14, 352–360. DOI: 10.1038 / s41589-018-0004-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Piyawattanametha, W., Барретто, Р. П. Дж., Ко, Т. Х., Флусберг, Б. А., Кокер, Э. Д., Ра, Х. и др. (2006). Двухфотонная флуоресцентная визуализация с быстрым сканированием на основе двумерного сканирующего зеркала микроэлектромеханических систем. Опт. Lett. 31, 2018–2020. DOI: 10.1364 / ol.31.002018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пневматикакис, Э.А., и Джованнуччи, А. (2017). NoRMCorre: онлайн-алгоритм для кусочно-жесткой коррекции движения данных визуализации кальция. J. Neurosci. Методы 291, 83–94. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2017.07.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Prevedel, R., Verhoef, A.J., Pernía-Andrade, A.J., Weisenburger, S., Huang, B.S., Nöbauer, T., et al. (2016). Быстрая объемная визуализация кальция на нескольких корковых слоях с использованием скульптурного света. Нац. Методы 13, 1021–1028. DOI: 10.1038 / Nmeth.4040

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Прса, М., Галиньянес, Г. Л., и Хубер, Д. (2017). Быстрая интеграция искусственной сенсорной обратной связи во время оперантного кондиционирования нейронов моторной коры. Neuron 93, 929.e6–939.e6. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.01.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Quicke, P., Song, C., McKimm, E. J., Milosevic, M. M., Howe, C. L., Neil, M., et al. (2019). Однофотонная визуализация напряжения на уровне одного нейрона с редко нацеленными генетически закодированными индикаторами напряжения. Фронт. Клетка. Neurosci. 13:39. DOI: 10.3389 / fncel.2019.00039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Савински, Дж., Уоллес, Д. Дж., Гринберг, Д. С., Гроссманн, С., Денк, В., и Керр, Дж. Н. Д. (2009). Визуально вызванная активность корковых клеток у свободно движущихся животных. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 106, 19557–19562. DOI: 10.1073 / pnas.00106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмид, М., Тиле, С., Херкоммер, А., Гиссен, Х. (2018). Трехмерные ахроматические аксиконы и многокомпонентные микролинзы с прямой лазерной записью. Опт. Lett. 43, 5837–5840. DOI: 10.1364 / ol.43.005837

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Скотт, Б. Б., Тиберж, С. Ю., Го, К., Терво, Д. Г. Р., Броуди, К. Д., Карпова, А. Ю., и др. (2018). Визуализация корковой динамики у трансгенных крыс GCaMP с помощью широкоугольного макроскопа, установленного на голове. Нейрон 100, 1045.e5–1058.e5. DOI: 10.1016 / j.neuron.2018.09.050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Senarathna, J., Yu, H., Deng, C., Zou, A. L., Issa, J. B., Hadjiabadi, D. H., et al. (2019). Миниатюрный мульти-контрастный микроскоп для функциональной визуализации свободно ведущих животных. Нац. Commun. 10:99. DOI: 10.1038 / s41467-018-07926-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шин, Г., Гомес, А. М., Аль-Хасани, Р., Чон, Ю.R., Kim, J., Xie, Z., et al. (2017). Гибкая беспроводная оптоэлектроника ближнего поля в качестве подкожных имплантатов для широкого применения в оптогенетике. Neuron 93, 509.e3–521.e3. DOI: 10.1016 / j.neuron.2016.12.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шуман, Т., Ахарони, Д., Кай, Д. Дж., Ли, К. Р., Чавлис, С., Таксидис, Дж., И др. (2018). Нарушение пространственного кодирования и нейронной синхронизации при эпилепсии. bioRxiv [Препринт]. 358580.DOI: 10.1101 / 358580

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зигл, Дж. Х., Лопес, А. К., Патель, Ю. А., Абрамов, К., Охайон, С., и Фойгтс, Дж. (2017). Open Ephys: платформа с открытым исходным кодом на основе плагинов для многоканальной электрофизиологии. J. Neural Eng. 14: 045003. DOI: 10.1088 / 1741-2552 / aa5eea

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Скочек, О., Нёбауэр, Т., Вейлгуни, Л., Мартинес Трауб, Ф., Ся, К. Н., Молодцов, М.I., et al. (2018). Высокоскоростная волюметрическая визуализация активности нейронов у свободно перемещающихся грызунов. Нац. Методы 15, 429–432. DOI: 10.1038 / s41592-018-0008-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сорокин, Дж. М., Дэвидсон, Т. Дж., Фрешетт, Э., Абрамян, А. М., Дейссерот, К., Хугенар, Дж. Р. и др. (2017). Двунаправленное управление сетями генерализованной эпилепсии посредством быстрого переключения режима возбуждения в реальном времени. Neuron 93, 194–210. DOI: 10.1016 / j.neuron.2016.11.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стаматакис, А. М., Шахтер, М. Дж., Гулати, С., Зителли, К. Т., Малановски, С., Таджик, А., и др. (2018). Одновременная оптогенетика и визуализация кальция в клеточном разрешении во время активного поведения с использованием миниатюрного микроскопа. Фронт. Neurosci. 12: 496. DOI: 10.3389 / fnins.2018.00496

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиле, С., Гиссибл, Т., Гиссен, Х., Херкоммер, А.М. (2016). Сверхкомпактная светодиодная коллимационная оптика на кристалле с фемтосекундной 3D прямой лазерной записью. Опт. Lett. 41, 3029–3032. DOI: 10.1364 / ol.41.003029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Венкатраман, С., Джин, X., Коста, Р. М., и Кармена, Дж. М. (2010). Изучение нейронных коррелятов поведения свободно ведущих грызунов с помощью инерциальных датчиков. J. Neurophysiol. 104, 569–575. DOI: 10.1152 / ян.00121.2010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уилсон, Дж. Дж., Александр, Н., Трентин, К., и Триподи, М. (2018). Трехмерное представление моторного пространства в верхнем холке мыши. Curr. Биол. 28, 1744.e12–1755.e12. DOI: 10.1016 / j.cub.2018.04.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вильчко, А. Б., Джонсон, М. Дж., Юрилли, Г., Петерсон, Р. Э., Катон, Дж. М., Пашковски, С.L., et al. (2015). Отображение субсекундной структуры в поведении мыши. Neuron 88, 1121–1135. DOI: 10.1016 / j.neuron.2015.11.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yin, X., Steinle, T., Huang, L., Taubner, T., Wuttig, M., Zentgraf, T., et al. (2017). Переключение луча и бифокальное зум-линзирование с использованием активных плазмонных метаповерхностей. Light Sci. Прил. 6: e17016. DOI: 10.1038 / lsa.2017.16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, Л., Лян Б., Барбера Г., Хоуз С., Чжан Ю., Пень К. и др. (2018). Система линз Miniscope GRIN для кальциевой визуализации нейрональной активности в глубоких структурах мозга у ведущих поведение животных. Curr. Protoc. Neurosci. 86: e56. DOI: 10.1002 / cpns.56

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhou, P., Resendez, S. L., Rodriguez-Romaguera, J., Jimenez, J. C., Neufeld, S. Q., Giovannucci, A., et al. (2018). Эффективное и точное извлечение сигналов кальция in vivo из микроэндоскопических видеоданных. Элиф 7: e28728. DOI: 10.7554 / elife.28728

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zong, W., Wu, R., Li, M., Hu, Y., Li, Y., Li, J., et al. (2017). Быстрая миниатюрная двухфотонная микроскопия с высоким разрешением для визуализации головного мозга мышей с свободным поведением. Нац. Методы 14, 713–719. DOI: 10.1038 / nmeth.4305

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Минископ V4 — LabMaker

V4 — это шаг вперед в технологии минископов.Он будет служить платформой для нового поколения минископов на долгие годы. Это высококлассное решение поможет продвигать и распространять миниатюрную микроскопию среди быстро растущего сообщества нейробиологов с открытым исходным кодом.

Miniscope V4 использует широкополосную флуоресцентную визуализацию для регистрации нервной активности у бодрствующих, свободно движущихся мышей. Минископы V4 от LabMaker поставляются полностью собранными, протестированными и готовыми к использованию. Он совместим с системой сбора данных (DAQ) с прошивкой V4.

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
  • Поле зрения диаметром> 1 мм
  • ~ 1 мм рабочее расстояние
  • с электронной регулировкой фокуса +/- 200 мкм с электросмачивающей линзой; больше нет механического скольжения для фокусировки
  • вся ахроматическая оптика высокого разрешения (без внутренней линзы GRIN)
  • 2.6 г, высота 22 мм
  • Датчик абсолютного положения головы
  • требует ~ 1/5 мощности возбуждения предыдущих систем
  • по-прежнему использует только один коаксиальный кабель (диаметром до 0,3 мм) для питания, связи и данных.

СОДЕРЖАНИЕ
  • Полностью собранный и протестированный Miniscope V4
  • Конфигурация объектива 1
  • Corning (Varioptics) Электросмачивающая линза 2,5 мм с прозрачной апертурой
  • алюминиевая втулка объектива для простой и многократной установки (для варианта 2 с опорной пластиной)
  • 2 отдельные опорные плиты вариант 2 с винтами
  • Коаксиальный кабель 300 см, диаметр 1 мм, Hirose U.Разъем FL

ВЫПОЛНЕНИЕ

Текущее время выполнения новых заказов на Miniscope V4 составляет 6-8 недель с даты заказа.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИНИСКОПА

становится простым, если следовать подробным пошаговым инструкциям UCLA. (требуется предварительная регистрация на miniscope.org)

Экспериментальная хронология (Дениз Кай)

ПУБЛИКАЦИЯ

Чжэ Донг, Уильям Мау, Ю (Сьюзи) Фэн, Закари Т.Пеннингтон, Линсюан Чен, Йосиф Заки, Канака Раджан, Тристан Шуман, Даниэль Ахарони, Дениз Дж. Кай (2021). Minian: конвейер анализа мини-микроскопа с открытым исходным кодом. BioRxiv.

Документация Исходный код Форум

Минископ — Полный комплект

Минископ использует широкополосную флуоресцентную визуализацию для регистрации нейронной активности у бодрствующих, свободно движущихся мышей. Он имеет массу 3 грамма и использует один гибкий коаксиальный кабель для питания, сигналов управления и данных изображений.Используя эту систему, можно визуализировать CA1 гиппокампа, субикулум, зрительную кору и другие области с помощью линзы GRIN.

В комплект полнофункционального устройства Miniscope V3.2 входят:
  • Печатная плата датчика изображения CMOS, припаянная к плате светодиода возбуждения и коаксиальному кабелю
  • Удлинитель коаксиального кабеля (1 м)
  • Корпус, содержащий дихроичное зеркало, фильтр излучения, фильтр возбуждения и ахроматическую линзу (эффективное фокусное расстояние 12.50 мм)
  • Полушаровая линза
  • Ползунок фокусировки с одним установочным винтом
  • Винты для нарезания резьбы из нержавеющей стали для тонкого пластика (6 шт.)
  • Отвертка TORX T1
  • Шестигранный ключ — 0,70 мм
  • Опорная плита с установочным винтом
  • Линза GRIN от Grintech, 1,8 / 4,2 мм, NA0,5, шаг 0,25, профиль показателя преломления 4-го порядка, рабочее расстояние 0, биосовместимое стекло
  • Металлическая втулка для тонкой линзы GRIN (релейная линза формирования изображения)
  • Сборка не требует пайки

ПРИМЕЧАНИЕ. С этого момента в комплект компонентов Miniscope входят обновленный коаксиальный кабель и удлинитель.Диаметр нового кабеля был уменьшен до 1,13 мм вместо прежней версии на 2,80 мм. Это обеспечивает большую гибкость в движении и снижает нагрузку на проволоку.

Для визуализации с помощью Miniscope вам понадобится контроллер сбора данных, подключенный через USB 3.0 к компьютеру с установленным программным обеспечением для сбора данных UCLA.

С помощью минископа

становится простым, если следовать подробным пошаговым инструкциям UCLA.(требуется предварительная регистрация на miniscope.org)

Экспериментальная хронология (Дениз Кай)

Исходный код документации

NINscope, универсальный минископ для исследования многозональных схем

Сводка приемки:

Рецензенты и редакторы высоко оценили универсальность и практичность общедоступной системы NINscope. По сравнению с другими системами, NINscope обладает преимуществами в весе и размере, которые позволяют подключаться к акселерометрам, оптогенетической стимуляции и возможности получения изображений в двух точках.Вместе они открывают более широкие возможности, чем существующие в других системах. Поскольку она сделана в открытом доступе, мы ожидаем, что эта система будет особенно полезным дополнением для лабораторий, которые не имеют возможности самостоятельно разрабатывать эти дополнительные функции путем модификации существующих систем.

Письмо-решение после экспертной оценки:

Благодарим вас за отправку вашей статьи «NINscope: универсальный минископ для исследования схем в нескольких регионах» на рассмотрение eLife .Ваша статья была рецензирована тремя рецензентами, а оценку контролировали рецензирующий редактор и Кейт Вассум в качестве старшего редактора. Следующее лицо, участвовавшее в рассмотрении вашей заявки, согласилось раскрыть свою личность: Дениз Дж. Кай (рецензент №1).

Рецензенты обсудили рецензии друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленную заявку.

Резюме:

Ваш документ вызвал довольно много дискуссий на этапе консультаций.С одной стороны, рецензенты считали, что отдельные технические достижения здесь были относительно небольшими. С другой стороны, было достигнуто согласие о том, что в принципе небольшие преимущества в весе и размере, хотя и возрастающие по отдельности, в сочетании с акселерометрами, оптогенетической стимуляцией и возможностью получения изображений на двух участках, вместе могут открыть более широкие возможности, чем те, которые существуют с другими системами. . Основным преимуществом NINscope считалось, что он потенциально связан с универсальностью и практическим удобством использования, а не с техническими характеристиками как таковыми, и выделение КАК комбинировать визуализацию с этой меньшей занимаемой площадью с другими приложениями (опто, двойная визуализация) является хорошим вкладом.Если бы эта система стала общедоступной, она могла бы стать полезным дополнением для лабораторий, у которых нет возможности самостоятельно разрабатывать эти дополнительные функции путем модификации существующих систем.

В статье «Инструменты и ресурсы» нет требования сообщать о важных новых биологических открытиях или механизмах, но должно быть ясно, что они позволят добиться таких достижений. Поскольку цель здесь не состоит в том, чтобы ответить на биологические вопросы, необходимо пояснить, что эксперименты являются доказательством принципа (т.е. объем и сопутствующие технологические работы) демонстрационные эксперименты И данные должны быть высокого качества.

Были подняты ключевые вопросы, которые необходимо решить, чтобы убедительно продемонстрировать эти моменты, кратко изложенные здесь:

1) Что наиболее важно, существуют опасения по поводу качества данных визуализации, представленных в дополнительных видеороликах, включая очевидный артефакт движения по оси z, деконволюцию сигналов GCaMP и сегментацию дендритов клеток Пуркинье (затронутая по-разному всеми тремя рецензенты, но особенно рецензент 3).Видео также подвергаются тщательной обработке: красные вспышки указывают на активность, скрывая сегментацию и извлечение сигналов. Чтобы меньшая занимаемая площадь NINscope не принесла в жертву стабильности и качеству изображения, мы просим вас:

— Обеспечивает управление YFP ​​(или другим статическим флуорофором) для артефактов движения. Это особенно (но не только) актуально для случаев повышенной активности в регионах, которая коррелирует с ускорением головы.

— Предоставляет больше необработанных данных и информации о сегментации.В видеороликах, пожалуйста, предоставьте те же данные визуализации кальция в необработанном виде, после коррекции движения, а затем снова после сегментации. Это можно сделать, показав одно и то же видео для этих трех шагов.

2) Высказывались опасения, что слишком много делается с точки зрения биологических открытий, полученных в результате разрозненных экспериментов по доказательству принципа, которые показаны. Эти исследования были сочтены недостаточными, лишенными экспериментальных подробностей и контрольных экспериментов, чтобы сделать убедительные биологические выводы.Более того, подробный ответ на все эти биологические вопросы выходит за рамки инструментов и справочной статьи. Пожалуйста, сосредоточьтесь на аспектах инструментов и методов (и объясните это) и смягчите выводы на основе результатов скоординированной нейронной активности в различных областях мозга.

3) Чтобы подтвердить полезность установки 2-х оптических прицелов, укажите

для поведения животных.

— более показательные изображения конфигурации с двойным креплением (как предложил рецензент 1)

— количественная оценка поведения с установленными прицелами 0,1,2 (предложено рецензентом 2).

4) Чтобы обеспечить прямую оценку характеристик NINscope по сравнению с другими существующими опциями (минископ UCLA, Inscopix), пожалуйста, включите сравнительную таблицу, как предложено рецензентом 2.

5) Пожалуйста, предоставьте подтверждение истинного разделения места стимуляции и регистрации для оптогенетики (рецензент 3, пункт 2).

Поэтому мы приглашаем вас представить отредактированную рукопись, которая полностью решает эти проблемы, а также полный набор комментариев рецензентов ниже.

Рецензент № 1:

Groot et al. сообщают о конструкции и применении нового мини-микроскопа — NINscope, основным преимуществом которого по сравнению с существующими технологиями мини-микроскопов является его небольшой и легкий характер, который позволяет имплантировать два из них для одновременной визуализации в двух областях мозга мышей. Кроме того, NINscope может интегрироваться с оптогенетикой для одновременной визуализации и оптогенетических манипуляций с цепями мозга. Авторы демонстрируют, что NINscope способен получать видео с высоким разрешением, чья базовая нейронная активность может быть деконволюционирована с использованием обычных методов обработки данных (т.е. CNMF). Затем они обнаруживают синхронные паттерны активности (SP) в коре и мозжечке во время начала движения, используя NINscope для записи в двух областях и встроенный акселерометр для измерения поведенческого движения. Чтобы продемонстрировать, что NINscope поддается интеграции с оптогенетикой, авторы затем визуализируют активность коркового кальция при одновременной стимуляции клеток Пуркинье 4 подобластей мозжечка и показывают, что стимуляция каждой подобласти увеличивает активность коркового кальция. Более того, оценка поведенческого ускорения предполагает, что стимуляция одного полушария крестца II приводит к движению головы в противоположном направлении.Чтобы продемонстрировать способность NINscope получать изображения из глубоких структур мозга, авторы имплантировали линзу GRIN в дорсальное полосатое тело с помощью системы ретрансляционных линз и регистрировали кальциевую активность нейронов полосатого тела, когда мыши исследовали открытое поле. Используя эту систему, авторы наблюдают отдельные нейроны, настроенные на повороты в направлении, противоположном зарегистрированному полушарию. Наконец, авторы используют глубокую визуализацию мозга и оптогенетику, чтобы продемонстрировать, что оптогенетическая стимуляция OFC и M2 по-разному влияет на активность нейронов полосатого тела.В целом, NINscope служит ценным и гибким инструментом, позволяющим исследовать динамику популяции нейронов в различных областях мозга. Из-за своего небольшого размера он позволяет гибко использовать, например, комбинировать его с дополнительным NINscope или оптогенетикой. Этот инструмент, несомненно, принесет широкую пользу сообществу нейробиологов, однако некоторые дополнительные детали методологии и разъяснения некоторых областей (упомянутых ниже) значительно улучшат эту рукопись. И хотя похвально то, что авторы показывают несколько примеров того, как NINscope можно использовать экспериментально, неясно, что является биологическим открытием в этих различных экспериментах, которые, похоже, решают разрозненные исследовательские вопросы.Авторы могут захотеть более четко изложить, какие гипотезы основаны на предыдущих исследованиях и какие результаты согласуются с предыдущими исследованиями, а какие являются новыми или оспаривают предыдущие взгляды. Я понимаю, что это может слишком расширить рамки данной статьи, и я хотел бы предложить авторам рассмотреть возможность сосредоточения своих экспериментальных вопросов.

Рецензент № 2:

de Groot et al. представить новый миниатюрный флуоресцентный микроскоп с открытым исходным кодом. По сравнению с наиболее широко используемыми миниатюрными флуоресцентными микроскопами, новый прицел (получивший название NINscope) имеет несколько дополнительных функций / свойств, которые сделают его привлекательным для некоторых групп.В частности, NINscope занимает меньше места, легче и содержит встроенные акселерометры и драйверы светодиодов для управления внешними светодиодами. Эти функции хорошо интегрированы в дизайн, и их полезность продемонстрирована в рукописи. Чтобы продемонстрировать функциональность этого нового микроскопа и связанного с ним аппаратного и программного обеспечения, авторы подтвердили многочисленные предыдущие выводы из литературы по движению. А именно, авторы используют NINscope для успешного отслеживания активности дендритов клеток Пуркинье и нейронов спинного стриатума во время движения, для изучения функциональной связи между мозжечком и корой и для подтверждения результатов, что орбитофронтальная и моторная кора головного мозга обеспечивают контроль дорсального стриатума сверху вниз.На мой взгляд, основным продуктом этой статьи является сам микроскоп, и для демонстрации его функции и полезности требуется совсем немногое. Некоторые модификации, однако, улучшат распространение соответствующей информации о NINscope. Возможно, нейробиологические эксперименты недостаточно мощны, но не настолько, чтобы подорвать сам микроскоп. Например, известные ограничения обнаружения уменьшения сигнала от GCaMP могут внести некоторую погрешность в рисунок 6, но эта возможность не умаляет технических достижений, сделанных здесь.

Одним из дополнений, которое могло бы усилить эту рукопись, является более подробное сравнение между NINscope и другими миниатюрными микроскопами с открытым исходным кодом (возможно, и коммерческими, если применимо). Это может быть текст или рисунок, но исчерпывающая таблица может быть наиболее кратким способом передачи информации, которая будет информировать будущих пользователей. Я понимаю, что у последнего автора есть обзор по этой теме, но этот обзор не охватывает сам NINscope или много деталей о беспроводном прицеле от Shuman et al.(bioRxiv, 2018). Прямое сравнение веса, размера следа, схем управления, механизма фокусировки, программного обеспечения, вспомогательного оборудования и возможностей стимуляции — это лишь некоторые из переменных / ограничений, которые могут повлиять на пользователя от одного прицела к другому.

Другое главное сравнение, которое укрепит утверждения, сделанные в отношении самого оборудования (которое должно быть легко собрано или на основе существующих данных), — это количественное сравнение локомоторного поведения с нулевым, одним и двумя NIN-прицелами, установленными на голове.Авторы предполагают, что нормальное поведение наблюдается и относятся к исследованию клетки, уходу за шерстью, поеданию и выращиванию, но на самом деле это не демонстрируется. Эпоха выращивания определяется по видео и данным IMU в 2G, предположительно количество тылов может быть собрано из одно- и двухкратных установок и сравнено.

Было бы полезно включить дополнительную информацию о светодиодах для оптической стимуляции. Это кажется очень простым применением стандартных светодиодов, и другим может быть полезно использовать их с NINscope или без него.Дополнительные фотографии и / или схемы могут помочь.

Мощность света для визуализации не указана на рис. 6. Было ли оно таким же, как на рис. 5? Пожалуйста, включите эту информацию из-за возможности активации синего хвоста ChrimsonR.

Рецензент № 3:

В этой рукописи де Гроота и др. Авторы разрабатывают и описывают миниатюрный эпифлуоресцентный микроскоп, который будет использоваться на свободно ведущих грызунах для визуализации кальция. Микроскоп похож на ранее опубликованные минископы (минископ UCLA, Inscopix nVista и Finchscope) с некоторыми небольшими отличиями.А именно, он немного легче, чем прицел Inscopix, и содержит акселерометр / светодиод для позиционного отслеживания. Он также имеет дополнительный светодиод, который можно использовать для фотостимуляции. В то время как другие системы не предлагают этого, похоже, что при необходимости это можно было бы легко реализовать с другими системами.

Особые комментарии:

1) Одним из основных моментов, сделанных в рукописи, является то, что эта система позволяет осуществлять запись на нескольких сайтах. Хотя это демонстрируется в мозжечке и лобной коре, маловероятно, что это может быть достигнуто во многих других регионах.Фронтальная кора и мозжечок довольно далеко друг от друга (в данном примере это возможно), но это будет сильно ограничено другими участками дуэли.

2) Оптогенетическая стимуляция в сочетании с визуализацией представляет интерес, и о ней ранее сообщалось с использованием системы Inscopix nVoke (где стимуляция и запись происходят в одном поле зрения). Преимущество этой статьи состоит в том, что стимуляция может быть отделена от места записи. Хотя это интересно, похоже, что не проводились контрольные эксперименты, в которых мыши не экспрессировали ChR2.Таким образом, возможно, что нервная активность, вызванная стимуляцией, может быть связана с каким-то артефактом, индуцированным нагревом или светом.

3) У меня есть некоторые опасения по поводу качества данных, представленных в дополнительных видео. Многие из них демонстрируют некорректируемый артефакт z-движения, а записи дендритов мозжечка, кажется, показывают много расфокусированной флуоресценции, что затрудняет извлечение сигналов из отдельных дендритов. Авторы использовали недавно опубликованный алгоритм CMNF-E для извлечения сигналов, который извлекает что-то из данных, но неясно, действительно ли извлеченные сигналы представляют собой настоящие одиночные дендриты.

https://doi.org/10.7554/eLife.49987.sa1

New Miniscope V4.4 — Open Ephys

Miniscope V4.4

Минископ с открытым исходным кодом Miniscope V4.4, используемый для нейронной визуализации свободно ведущих животных .

Эта новейшая версия, V4.4, имеет более стабильный датчик движения, быстрее собирается (требуется меньше клея, что немного снижает общий вес ) и имеет новый регулятор для повышения качества изображения.

  • Поле зрения диаметром> 1 мм и рабочее расстояние ~ 1 мм

  • Электронная регулировка фокуса +/- 200 мкм

  • Вся ахроматическая оптика

  • 2.6 г и высота 22 мм

  • Датчик абсолютной ориентации головки

  • Требуется ~ 1/5 мощности возбуждения предыдущих систем

  • Один коаксиальный кабель (диаметром до 0,3 мм) для питания, связи и данные

Этот комплект содержит
  • Собранный минископ V4.4

  • 2x Опорная плита V4 (вариант 2) для монтажа

  • 1x Собранный коаксиальный кабель,

    (~ 10 футов)

Для завершения экспериментальной установки вам понадобится DAQ Board.V4.4 совместим с предыдущими DAQ Miniscope, если вы обновите прошивку. У нас также есть улучшенный DAQ, доступный здесь.

Если вам нужна только печатная плата в сборе, свяжитесь с нами.

В этой области используются следующие фильтры:
— Фильтр возбуждения ET470 / 40x

— Эмиссионный фильтр ET525 / 50m

— Дихроичное зеркало T496lpxr

Поддержка

Мы считаем, что использование инструментов с открытым исходным кодом не должно требовать компромиссов услуга.Поэтому мы рады начать оказывать поддержку собранному Miniscope V4, чтобы помочь вам устранить неполадки и ответить на ваши вопросы, в тесном сотрудничестве с командой UCLA Miniscope.

Заказ

Если вам нужно официальное предложение и / или вы предпочитаете банковский перевод в качестве способа оплаты, свяжитесь с нами по [email protected]

Уже распродана четвертая партия в 100 единиц. Мы уже производим новую партию из 300 единиц, которая будет отгружена в январе 2022 года.

Несмотря на то, что мы сталкиваемся с глобальной нехваткой микросхем, мы стараемся поддерживать низкие цены и используем только оригинальные компоненты , а не аналогичные замены, что обеспечивает высокое качество, но снижает скорость производства.
На данный момент мы отгрузили 700 минископов. Спасибо за поддержку экосистемы с открытым исходным кодом.

Система линз GRIN с минископом для кальциевой визуализации нейронной активности глубоких структур головного мозга у животных

DOI: 10.1002 / cpns.56. Epub 2018 13 октября.

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Программа очных исследований, Национальный институт злоупотребления наркотиками, Национальные институты здравоохранения, Балтимор, Мэриленд.
  • 2 Трансгенная секция, лаборатория нейрогенетики, Национальный институт старения, Национальные институты здоровья, Бетесда, Мэриленд.
  • 3 Хэфэйская национальная лаборатория физических наук на микромасштабе, Школа наук о жизни, Научно-технический университет Китая, Хэфэй, Китай.
  • 4 Отделение зоологии и физиологии, Колледж искусств и наук Университета Вайоминга, Ларами, Вайоминг.
  • 5 Отделение нейробиологии им. Соломона Х. Снайдера, Медицинский факультет Университета Джонса Хопкинса, Балтимор, Мэриленд.
Бесплатная статья PMC

Элемент в буфере обмена

Lifeng Zhang et al. Curr Protoc Neurosci.2019 Янв.

Бесплатная статья PMC Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

DOI: 10.1002 / cpns.56. Epub 2018 13 октября.

Принадлежности

  • 1 Программа очных исследований, Национальный институт злоупотребления наркотиками, Национальные институты здравоохранения, Балтимор, Мэриленд.
  • 2 Трансгенная секция, лаборатория нейрогенетики, Национальный институт старения, Национальные институты здоровья, Бетесда, Мэриленд.
  • 3 Хэфэйская национальная лаборатория физических наук на микромасштабе, Школа наук о жизни, Научно-технический университет Китая, Хэфэй, Китай.
  • 4 Отделение зоологии и физиологии, Колледж искусств и наук Университета Вайоминга, Ларами, Вайоминг.
  • 5 Отделение нейробиологии им. Соломона Х. Снайдера, Медицинский факультет Университета Джонса Хопкинса, Балтимор, Мэриленд.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Визуализация нейронной активности из глубоких областей мозга у свободно ведущих животных с помощью систем миниатюрных флуоресцентных микроскопов (минископов) становится все более важной для понимания механизмов нейронного кодирования, лежащих в основе когнитивных функций.Здесь мы представляем нашу специально разработанную систему линз GRadient INdex (GRIN) минископа, которая позволяет одновременно записывать данные с сотен нейронов в течение нескольких месяцев. Эта статья включает в себя дизайн минископа, хирургическую процедуру имплантации линзы GRIN, установку минископа на голову мыши, а также сбор и анализ данных. Сначала целевая область мозга метится вирусом, экспрессирующим GCaMP6; во-вторых, линза GRIN имплантируется над целевой областью мозга; в-третьих, после хирургического восстановления мыши на голове мыши над линзой GRIN устанавливают минископ; и, наконец, нервная активность регистрируется у свободно ведущей мыши.Эта система может применяться для продольной регистрации одной и той же популяции нейронов, что позволяет выяснить нейронные механизмы, лежащие в основе поведенческого контроля. © 2018 г., компания John Wiley & Sons, Inc.

Ключевые слова: GCaMP6; Градиент; Линза INdex; кальциевая визуализация; свободно ведущие себя мыши; минископ.

© John Wiley & Sons, Inc., 2018.

Цифры

Рисунок 1

( A ) Изображение основного корпуса и основания miniScope. Слева: 3D…

Рисунок 1

( A ) Изображение основного корпуса и основания miniScope.Слева: 3D-модель встроенного мини-прицела и механизма крепления основания. Справа: отдельные компоненты, состоящие из miniScope, включая датчик CMOS (с разъемом), линзу формирования изображения, фильтры возбуждения / излучения, дихроичное зеркало, коллимационную линзу, светодиод, линзу объектива, основной корпус, куб фильтра, основание и стопорный винт (гайку). . ( B ) Иллюстрация печатной платы датчика CMOS. ( C ) Иллюстрация контроллера сбора данных. ( D ) Иллюстрация конструкции кабеля передачи данных.

Рисунок 2

(A) Роботизированный хирургический инструмент, который…

Рисунок 2

(A) Роботизированный хирургический инструмент, который включает три рычага, соединяющие по отдельности три шаговых двигателя;…

фигура 2

(A) Роботизированный хирургический инструмент, который включает три рычага, соединяющие по отдельности три шаговых двигателя; двигатели управляются тремя контроллерами двигателей на базе USB через программное обеспечение GUI на основе MATLAB (Mathworks).Шприц, удерживающий иглу с тупым концом калибра 30, устанавливается параллельно на дорсально-вентральной стереотаксической руке и соединяется с вакуумным насосом. (B) Левая, очищенная область черепа; Справа линза GRIN закреплена двумя слоями стоматологического цемента. (C) Процедуры изготовления крышки линзы GRIN из нижней части пробирки для ПЦР.

Рисунок 3

(А) Станция установки минископа имеет…

Рисунок 3

(A) Станция установки минископа имеет три моторизованных трансляционных ступени для трехмерной регулировки, комбинированные…

Рисунок 3

(A) Станция установки минископа имеет три моторизованных ступени перемещения для регулировки в трех измерениях в сочетании с непрерывным вращением для точной регулировки угла во всех направлениях. Держатель минископа установлен на гониометре.(B) Слева, детали для сборки основания минископа; Справа, чтобы подготовить нижнюю часть, поместите шестигранную гайку # 00-90 в прорезь основания, затем с помощью небольшого количества суперклея закрепите гайку в прорези

.

Похожие статьи

  • Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для визуализации кальция глубокого мозга in vivo.

    Тапа Р., Лян Б., Лю Р., Ли Ю.Thapa R, et al. J Vis Exp. 2021 8 октября; (176). DOI: 10,3791 / 63049. J Vis Exp. 2021 г. PMID: 34694282

  • Беспроводной мини-микроскоп для глубокого исследования мозга свободно движущихся мышей.

    Барбера Г., Лян Б., Чжан Л., Ли Ю., Линь Д.Т. Barbera G, et al. J Neurosci Methods. 2019 15 июля; 323: 56-60. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2019.05.008. Epub 2019 19 мая. J Neurosci Methods.2019. PMID: 31116963 Бесплатная статья PMC.

  • Компактный головной эндоскоп для визуализации кальция in vivo у свободно ведущих мышей.

    Джейкоб А.Д., Рамсаран А.И., Мокл А.Дж., Тран Л.М., Ян К., Франкланд П.В., Джосселин С.А. Джейкоб А.Д. и др. Curr Protoc Neurosci. 2018 июл; 84 (1): e51. DOI: 10.1002 / cpns.51. Epub 2018 26 июня. Curr Protoc Neurosci. 2018. PMID: 29944206

  • Успешная визуализация кальция in vivo с помощью миниатюрного микроскопа с креплением на голове в миндалевидном теле свободно ведущей мыши.

    Ли Х.С., Хан Дж. Х. Ли HS и др. J Vis Exp. 2020 26 августа; (162). DOI: 10,3791 / 61659. J Vis Exp. 2020. PMID: 32925887

  • Цепные механизмы нейродегенеративных заболеваний: новый рубеж с миниатюрной флуоресцентной микроскопией.

    Вернер CT, Williams CJ, Fermelia MR, Lin DT, Li Y. Вернер CT, et al. Front Neurosci.31 октября 2019 г .; 13: 1174. DOI: 10.3389 / fnins.2019.01174. eCollection 2019. Front Neurosci. 2019. PMID: 31736701 Бесплатная статья PMC. Обзор.

Процитировано

16 статьи
  • Цепное расследование социального взаимодействия и расстройства, связанного с употреблением психоактивных веществ, с использованием мини-микроскопов.

    Бичер, штат Нью-Джерси, Вашингтон, К. А., Вернер, К. Т., Чжан Ю., Барбера Г., Ли Ю., Линь Д. Т..Бичер, штат Нью-Джерси, и др. Передние нервные цепи. 2021 5 октября; 15: 762441. DOI: 10.3389 / fncir.2021.762441. Электронная коллекция 2021 г. Передние нервные цепи. 2021 г. PMID: 34675782 Бесплатная статья PMC. Обзор.

  • Использование нескольких новых нейробиологических методов для исследования нейротоксикологии окружающей среды у мышей.

    Цай П., Ли Х. Цай П. и др. Методы Мол биол. 2021; 2326: 105-122.DOI: 10.1007 / 978-1-0716-1514-0_8. Методы Мол биол. 2021 г. PMID: 34097264

  • Двухфотонная флуоресцентная визуализация.

    Фэн Ф, Мао Х, Ван А, Чен Л. Feng F и др. Adv Exp Med Biol. 2021; 3233: 45-61. DOI: 10.1007 / 978-981-15-7627-0_3. Adv Exp Med Biol. 2021 г. PMID: 34053022

  • Создание собственного оборудования для нейробиологии: прецизионный микроманипулятор и эпифлуоресцентный микроскоп для визуализации кальция.

    Райан Дж., Джонсон Б.Р., Дейтчер Д. Райан Дж и др. J Бакалавриат Neurosci Educ. 2020 31 декабря; 19 (1): A134-A140. eCollection 2020 Осень. J Бакалавриат Neurosci Educ. 2020. PMID: 33880101 Бесплатная статья PMC.

  • Моторизованный вертлюг с открытым исходным кодом для in vivo нейронных и поведенческих записей.

    Барбера Г., Чжан Ю., Вернер С., Лян Б., Ли Ю., Линь Д.Т.Barbera G, et al. МетодыX. 2020 3 декабря; 7: 101167. DOI: 10.1016 / j.mex.2020.101167. Электронная коллекция 2020. МетодыX. 2020. PMID: 33318960 Бесплатная статья PMC.

Типы публикаций

  • Поддержка исследований, N.I.H., очная

Условия MeSH

  • Поведение, Животные / физиология *
  • Линза, Кристаллическая / физиология
[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

NINscope: универсальный минископ для исследования цепей в нескольких областях

Введение

Получение изображений с разрешением клетки с использованием миниатюрных флуоресцентных микроскопов (минископов) позволяет отслеживать топологию активности в цепях мозга во время неограниченного поведения.В то время как достижения в области электрофизиологии теперь позволяют регистрировать сразу несколько тысяч нейронов у бодрствующих животных (Juavinett et al., 2018; Jun et al., 2017), методы визуализации могут измерять активность отдельных нейронов и сохранять информацию об их активности. пространственно распределены в большой сети (Kim et al., 2016; Stirman et al., 2016; Terada et al., 2018). Часто существует анатомический субстрат для кластерной активности, такой как в случае мозжечка, где соседние клетки Пуркинье получают входные данные от лазящих волокон, происходящих из соседних нейронов ядра ствола мозга нижней оливы (Ruigrok, 2010).Таким образом, методы визуализации могут показать, как отдельные клетки, встроенные в более крупную сеть, демонстрируют скоординированную активность на разных этапах поведения или обучения (Galiñanes et al., 2018; Giovannucci et al., 2017; Heffley et al., 2018; Wagner et al. , 2017). Более того, благодаря своей способности регистрировать свободно движущихся животных, минископы сыграли важную роль в обнаружении паттернов нейронной активности, возникающих при естественном поведении и связанных состояниях мозга, включая социальные взаимодействия (Kingsbury et al., 2019; Лян и др., 2018; Муруган и др., 2017; Remedios et al., 2017) или сон (Chen et al., 2018; Cox et al., 2016) с полностью неизменным вестибулярным входом.

Минископы с открытым исходным кодом предоставили доступные инструменты для исследования клеточной активности грызунов (Cai et al., 2016; Ghosh et al., 2011) и птиц (Liberti et al., 2017, 2016) во время необузданного поведения и до сих пор разрешены записи из одного региона. Однако, чтобы понять, как мозговые цепи вызывают поведение, было бы предпочтительнее исследовать многообластные взаимодействия во время спонтанного или тренированного поведения.Если с этой целью используются мини-микроскопы, они должны быть достаточно легкими и компактными, чтобы можно было делать записи с нескольких мест без ущерба для качества изображения, позволять прямое отслеживание поведения и иметь возможность управлять цепями оптогенетически. Чтобы удовлетворить эти потребности, мы разработали универсальный и компактный минископ (NINscope) с чувствительным датчиком CMOS, встроенным инерциальным измерительным блоком (IMU) и точным светодиодным драйвером для оптогенетического срабатывания других областей мозга с помощью специального светодиодного зонда.

Используя возможности NINscope, мы демонстрируем функциональные взаимодействия между мозжечком и корой головного мозга у мышей без ограничений, носящих двойные мини-микроскопы. Сложная импульсная активность дендритов клеток Пуркинье коррелировала с клеточной активностью, измеренной в коре головного мозга во время периодов движения, в соответствии с предыдущими анатомическими и функциональными исследованиями церебелло-таламо-кортикальной связи (Akkal et al., 2007; Badura et al., 2018; Bostan et al., 2013; Gao et al., 2018; Hoover, Strick, 1999; Wagner et al., 2019). Более того, активность, коррелированная по регионам, обычно предшествовала пиковому поведенческому ускорению. Используя встроенные возможности оптогенетической стимуляции NINscope в сочетании со считыванием показаний акселерометра, мы показываем, что активация полушарий мозжечка или червя вызывает латеральные поведенческие реакции и активацию кортикальных нейронов, повторяя церебелло-церебральную функциональную связь.

Наконец, мы демонстрируем применимость NINscope к изображениям нейронов в спинном полосатом теле мыши, области глубокого мозга, доступной только после имплантации ретрансляционной линзы GRIN.Используя акселерометр NINscope и поведенческий анализ видеоданных, мы идентифицируем клетки в спинном полосатом теле, активность которых модулируется исключительно, когда мыши делают повороты, противоположные месту записи, подчеркивая латерализацию в спинном полосатом теле и роль этих нейронов в представлении пространства действия (Барбера et al., 2016; Cui et al., 2013; Klaus et al., 2017). Оптогенетическая стимуляция префронтальной или вторичной моторной коры вместе с глубокими изображениями головного мозга также показывает, что сигналы из обеих областей коры могут модулировать активность нейронов в дорсальном полосатом теле, хотя и с разной эффективностью.

В целом NINscope разрешает новые типы записи у необузданных мышей. Мы демонстрируем возможность одновременной записи из двух областей одной и той же мыши, использования встроенного драйвера светодиода в сочетании с имплантируемым светодиодным датчиком для оптогенетической стимуляции и анализа поведенческих состояний путем включения акселерометра. NINscope — это проект с открытым исходным кодом, позволяющий другим развивать его дизайн и функциональные возможности, тем самым внося свой вклад в растущий спектр инструментов с открытым исходным кодом для изучения нейронных цепей во время безудержного поведения.

Результаты

Конструкция и функциональность NINscope

NINscope ( Рис. 1A-C ) имеет ту же общую конструкцию, что и другие минископы с открытым исходным кодом, с некоторыми модификациями для экономии места и веса. Использовали более тонкий оптический эмиссионный фильтр и дихроичное зеркало (оба 500 мкм), а эмиссионный фильтр (1 мм) приклеивали к плоско-выпуклой линзе с помощью оптического склеивающего клея (NOA81, Norland Products). Были спроектированы специальные межблочные сенсоры высокой плотности (HDI) и интерфейсные платы (10 на 10 мм, , рис. 1D, ), они были оснащены электронными компонентами с использованием механизма подбора и установки (NeoDen4, NeoDen Tech, Ханчжоу, Китай) и уложены друг на друга. для сохранения небольшой занимаемой площади.Это позволило включить IMU и несколько драйверов светодиодов, в том числе один для оптогенетического срабатывания и два для управления светодиодами возбуждения. Последняя функция позволяет перейти от режима одиночного возбуждения к режиму двойного возбуждения.

Рис. 1 NINscope, универсальный и компактный минископ.

A , Фотография NINscope с коаксиальным кабелем и кабелем натяжения, проводом возбуждения (исключая) светодиодом, оптогенетическим светодиодным датчиком, а также проводом датчика с разъемом (разъем светодиодного датчика), идущим от минископа. B , Мышь с установленным NINscope, обнаруживающим красный следящий и индикаторный светодиод. C , Схематические чертежи NINscope с размерами в мм. Две печатные платы HDI 10 на 10 мм, одна для интерфейса с блоком сбора данных, а другая — с датчиком изображения CMOS, уложены друг на друга и смонтированы в корпусе, напечатанном на 3D-принтере. Возбуждающий свет от светодиода коллимируется полушариковой линзой, проходит через возбуждающий фильтр и отражается дихроичным зеркалом на образец. Излучаемая флуоресценция собирается через линзу объектива GRIN и проходит через дихроичную и плосковыпуклую линзу, которая фокусирует изображение на датчике CMOS.Эмиссионный фильтр наклеивается на плосковыпуклую линзу с помощью оптического клея. D , KiCad чертежи пользовательских интерфейсов и печатных плат датчика с видами сверху и снизу, включая все помеченные компоненты. Плата интерфейса содержит инерциальный измерительный блок (IMU) для измерения ускорения и ориентации головы, 3 драйвера светодиодов, в том числе один для оптогенетического (стробоскопического) управления и 2 для светодиодов возбуждения (1 используется), а также красный светодиод отслеживания, сериализатор, и расширитель ввода-вывода.Плата датчика содержит датчик PYTHON480 CMOS и секвенсор, который управляет синхронизацией датчика и ядром изображения. E , UCLA Miniscope DAQ card v3.2 использовалась с небольшими модификациями, включая 256 КБ x 8-битную EEPROM I2C (STMicroelectronics) и проводное соединение, соединяющее вход / выход общего назначения 2 (GPIO2) с контрольной точкой 4 ( TP4). Сигналы последовательного периферийного интерфейса (SPI): выход главного устройства, вход подчиненного устройства (MOSI), последовательный clk (SCK) и выбор подчиненного устройства (SSN) подключаются к GPIO0, GPIO1 и GPIO3 через перемычки.

Датчик PYTHON480 (ON Semiconductor) был выбран как компактный, но чувствительный датчик CMOS (размер пикселя: 4,8 мкм, динамический диапазон> 59 дБ) со скромными требованиями к мощности. NINscope использует линзу GRIN диаметром 1,8 мм (числовая апертура 0,55, # 64-519, Edmund Optics) в качестве объектива и имеет увеличение ∼4,6 ×. Это дало нам приблизительные размеры поля 786 на 502 мкм с использованием области интереса (ROI) 752 x 480 пикселей. В программном обеспечении мы реализовали возможность преобразования этой области интереса для покрытия области CMOS-сенсора размером 800 x 600 пикселей (836 на 627 мкм).

Из-за широкой доступности UCLA Miniscope первого поколения мы сохранили модуль сбора данных (DAQ V3.2) проекта UCLA Miniscope с небольшими изменениями, которые включали EEPROM для хранения большей модифицированной версии последней Cypress EZ- Встроенное ПО USB FX3 и проводное соединение от входа / выхода 2 общего назначения (GPIO2) к контрольной точке 4 (TP4), что обеспечивает точность синхронизации 1 мс для оптогенетического драйвера светодиода (, рис. 1E, ). Прошивка модуля DAQ была изменена, чтобы обеспечить возможность последовательного управления оптогенетической яркостью и яркостью светодиода возбуждения, а также усилением, экспозицией и уровнем черного CMOS-сенсора.

Корпус микроскопа был напечатан на 3D-принтере (принтер EnvisionTec Micro Plus Advantage, смола RCP30 M и принтер Formlabs Form 2, черная смола RS-F2-GPBK-04) для первоначального быстрого прототипирования различных конструкций минископов. Точность печати оказалась достаточной для нашего окончательного дизайна, что позволило нам снизить вес минископа до 1,6 грамма (корпус + оптика + печатные платы), одновременно позволяя использовать два минископа одновременно на одной мыши. Верхняя половина NINscope имеет кожух для сенсорных и интерфейсных плат, чтобы защитить их от повреждений при необузданном поведении животных.NINscope крепится на небольшой опорной плите (6,5 на 7,5 мм, , дополнительный рисунок 1, ) с помощью установочного винта. Нижняя половина корпуса NINscope имеет выступ, который входит в выемку в опорной плите для повышения устойчивости.

Пользовательский интерфейс был написан на языке Processing (http://processing.org), что обеспечивает межплатформенную совместимость и управление экспериментальными записями. Была включена опция для записи в режиме с одной или двумя головками (два мини-микроскопа) в сочетании с дополнительной веб-камерой USB для видеозахвата поведения.Мы использовали кольцевые буферы в программном обеспечении, чтобы избежать задержек по времени и потери кадров во время сбора данных. Отметки времени для полученных кадров регистрировались для апостериорной синхронизации. Данные акселерометра от IMU могут быть визуализированы в реальном времени во время записи минископа. Кроме того, паттерны оптогенетической стимуляции и ток светодиодного зонда можно регулировать через интерфейс, обеспечивающий интегрированное управление всеми аспектами эксперимента (, дополнительный рисунок 2, ). Более подробное описание аппаратного и программного обеспечения представлено в разделе «Материалы и методы».Файлы дизайна и инструкции по сборке оборудования, программированию микропрограмм и установке программного обеспечения можно найти на нашем сайте GitHub: https://github.com/ninscope.

Чтобы проверить наш минископ, мы получили изображения в различных конфигурациях записи и стимуляции, включая режимы с одним и двумя осциллографами в разных областях мозга. За поведением животных следили с помощью веб-камеры USB (, рис. 2A, ), светодиода слежения на мини-микроскопе (, рис. 2B, ) и бортового акселерометра.В показанном примере клетки Пуркинье в дольке V мозжечка (AP: -6,4, ML: 0 мм) были трансдуцированы с помощью GCaMP6f, а их дендриты были визуализированы и сегментированы с использованием алгоритма CNMF_E (Zhou et al., 2018) ( Рисунок 2 C, D ). Минимальная мощность света (~ 120-240 мкВт до, 30-140 мкВт после входа в объектив GRIN, в пределах линейного диапазона возбуждающего драйвера светодиода, дополнительный рисунок , ) требовалась для получения высококачественных записей отношения сигнал / шум. с помощью объектива GRIN, установленного на поверхности мозга ( Рисунок 2E, Movie 1 ).Никакого обесцвечивания сигнала или фотоповреждений не наблюдалось после наших сеансов визуализации (обычно 5 000-20 000 кадров, то есть 2-11 минут на сеанс, повторяемый с короткими перерывами не менее 10 раз). Каналы акселерометра по осям x, y и z использовались для обнаружения начала движения (, рис. 2F, ) и определения специфического поведения, такого как вставание на дыбы (, рис. 2G, ), прием пищи и уход.

Рис. 2 Сбор данных с помощью NINscope.

A , Мышь с одним NINscope, установленным над V долькой мозжечка, который использовался для получения показанных данных. B , Светодиод отслеживания NINscope может использоваться для получения информации о положении животного в сочетании с одновременными записями с веб-камеры. Цвета представляют время от начала записи, а дорожка представляет исследование клетки в течение ~ 2 минут. C , Средняя проекция кадров NINscope, полученных в V доле мозжечка (масштабная полоса = 100 мкм). D , Максимальная проекция дендритов клеток Пуркинье, сегментированных с использованием CNMF_E (Zhou et al., 2018). E , Переходные процессы кальция, полученные из 168 сегментированных дендритов клеток Пуркинье, показаны вместе с данными акселерометра по осям x, y и z и средним сигналом по шкале Z, показывающим периоды совместной активности клеток Пуркинье. F , переходные процессы клетки Пуркинье были выровнены по началу ускорения в области, заштрихованной красным цветом в E. В этом примере рефлексивное движение (подергивание) запускалось громким хлопком. G , Спонтанное поведение, отслеживаемое с помощью веб-камеры, может быть связано с различными сигнатурами в данных акселерометра, например, во время выращивания.Пунктирными линиями обозначены моменты времени, соответствующие животному непосредственно до (1) и после выращивания (2). Подмножество клеток Пуркинье также ответило на это поведение.

Визуализация мозгово-церебральных взаимодействий в клеточном разрешении у мышей без ограничений. Наша конкретная цель состояла в том, чтобы получить одновременные записи клеточного разрешения мозжечка и коры головного мозга.Существует множество анатомических свидетельств церебелло-таламо-церебральных петель (Akkal et al., 2007; Bostan et al., 2013; Hoover and Strick, 1999), и все большее количество исследований показывают, что функциональные взаимодействия внутри таких петель важны для правильное выражение социального, когнитивного и моторного (планирующего) поведения (Badura et al., 2018; Gao et al., 2018; Stoodley et al., 2017). Возможность одновременной записи как мозжечка, так и коры головного мозга у необузданных мышей открывает возможность изучить, как эти взаимодействия проявляются во время естественного спонтанного поведения.

Учитывая уменьшенную занимаемую площадь и вес (1,6 г), мы смогли установить два NINскопа на одну мышь. В этих условиях мыши демонстрировали типичные исследования клетки, уход, еду и выращивание, как это было видно на мышах с одним мини-микроскопом (, рис. 3А, ). Наша конструкция позволяет производить записи из двух областей у мышей с минимальным расстоянием между опорной пластиной 8,15 мм и минископами, расположенными под углом 15 ° друг к другу ( Рисунок 3B ). Учитывая эти ограничения, становится возможным одновременное ведение записей из лобных частей коры (включая премоторную кору (M1), вторичную моторную кору (M2) и префронтальную кору) и мозжечка, а также из мозжечка и рострального полосатого тела.Таким образом, с помощью NINscope можно записывать данные из нескольких наборов различных областей, участвующих в планировании, инициировании и контроле движения.

Рис. 3. Визуализация мозгово-церебральных взаимодействий в клеточном разрешении у необузданных мышей.

A , Мышь с двумя установленными NINскопами. B , Минимальное расстояние между опорными плитами 8,15 мм достигается, когда два NIN-микроскопа расположены под углом 15 °. C , GCaMP6f трансдуцировался селективно в клетках Пуркинье мозжечка (долька VI или симплексная долька) и неизбирательно в моторной коре. D , Примеры сегментированных дендритов клеток Пуркинье в мозжечке (CBL) и нейронов в коре головного мозга (CTX) с клеткой в ​​каждой области, выделенной красным, с соответствующими переходными процессами кальция и обнаруженными событиями (черные треугольники). E , Двухсайтовые записи из доли VI мозжечка и моторной коры, показывающие ответы всех сегментированных нейронов в каждой области со средним значением Z-сигнала, количеством коактивных дендритов клеток Пуркинье и сложным сигналом ускорения ( xyz , √ (x 2 + y 2 + z 2 )).Голубые линии представляют эпохи, когда синхронные паттерны (SP) были обнаружены в мозжечке и коре. F , Комбинированные графики дуги для набора данных, визуализирующих внутримозжечковые, внутримозговые (внутри) и мозжечко-церебральные (поперечные) связи SP для показанных данных. Радиусы узлов масштабируются по количеству ячеек, к которым узел подключается. В этом примере ясно, что нейроны мозжечка с высоким содержанием SP также обнаруживают значительные SP в разных регионах. G , SP использовались для запуска комплексного сигнала ускорения.Поведенческое ускорение может быть отнесено к четырем категориям, состоящим из без изменений (нет Δ, 64%, отсортировано по пиковому отклику), поведенческое ускорение после SP (31%), до SP (4%) или около SP (1%). , не показано). H , SP в разных регионах связаны со значительными отклонениями от базовой линии в сигнале соединения акселерометра. Реагирующие клетки показаны в мозжечке (долька VI) и коре головного мозга, запущенных SP. Мышь, отдыхающая перед SP, которая совершила (влево, вверх) движение вокруг начала SP.Движение животного, визуализируемое оптическим потоком, имеет цветовую маркировку (на вставке показана направленная цветовая плоскость). I , Усредненные по популяции ответы, инициированные вокруг обнаруженных SP, показывают ответы в мозжечке и коре во время подъема акселерометра. J , Клетки мозжечка и коры головного мозга, участвующие в SP (красный), и клетки, которые не участвовали (голубой). K , Небольшая пространственная кластеризация по SP — по оценке с использованием I Морана — наблюдалась во всех записях. Показаны вероятности I Морана, рассчитанные для мозжечка и коры головного мозга во время SP.

Для наших двухсайтовых записей инъекции вируса были выполнены для селективной трансдукции GCaMP6f в мозжечковые клетки Пуркинье простой дольки мозжечка (AP центра объектива GRIN: -5,8, ML: 2,2 мм) или дольки VI (AP центра объектива GRIN: -7,4, ML : 0,0 мм) и глобально в нейронах моторной коры (центр объектива GRIN AP: +1,4, ML: 1,5), покрывающих большие части каудальной области передних конечностей и небольшую часть M2 на ростральной границе линзы объектива GRIN (рис. 3С ).

Нам удалось извлечь сигналы из сотен клеток в обеих областях (мозжечок: 141 ± 53, диапазон 62-200, кора головного мозга: 201 ± 90, диапазон 89-361, среднее ± стандартное отклонение, n = 4 мыши, Рисунок 3D ).Переходные процессы кальция из дендритов клеток Пуркинье, экспрессирующие GCaMP6f, демонстрировали более быструю кинетику распада, чем клетки коры, экспрессирующие тот же белок-сенсор кальция (t 1/2 мозжечка: 0,217 ± 0,12 с, 15784 переходных процесса, t 1/2 коры: 0,488 ± 0,34 s, 9424 переходных процесса, среднее значение ± стандартное отклонение, Hedge’s G = 1,19, Рисунок 3D, E ), что, вероятно, отражает различия в эндогенной буферности кальция (Baimbridge et al., 1992; Celio, 1990). Частота событий, измеренная на дендритах клеток Пуркинье, соответствовала базовой скорости восходящего входа волокна (0.62 ± 0,39 Гц, среднее ± стандартное отклонение, 1629 клеток, n = 4 мыши), в то время как кортикальные нейроны запускали события с более низкой частотой (0,22 ± 0,28 Гц, среднее ± стандартное отклонение, 2212 клеток, n = 4 мыши).

Во всех записях мы наблюдали отдельные периоды повышенной активности по регионам ( Фильм 2), вокруг периодов движения животных (, рис. 3E, ), как было определено по сигналу сложного ускорения и просмотру необработанных данных. Для количественной оценки корреляций между мозжечком (долька VI, симплексная долька у двух животных) и кортексом времена переходных событий были объединены с помощью ядра Епанечникова и суммированы по всем клеткам, в результате чего получилась сумма ядра, где глобальные синхронные паттерны (SP) были определены как экземпляры где сумма ядра превышает среднее значение + 2σ (голубые линии на , рис. 3E ).Визуализация функциональной связности клеток показана на комбинированных диаграммах дуги , рис. 3F, , где размер узла зависит от количества SP в мозжечке (долька VI в этом примере), коре и в двух областях. И клетки Пуркинье мозжечка, и нейроны коры отображали SP внутри и между регионами, причем клетки Пуркинье имели значительно больше внутренних SP, чем кортикальные нейроны (доля общей доли VI: 66,4 ± 18,9%, долька симплексной формы: 73,3 ± 27,4%, кора головного мозга: 35,7 ± 17). %, среднее ± стандартное отклонение, CBL по сравнению с CTX p = 2.7801e-17, тест КС). Во всех SP участвовало значительно больше клеток Пуркинье, чем кортикальных нейронов (фракция общей доли VI: 42,3 ± 29,6%, фракция симплексной доли: 47,4 ± 31,6%, кора головного мозга: 26,7 ± 18,5%, среднее ± стандартное отклонение, CBL по сравнению с CTX p = 1,8409 е-15, тест КС).

Затем мы изучили, связана ли коррелированная активность мозжечка и коры головного мозга с поведенческим ускорением. Чтобы определить, предшествовал ли он межрегиональным SP или следовал за ними, сигнал сложного ускорения запускался от межрегиональных SP.Мы могли бы отнести поведенческое ускорение к четырем категориям (, рис. 3G, ), состоящим из отсутствия значительных изменений (64%, 206/321 между SP), поведенческого ускорения после SP (31%, 99/321), до SP ( 4%, 13/321) или около-SP (1%, 3/321). Таким образом, большинство (86%, 99/115) SP, связанных со значительными событиями ускорения, следовали за SP. Мы также подтвердили, что SP связаны с событиями ускорения, сравнив долю ускорения, инициированного случайным образом, и ускорения, инициированного SP, превышающего среднее значение + 2σ от базового уровня, чтобы показать, что доля событий ускорения, инициированных SP, не могла возникнуть случайно (случайное против SP- срабатывает, p = 0.0017, тест КС).

Как и ожидалось, переходные процессы кальция в клетках Пуркинье мозжечка и корковых нейронах происходили вокруг поведенческого ускорения ( Рисунок 3H, I ). В показанном примере (запускается поперечным SP, обозначенным голубыми треугольниками на , рис. 3E и 3H ), в сигнале составного акселерометра произошло большое отклонение около начала SP. Это движение также было замечено при проверке одновременных кадров изображений веб-камеры и визуализировано здесь оптическим потоком, с цветами, представляющими направление движения до (вверху) и вокруг начала SP (внизу).

Согласование записей (n = 4 животных, 9 записей) с наступлением пост-SP выявило явный подъем сигнала акселерометра, совпадающий с увеличением кальция как в клетках Пуркинье мозжечка, так и в корковых нейронах (, рис. 3I, ). Хотя визуализация кальция не дает очень точных оценок латентности, мы исследовали относительное время реакции кальция в мозжечке и коре головного мозга относительно ускорения движения. Задержки до пикового отклика переходных процессов кальция в мозжечке, коре головного мозга и сигнал сложного ускорения показали, что максимальное ускорение наступило после пикового отклика как в мозжечке, так и в коре (CBL: 444 ± 280 мс, CTX: 505 ± 260 мс, xyz : 700 ± 269 мс, критерий Краскела-Уоллиса p = 1.6553e-08). Апостериорный тест с использованием S Шеффе показал, что средние значения латентности переходных пиков кальция значительно различались по сравнению с задержкой пикового отсроченного сигнала акселерометра, в то время как это не применялось при сравнении средних рангов переходных процессов кальция в мозжечке и кортикальном слое. . Таким образом, на основании наших предварительных данных, записанных с помощью NINscope, мы показываем, что скоординированная церебелло-церебральная активность обычно предшествует пиковому ускорению движения.

В некоторых записях мы наблюдали пространственную кластеризацию активности в мозжечке и / или коре во время поперечных SP ( Рисунок 3J ).Чтобы количественно оценить пространственную кластеризацию клеток, участвующих в SP, был рассчитан показатель пространственной автокорреляции I Морана. Была вычислена вероятность I Морана, вероятность того, что клетки с высокой степенью совместного срабатывания распределены случайным образом. Эти вероятности (мозжечок: 0,40 ± 0,28, диапазон = 0,005-0,76, кора головного мозга: 0,45 ± 0,34 диапазон = 0-0,97) предполагают, что не было явной пространственной кластеризации активности SP ( Рисунок 3K ). Будущие исследования, анализирующие более точно аннотированное поведение с использованием более широкой когорты животных, могут разрешить возникновение пространственной кластеризации во время поведенчески релевантных SP.

Ответы коры головного мозга во время многоузловой стимуляции мозжечка

До сих пор оптогенетика минископа фокусировалась на стимуляции в том же поле зрения (Stamatakis et al., 2018). Стимуляция в одном и том же поле зрения накладывает ограничения на конструкцию мини-микроскопа, что требует дополнительной оптики, что увеличивает вес и площадь основания мини-микроскопа. Это также требует использования опсина, который можно спектрально отделить от индикатора активности. Более того, часто желательно стимулировать место, удаленное от минископа, например, чтобы активировать пути непрямого проецирования.Путем прямого управления светодиодом от минископа можно уменьшить количество кабелей, в то время как начало стимула может быть напрямую записано на диск вместе с кадрами изображения и данными акселерометра, чтобы упростить апостериорный анализ. Используя встроенный светодиодный драйвер NINscope, мы демонстрируем его использование путем стимуляции клеток Пуркинье мозжечка у трансгенных мышей Pcp2-Cre Jdhu x Ai32 (RCL-ChR2 (h234R) / EYFP) при выполнении визуализации кальция из нейронов моторной коры, трансдуцированных с помощью GCaMP6f (рис. 4A , объективный центр GRIN AP: +1.4, МЛ: 1.5). Мы выбрали 4 участка мозжечка для имплантации синих светодиодов (470 нм): голень II ипси- и контралатеральному месту визуализации в правом полушарии, контралатеральная симплексная долька и долька VI в медиальном черве мозжечка (, рис. 4B, ). Светодиодные датчики состояли из самого имплантированного светодиода, провода и разъема с контактами (, рис. 4C, ), которые позволяли переключать подключение драйвера светодиода минископа с одного места имплантации на другое (, рис. 4D, ).

Рис. 4. Ответы коры головного мозга на многоузловую стимуляцию мозжечка.

A , Pcp2-Cre Jdhu мышей скрещивали с мышами Ai32 для получения селективной экспрессии ChR2 (h234R) в клетках Пуркинье мозжечка. Нейроны моторной коры у этих мышей трансдуцировали с помощью GCaMP6f. B , светодиоды (470 нм) были имплантированы в четырех местах над поверхностью мозжечка с местоположениями, соответствующими симплексной дольке, области ножки II, контралатеральной участку изображения, дольке VI червя и области ножки II, ипсилатеральной по отношению к участку изображения. C , Мышь с опорной пластиной над местом формирования изображения и четырьмя контактами разъема, которые использовались для подключения NINscope к светодиодам. D , Мышь с установленным NINscope и подключением к одному из участков стимуляции. E , Оптогенетическая стимуляция клеток Пуркинье (50 мс, 22 мА, 2,3 мВт) вызвала четко заметное увеличение как среднего ответа, так и количества коактивных клеток в моторной коре (для ясности показана подгруппа переходных процессов кальция). Повторная стимуляция вызвала подобную нарастанию активность в коре головного мозга. Данные акселерометра показали отклонения после смещения стимула, вероятно, отражающие отскок ядер мозжечка после освобождения от ингибирования клеток Пуркинье. F , В этом примере большая часть клеток ответила (ответивших) на оптогенетическую стимуляцию контралатеральной ножки II. Слияние цветов показывает пространственную локализацию респондеров (красный) и не отвечающих (голубой). Реагирующие клетки были отобраны с использованием критерия, согласно которому сигнал после стимула должен превышать среднее значение + 2 σ от исходного уровня до стимула. G , Переходные процессы кальция (серый: отдельные переходные процессы, черный: средние), инициированные к возникновению стимула в четырех разных местах на поверхности мозжечка и соответствующие данные акселерометра каналов x, y и z.Стимуляция Crus II выявляет латерализацию поведенческой реакции: стимуляция справа вызывает движения головы вправо, а стимуляция слева — влево. Вызванные поведенческие рефлексы обычно возникали до появления переходных процессов, связанных с кальцием в коре головного мозга.

Стимуляция каждого из участков мозжечка, имплантированных светодиодами (50 мс, ток 22 мА, мощность света 2,3 мВт), вызвала ответы в моторной коре правого полушария ( Рисунок 4E-G, фильм 3 ). Повторяющаяся стимуляция мозжечка (0.3 Гц, 4-5 раз) может вызвать линейную активность, как видно при усреднении ответов по клеткам моторной коры (, рис. 4E, ). Данные акселерометра минископа регистрировали движение, которое происходило с задержкой после смещения стимула (ipsi голени II: 76 ± 23 мс; голени II контра: 80 ± 30 мс; долька VI: 79 ± 34 мс; долька симплекса: 73 ± 32 мс, среднее ± SD, n = 2 мыши) в соответствии с более ранними наблюдениями, что растормаживание клеток Пуркинье и связанное с ним обратное возбуждение нейронов в ядрах мозжечка может вызывать замедленные двигательные рефлексы (Hoebeek et al., 2010; Witter et al., 2013). Значительное количество клеток соответствовало критерию отображения увеличения кальция, превышающего среднее значение + 2 σ от исходного уровня до стимула, и были помечены как отвечающие ( Рисунок 4F, ). По всем записям и участкам стимуляции количество ответивших составляло примерно половину всех сегментированных клеток моторной коры (49,9 ± 14,2%, среднее ± стандартное отклонение, 2227/4614 клеток, n = 2 мыши). Средние амплитуды транзиентов кальция по шкале Z, измеренные в нейронах моторной коры, варьировались в зависимости от стимулируемой области (crus II ipsi: 2.1 ± 1,3 Z; голень II против: 2,9 ± 1,5 Z; долька VI: 2,9 ± 1,6 Z; симплексная долька: 2,0 ± 1,3 Z; Тест Краскала-Уоллиса p = 1,1239e-70 и апостериорные множественные сравнения с использованием S Шеффе выявили значительно разные средние ранги для стимуляции контралатеральной доли VI и голени II относительно других групп) (, рисунок 4G, ), но все они были сопоставимы. время начала (верхняя часть II ipsi: 218 ± 120 мс; нижняя ножка II: 221 ± 118 мс; долька VI: 233 ± 123 мс; симплексная долька: 212 ± 130 мс, среднее ± стандартное отклонение; Краскал-Уоллис, p = 0.1, н.с) относительно смещения стимула. Времена наступления переходного процесса имели ненормальное распределение по оценке с помощью теста Андерсона-Дарлинга (статистика теста AD: 5,76, диапазон: 16-577 мс относительно смещения стимула), что позволяет предположить, что субпопуляция корковых клеток может реагировать во время выполнения оптогенетически срабатывают двигательные рефлексы. В среднем, однако, стимуляция мозжечковых клеток Пуркинье вызывала медленный рост корковых ответов, которые не могли напрямую способствовать движению, но вместо этого могли подготовить моторную кору для предстоящих движений.Наиболее плотные выступы из пересечения мозжечка, поэтому можно было бы ожидать сильнейшей активации контралатеральной коры. Более сильная пиковая амплитуда наблюдалась при стимуляции контралатерального мозжечка, но значительный ответ был также вызван ипсилатеральной стимуляцией мозжечка. Одним из возможных объяснений может быть наличие сильных комиссуральных выступов между полушариями (Chovsepian et al., 2017). Сравнительно медленный отбор образцов, связанный с визуализацией кальция, мог замаскировать любые межполушарные задержки.Предостережение этих проверочных экспериментов могло заключаться в том, что мы не стимулировали локально, направляя свет через оптические волокна малого диаметра; тем не менее, даже при нашей грубой стимуляции наблюдалась явная латерализация поведенческих реакций. Стимуляция клеток Пуркинье над обоими полушариями мозжечка вызвала противоположные движения головы, как определено по данным нашего акселерометра с движениями влево при стимуляции движений влево и вправо при стимуляции правой голени II (, рис. 4G, ).Крусы I и II у грызунов важны для сенсомоторной интеграции в отношении ротовой полости и поведения взбивания (Ju et al., 2019; Romano et al., 2018), но информация о голове и шее обеспечивает вход в эти две области, а также через внешние клиновидное ядро ​​(Huang et al., 2013; Quy et al., 2011), а у людей движения головы происходят одновременно с активацией полушарий мозжечка (Prudente et al., 2015). Боковая стимуляция левой симплексной дольки вызывала более умеренные боковые движения по сравнению со стимуляцией второй голени, в то время как они в основном отсутствовали при стимуляции над медиальной долей червя VI, где движения вперед / назад были относительно более выраженными.В целом, ответы нейронов коры головного мозга были устойчивыми независимо от стимулированной области мозжечка, обнаруживая сильную функциональную церебелло-церебральную связь. Поведенческие рефлексы, зарегистрированные с помощью акселерометра при стимуляции клеток Пуркинье, по-видимому, не коррелировали напрямую с активацией коры головного мозга, что предполагает более вероятный сценарий нисходящих целей в стволе мозга, лежащих в основе этих рефлексов.

Кодирование действий в дорсальном полосатом теле

Стриатум представляет собой подкорковую структуру, недоступную для визуализации без опускания ретрансляционной линзы GRIN в интересующий участок (, рис. 5A, ).Из-за повреждения тканей вдоль и ниже следа хрусталика требуется более длительное время восстановления, прежде чем можно будет начать визуализацию (Bocarsly et al., 2015). Значительное количество света теряется из-за комбинации двух линз GRIN на оптическом пути (реле GRIN и линзы объектива GRIN), что делает эти эксперименты более сложными, чем получение изображений дендритов клеток Пуркинье мозжечка или поверхностных слоев коры головного мозга. Чтобы проверить NINscope для изучения полосатого тела у животных без ограничений и доказать его эффективность для глубокой визуализации мозга, мы пересмотрели предыдущую работу, в которой была предложена роль дорсального полосатого тела (DS) в инициации противоположных движений и кодировании действий (Cui et al., 2013; Клаус и др., 2017).

Рисунок 5, Изображение пространства действия в спинном полосатом теле.

A , Схема конфигурации NINscope, которая сочетает в себе объектив GRIN с линзой-ретранслятором GRIN для получения изображения дорсального полосатого тела (DS) правого полушария. B , Корональный разрез, показывающий релейную дорожку линзы GRIN и нейроны в DS, экспрессирующие GCaMP6f (желтый). C , Сегментированные области интереса нейронов нанесены поверх корреляционного изображения активности в DS, извлеченного с помощью CNMF-E. D , Типичные переходные процессы кальция с оценкой Z, полученные с помощью DS. E . За животными наблюдали в открытом поле с помощью камеры наблюдения. Световой индикатор в верхней части NINscope, а также x-канал акселерометра позволяли регистрировать движения влево и вправо. Линии с цветовой кодировкой отражают положение следящего светодиода NINscope во времени (1 секунда). F , Данные акселерометра, показывающие среднее левое и правое ускорение канала x вокруг начала движения (среднее значение ± стандартная ошибка среднего).Пунктирные серые линии представляют собой противоположное ускорение. G , Отсортированные переходные процессы с оценкой Z за одну секунду до и после начала движения (n = 5). Было отмечено явное увеличение нейронов правой DS для левого поворота (контралатеральный), которое отсутствовало во время правого поворота (ипсилатеральный). H , Средние переходные ответы кальция выявили четкую модуляцию активности при поворотах влево (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). I , Количественная оценка переходных реакций кальция до и после начала движения для левого и правого поворотов соответственно.Правая DS только показывала значительное увеличение кальций-переходного процесса для левых поворотов (p <0,05).

Используя вирусный вектор с промотором синапсина человека, мы трансдуцировали все нейроны полосатого тела с помощью GCaMP6 в каудальной, дорсальной части полосатого тела правого полушария ( Рисунок 5B ). Непосредственно после вирусной трансдукции над интересующей областью имплантировали релейную линзу GRIN диаметром 600 мкм. После опускания NINscope с установленной линзой объектива GRIN и опорной пластиной животным наносили базисную пластину чуть выше ретрансляционной линзы GRIN, чтобы сфокусировать клетки.В DS мы извлекали сигналы от 84 клеток (62 ± 16,70, среднее ± стандартное отклонение, диапазон 38-84; , рис. 5C, ), которые, исходя из кальциевых переходных процессов, обычно имели частоту около 1 Гц (1,106 ± 0,93 Гц, среднее ± стандартное отклонение, 308 ячеек, n = 5) (, рис. 5D, ). Несмотря на относительно низкую мощность света (∼300 мкВт после объектива и перед релейной линзой GRIN), мы получили хорошие записи отношения сигнал-шум. Используя светодиодный индикатор отслеживания NINscope вместе с данными акселерометра, мы обнаружили эпохи, когда мыши поворачивались и телом, и головой ( Рисунок 5E, Movie 4 ).Такие повороты были связаны с отклонениями вверх или вниз в канале x нашего акселерометра, отражающими движения влево или вправо соответственно (, рис. 5F, ). Во время левых поворотов (контралатеральнее местоположению изображения в DS) большинство нейронов в правой DS (85%, 308 клеток, n = 5) имели пиковый ответ после начала действия, а 20% демонстрировали значительно повышенные ответы на время действия. выполнение (парный базовый уровень t-теста против активности выполнения действия, p <0.05) ( Рисунок 5G, H ). Самый большой из них начался после начала движения, что предполагает преобладающую связь с выполнением действия, а не с подготовкой (латентное начало, 310 ± 45 мс, среднее ± стандартное отклонение). Ни одна из записанных нами клеток не ответила на движения вперед-назад или движения, ипсилатеральные по отношению к месту регистрации ( Рисунок 5G, H ), что подтверждает латерализацию сигналов движения в полосатом теле. Когда сигналы были усреднены за одну секунду до и после начала движения (рис. 5I, J), анализ ANOVA с повторными измерениями выявил значительный основной эффект (F (1.18, 4.7) = 16.48, p = 0 . 01 ) исполнения действия. Пост-хирургическая коррекция Бонферрони для множественных сравнений продемонстрировала, что эффект проявлялся исключительно в эпохи контралатерального (t = 9,45, df = 4, p = 0 , 001 ), но не в начале ипсилатерального движения (t = 3,07, df = 4, NS ).

Нисходящий контроль дорсального полосатого тела

Чтобы выявить влияние корковых входов на нейронную активность в СД животных, не подвергавшихся сдерживанию, мы оптогенетически стимулировали орбитофронтальную кору (OFC) или вторичную моторную кору (M2) во время визуализации DS, используя преимущества способность нашего минископа напрямую включать светодиод.Опсин ChrimsonR был преобразован в любую из двух областей коры и светодиод с длиной волны 625 нм, имплантированный над корой (, рис. 6A, ). Было обнаружено, что в восстановленных препаратах OFC и M2 регулируют активность нейронов в определенных областях DS (Corbit et al., 2019), причем влияние OFC на DS сильнее, чем у M2. Мы стремились подтвердить эти результаты на свободно ведущих мышах. С этой целью мы сначала оценили прямые терминальные поля OFC и M2 в DS и сопоставили это на репрезентативном изображении атласа мозга (, рис. 6B, ).Поступление M2 в DS было более размытым, чем прогнозы OFC, что согласуется с предыдущими выводами (Corbit et al., 2019; Hintiryan et al., 2016; Hunnicutt et al., 2016). Во время сеансов визуализации животные могли свободно исследовать арену открытого поля, в то время как OFC или M2 стимулировались оптогенетически (10 с, частота 20 Гц, ширина импульса 5 мкс, светодиод 3,4 мВт). Три различных типа ответа нейронов DS наблюдались во время периодов стимуляции OFC и M2 и состояли из уменьшенных, увеличенных или неизменных (без изменений) ответов относительно базовой активности (парный t-критерий базовой линии по сравнению с активностью, вызванной стимулом, p <0.05) ( Рисунок 6C ). Переходные процессы кальция во время стимуляции различались между этими кластерами по частоте возбуждения (уменьшение: 0,23 ± 0,25 Гц, среднее значение ± стандартное отклонение, 33 клетки, n = 4, без изменений: 0,77 ± 0,68 Гц, среднее значение ± стандартное отклонение, 199 клеток, n = 4, увеличение: 1,63 ± 1,23 Гц, среднее ± стандартное отклонение, 22 ячейки, n = 4).

Рис. 6. Нисходящий оптогенетический контроль активности дорсального полосатого тела.

A , Схема, показывающая размещение NINscope с объективом GRIN и ретрансляционной линзой GRIN для записи с дорсального полосатого тела (DS), а также расположение оптогенетического светодиодного датчика, управляемого встроенным светодиодным драйвером.Вирусные векторы вводили либо в орбитофронтальную кору (OFC), либо во вторичную моторную кору (M2) для трансдукции нейронов с помощью ChrimsonR или в DS для трансдукции нейронов с помощью GCaMP6 для визуализации кальция. B , Терминальные поля OFC и M2, отображенные на репрезентативном атласе мозга, показывают перекрывающиеся входы в DS под линзой реле GRIN. C . При оптогенетической стимуляции OFC или M2 были обнаружены различные типы ответов при DS. Нейроны демонстрировали снижение активности (синий), отсутствие видимых изменений (оранжевый) или усиление ответов (красный). D , переходные процессы кальция по шкале Z во время стимуляции OFC (слева, n = 2) и M2 (справа, n = 2) (импульс 10 с, 20 Гц). Для каждого нейрона усредняли 10 испытаний. E , Ответы, усредненные по всем нейронам DS для всех 10 испытаний, выявили аналогичные типы модуляции во время стимуляции OFC и M2 (среднее ± SEM). Круглая вставка обозначает долю клеток, которые показали подавление, отсутствие изменений или повышенный ответ.

Стимуляцию повторяли для 10 испытаний, а ответы усредняли по испытаниям (, фиг. 6D, ).Наблюдалась модуляция активности в субпопуляциях нейронов DS во время стимуляции OFC: 20% нейронов (26/133) показали значительное снижение активности, 69% не показали изменений (93/133) и 11% (15/133) были вырос. Стимуляция M2 оказала сравнимое, но более слабое влияние на активность субпопуляций нейронов DS: 7% нейронов (7/107) показали снижение, 86% (93/107) не показали изменений и 7% (7/107) клеток показали повышение активности. Хотя доля отзывчивых нейронов DS (т.е.е. те, которые показывают уменьшение или увеличение) во время корковой стимуляции значительно различались между OFC (31%) и M2 (14%) (хи-квадрат (1) = 13,85, p <0 , 001 ), средний ответ для каждого Категория нейронов DS во время стимуляции была сопоставимой ( Рисунок 6E ). Уменьшенные нейроны демонстрировали постепенное снижение активности на время стимуляции, тогда как нейроны, реагирующие на стимуляцию повышенной активностью, демонстрировали прогрессивное увеличение до тех пор, пока стимуляция предоставлялась, предполагая, что входная модуляция активности в нейронах DS масштабировалась с продолжительностью стимуляции.

Обсуждение

NINscope

Мы продемонстрировали применимость NINscope для выполнения двойной записи у мышей и сочетания поверхностной и глубокой визуализации мозга с оптогенетической стимуляцией, анализируя движения с помощью встроенного акселерометра.

Наш минископ 1,6 г не идет на компромисс с точки зрения веса или занимаемой площади, чтобы добавить функциональность, что делает его ценным вкладом в расширяющийся набор инструментов мини-микроскопов с открытым исходным кодом. Поскольку управляющее программное обеспечение NINscope не зависит от платформы, его можно использовать во всех основных операционных системах и с использованием различных конфигураций оборудования, включая ноутбуки, доступные большинству пользователей.

При создании прототипа NINscope пришлось сделать несколько дизайнерских решений. Мы напечатали корпус микроскопа на 3D-принтере, чтобы конструкция оставалась легкой, но отказались от использования электросмачивающей линзы, которая сделала бы фокусировку практичной, но минископ слишком тяжелый и громоздкий для записи на двух площадках. Включение драйвера светодиода высокого разрешения для оптогенетической стимуляции вместе с использованием имплантируемого светодиодного зонда обеспечило возможность напрямую управлять проекциями в месте их происхождения, а не на концах в поле зрения визуализации, что является особенностью, которая ранее не был интегрирован в минископ.

Учитывая, что наши планы строительства имеют открытый исходный код, основные функциональные возможности нашего объема могут быть расширены в зависимости от конкретных исследовательских вопросов, которые необходимо решить, которые в конечном итоге определяют ограничения по размеру, весу и функциональности. Возможность перепрофилировать блок сбора данных UCLA Miniscope (v3.2) для использования с NINscope подчеркивает преимущества совместного использования ресурсов, и мы надеемся, что наш вклад будет способствовать дальнейшему развитию минископов.

Церебелло-церебральные взаимодействия

Насколько нам известно, мы представляем первые одновременные записи разрешения клеток мозжечка и коры головного мозга у мышей без ограничений.Мы показываем, что синхронные паттерны активности мозжечка и коры головного мозга являются общими для различных поведенческих состояний и в значительной степени связаны с ускорением движений. Возможность записи с двух участков (например, мозжечка и коры головного мозга или мозжечка и рострального полосатого тела) у свободно ведущих животных открывает новые возможности для исследований церебелло-церебральных и церебелло-полосатых взаимодействий во время выражения врожденного и усвоенного поведения и может помочь для решения нерешенных вопросов относительно роли корковых и подкорковых структур в планировании, обучении и выполнении умелых движений (Gao et al., 2018; Guo et al., 2015; Kawai et al., 2015; Sauerbrei et al., 2018). Изменения в совместном участии клеток во время процедурного обучения (Galiñanes et al., 2018; Guo et al., 2015) можно количественно оценить одновременно в корковых и подкорковых структурах, чтобы определить, усилены или подавлены клеточные ответы (Костадинов и др., 2019). Хотя мы не обнаружили последовательной пространственной кластеризации активности в мозжечке и коре, когда нейроны в обеих областях проявляли совместную активность, более тщательное разбиение поведения в большей выборке может показать, что такая кластеризация действительно имеет место.В соответствии с выводами о тесно скоординированной активности коры и подкорковых структур, недавняя работа выделила моторную кору как динамическую систему, управляемую вводом (Sauerbrei et al., 2018), где таламический ввод является предпосылкой для управления движениями, когда они происходят. Выход мозжечка необходим не только для обеспечения точности текущих движений (Becker and Person, 2019), но и для их планирования в задачах сенсорной дискриминации (Chabrol et al., 2019; Gao et al., 2018). Таким образом, несмотря на избыточность моторных систем, наблюдаемую при поражении отдельных участков и оценке двигательной активности после периода восстановления, для успешного двигательного планирования и выполнения в естественных условиях требуются как корковые, так и подкорковые области.Используя NINscope, мы провели грубую оценку функциональной связи между мозжечком и корой головного мозга путем оптогенетической стимуляции клеток Пуркинье с двух сторон и медиально над мозжечком. Такие стимулы вызывали рефлексивные движения с задержками, аналогичными тем, о которых мы сообщали ранее, и соответствуют времени отскока в ядрах мозжечка после смещения стимула (Witter et al., 2013). Здесь мы обнаружили, что место стимуляции мозжечка определяет направление движения, как показывают данные нашего акселерометра.Эта направленность движения совпадает с известной анатомией мозжечка, где каждое полушарие мозжечка контролирует ипсилатеральную сторону тела. Мы также обнаружили, что около половины нейронов из сеансов корковой визуализации в значительной степени реагировали на сильную синхронную активацию мозжечка с началом, которое было отложено по сравнению с началом стимула. Таким образом, эти ответы, кажется, сигнализируют о возникновении движения, а не о том, что они могут быть связаны с их выполнением.

Кодирование действий и ответы, управляемые входом в спинном полосатом теле

Датчик PYTHON480 CMOS, встроенный в NINscope, позволил регистрировать сигналы от дорсального полосатого тела (DS) с хорошим соотношением сигнал-шум при мощности нескольких сотен мкВт до подтверждения линзой GRIN. применимость нашего минископа к изображениям структур глубокого мозга.Анализируя данные, собранные как с помощью видеокамеры, так и с помощью встроенного акселерометра, мы обнаружили, что большая часть зарегистрированных нейронов в правой DS реагировала исключительно во время поворота мышей влево (контралатерально), подтверждая предыдущие выводы, которые идентифицировали полосатое тело как структура, представляющая пространство действия (Barbera et al., 2016; Cui et al., 2013; Klaus et al., 2017; Tecuapetla et al., 2014). Хотя наши результаты в целом согласуются с предыдущей работой, мы не нашли доказательств пространственной кластеризации реагирующих нейронов, когда мыши делали контралатеральные повороты.

DS получает плотный вход от ипсилатеральной орбитофронтальной (OFC) и вторичной моторной (M2) коры. Эксперименты по физиологии срезов с использованием сопоставимых нейроанатомических координат, как в этом исследовании, предположили, что синаптические входы от OFC к нейронам DS имеют более сильное влияние на возбудимость нейронов со средними шипами, чем входы M2 (Corbit et al., 2019). Используя NINscope в сочетании с оптогенетической стимуляцией OFC или M2 в месте их происхождения, мы теперь подтверждаем это открытие in vivo, показывая, что также в интактной цепи больше DS нейронов реагируют на OFC, чем на стимуляцию M2.Оба входа модулировали активность в нейронах DS у бодрствующих мышей, но доля ответных нейронов была больше для стимуляции проекции OFC. Здесь мы не устраняли неоднозначность типов нейронов, которые были положительно или отрицательно модулированы. Повышение активности в нейронах DS потенциально вызывается прямым возбуждением непосредственно на шиповатые нейроны среднего стриатума (Hintiryan et al., 2016), тогда как прямое воздействие на интернейроны с быстрым выбросом импульсов (Mallet et al., 2005) может лежать в основе снижения ответов в нейронах DS во время наша стимуляция.Независимо от знака модуляции, мы обнаружили ответы, которые масштабировались с продолжительностью стимула, тем самым доказывая эффективность как стимуляции, так и визуализации.

В заключение, NINscope — это универсальный мини-микроскоп с открытым исходным кодом, который может занять нишу пользователей, которым нужны двухрегиональные записи у необузданных животных, совместимость с ОС, оптогенетические манипуляции с областями на расстоянии от места изображения, анализ поведения с помощью акселерометра, или комбинация всего вышеперечисленного.

Материалы и методы

Конструкция печатной платы

NINscope использует две печатные платы (PCB): датчик изображения CMOS и интерфейсную плату 10 на 10 мм каждая (толщина 0,6 мм, стандарт HDI), разработанные с использованием открытого исходного кода и кроссплатформенный пакет автоматизации проектирования электроники KiCad (http://kicad-pcb.org). Интерфейсная плата включает сериализатор DS90UR913A (Cypress Semiconductor) для подключения через FPD-link III к плате DAQ. Печатная плата интерфейса помещается наверху печатной платы датчика, и две печатные платы соединяются проводами, припаянными к зубчатым отверстиям на краях печатной платы.Печатная плата датчика содержит регуляторы напряжения, контроллер последовательности мощности и генератор, необходимые для инициализации и работы датчика изображения. Стабилизаторы напряжения представляют собой стабилизаторы LDO со сверхмалым шумом (NCP163, On Semiconductor) и предназначены для использования в камерах. Датчик изображения нуждается в 3 источниках питания, которые предоставляются в последовательности, которую мы достигаем с помощью секвенсора мощности LM3880 (Texas Instruments). Генератор тактовой частоты CMOS с низким энергопотреблением 66,6667 МГц (Kyocera Electronics) используется для работы датчика изображения.В дополнение к сериализатору интерфейсная плата имеет датчик IMU (LSM6DSLTR, STMicroelectronics), 2 драйвера светодиодов (один светодиод для оптогенетических стимулов: LM36011; двойной светодиод для 1 светодиода возбуждения флуоресценции: LM3643, Texas Instruments) и I2C I / O расширитель (FXL6408UMX, ON Semiconductor). Расширитель ввода / вывода управляет сигналами, не критичными по времени для датчика изображения и светодиода отслеживания / индикатора на верхней части интерфейсной платы. Драйвер светодиода и акселерометр более подробно описаны ниже.

Датчик изображения CMOS

Печатная плата датчика включает датчик изображения CMOS SVGA PYTHON480 (ON Semiconductor).CMOS-датчик изображения PYTHON480 отличается гибкостью и имеет множество возможных конфигураций. Задача заключалась в том, чтобы настроить его в соответствии с нашими требованиями. Как только мы выяснили, как запустить датчик в CMOS вместо режима LVDS, мы смогли предоставить сигналы данных в общий программируемый интерфейс (GPIF) контроллера Cypress USB для передачи данных изображения. Чтобы оптимизировать энергопотребление и ограничить перегрев, мы решили отключить фазовую синхронизацию (PLL), чтобы снизить потребление тока на 30%. Без ФАПЧ выходной сигнал параллельной синхронизации КМОП в 4 раза меньше, что ограничивает количество данных пикселей, которые могут быть считаны при заданной частоте кадров.Мы установили скорость сбора данных в текущем NINscope на 30 кадров в секунду и размер кадра на 752 x 480 пикселей, чтобы обеспечить считывание как данных пикселей, так и трех каналов акселерометра из IMU. Улучшенное рассеивание тепла в будущих итерациях NINscope сделает доступными данные с более высокой частотой кадров до 120 Гц и позволит дополнительно считывать данные гироскопа с нашего IMU.

Аппаратное обеспечение сбора данных

Проект UCLA Miniscope имеет крупнейшее сообщество разработчиков мини-микроскопов с открытым исходным кодом с пользовательской базой из сотен пользователей.Мы использовали существующее оборудование для сбора данных (DAQ версии 3.2) из ​​проекта UCLA Miniscope (http://www.miniscope.org) и внесли небольшие модификации, состоящие из 8-битного I2C EEPROM 256 КБ (STMicroelectronics) для хранения более крупная прошивка и соединения на плате DAQ между сигналами GPIO2 и TP4 и SPI с GPO0-GPO3. Датчик PYTHON480 CMOS подключается через FPD-Link III и коаксиальный кабель к USB-контроллеру Cypress на плате DAQ. Датчик изображения имеет SPI вместо интерфейса I2C для настройки датчика.Выходы общего назначения (GPO) используются, поскольку канал FPD в UCLA DAQ поддерживает I2C, а не шину SPI. Для этого требуется маршрутизация сигналов от MOSI, SCK и SS к GPO0, GPO1 и GPO3, что позволяет полностью управлять датчиком изображения из прошивки USB-контроллера. Поскольку наша прошивка больше, чем существующая EEPROM на плате UCLA DAQ, мы обновили EEPROM до 256 КБ. Прошивка NINscope основана на примере прошивки, взятой из заметки по применению Cypress AN75779 (дата модификации: 30.10.2017).Датчик изображения CMOS, который зарегистрирован как устройство формирования изображений USB, расширяется до функции составного устройства USB, что позволяет добавить виртуальный последовательный порт. Виртуальный последовательный порт используется для связи и настройки CMOS-сенсора и драйверов светодиодов (например, для настройки усиления датчика изображения, яркости, уровней черного, настроек светодиодов, параметров оптогенетических стимулов), а также для регистрации данных акселерометра.

Маломощный (0,65 мА в высокопроизводительном режиме) 3D-акселерометр и гироскоп, инерционный модуль iNemo (LSM6DSLTR, STMicroelectronics), набор драйверов светодиодов (один светодиод для оптогенетических стимулов: LM36011; двойной светодиод для одного светодиода возбуждения флуоресценции: LM3643 , Texas Instruments) и расширитель ввода / вывода (FXL6408, ON Semiconductor) управляются по шине I2C.Оставшийся GPO используется для управления генерацией импульсов и точной синхронизации оптогенетических стимулов путем добавления проводного соединения между GPO2 и TP4 в UCLA DAQ (, рис. 1E, ).

Акселерометр IMU имеет диапазон +/- 2 g, где каждый бит соответствует 0,061 мг. Устанавливается частота дискретизации 104 Гц, при которой буфер FIFO заполняется данными x, y, z, которые считываются в конце каждого кадра изображения и передаются через виртуальное последовательное соединение с компьютером.

Драйверы светодиодов и светодиоды

Драйвер вспышки с одним светодиодом (LM36011, Texas Instruments) и драйвер с двумя светодиодами (LM3643, Texas Instruments) использовались для управления генерацией оптогенетических импульсов в светодиодном датчике 470 нм (LED 150040BS73240). , Размер корпуса 402, Wurth Electronics) или светодиодный зонд 630 нм (APHHS1005SURCK, Kingbright) и светодиод возбуждения флуоресценции 470 нм (Excitation LED LXML-PB02 470 нм, Lumileds).Оптогенетический светодиод можно регулировать с шагом 11,725 ​​мА, а светодиод возбуждения — с шагом 1,4 мА. Максимальный ток любого светодиода зависит от общего тока, потребляемого камерой, и типа / длины используемого кабеля. Светодиод с длиной волны 621 нм (SML-P11UTT86R, Rohm) был интегрирован в верхнюю часть интерфейсной платы для отслеживания положения животных с помощью камеры и для уведомления о подключении мини-микроскопа.

Корпус NINscope

Прототипы корпуса NINscope были разработаны с использованием Inventor (AutoDesk), причем начальные прототипы были напечатаны на принтере Micro Plus Advantage (EnvisionTec) с использованием смолы RCP30 M для печати мельчайших деталей.Самая тонкая функциональная стенка окончательного прототипа имела толщину 500 мкм. Принтер Form 2 (Formlabs) впоследствии был использован в корпусе микроскопа для печати черной смолой (RS-F2-GPBK-04). Микроскоп состоит из трех частей: верхней части для размещения печатных плат, плоско-выпуклой линзы и фильтра излучения, нижней части для размещения оптики, включая светодиодный кристалл, полушаровую линзу, фильтр возбуждения и дихроичное зеркало, а также скользящую крышку для фиксации. светодиода и защиты оптических фильтров. Нижняя часть микроскопа имеет небольшой выступ, который фиксируется в выемке на специальной металлической опорной пластине (, дополнительный рисунок 1, ) и фиксируется установочным винтом, чтобы минимизировать перемещение микроскопа.После печати и очистки корпуса изопропиловым спиртом и опрыскивания песком, внутренний и внешний корпус, напечатанный на принтере EnvisionTec, был обработан аэрографом (Infinity CR Plus, Harder & Steenbeck, Германия) тонким слоем черной краски (h22 Flat Black, Гунзе, Япония).

Оптика

Мы использовали настраиваемое возбуждение (ET470 / 40x 3,5 × 3,5 × 0,5 мм, цветность), дихроичное (T495lpxr 3,5 x 5 x 0,5 мм, цветность) и фильтры излучения (ET525 / 50 м, 4 × 4 × 1 мм. , Chroma), полушаровую линзу N-BK7 (диаметр 3 мм, 47-269, Edmund Optics) и плосковыпуклую линзу (4.0 мм, фокусное расстояние 10,0 мм, 45-429, Edmund Optics) для фокусировки на датчике изображения CMOS. Эмиссионный фильтр был прикреплен к этой линзе с помощью оптического клея (NOA81, Norland Products). Линза GRIN (NA 0,55, 64-519, Edmund Optics) была имплантирована для поверхностной визуализации или приклеена к опорной пластине для глубокой визуализации мозга, а минископ был установлен на опорной пластине, которая была прикреплена к черепу.

Кабельная разводка NINscope

Для подключения прицела NIN к блоку DAQ к минископу на одном конце был прикреплен тонкий (0,101 мм) коаксиальный провод (38awg A9438W-10-nd, Alpha Wire) длиной 50 см. комплект разъемов (разъемы ED

-ND и ED8250-ND, Digi-Key) на более толстый (1.17 мм FEP мм) коаксиальный провод (VMTX Mini, Pro Power) длиной 2 м на другом конце. 2-метровый провод был припаян к коаксиальному кабелю 150 мм RG174 с прямым штекером SMA (2096227, LPRS), который можно было напрямую подключить к плате DAQ. Драйвер возбуждающего светодиода был подключен к светодиоду с помощью ультратонкого провода длиной 22 мм (UT3607, Habia). Провод того же типа длиной 25 мм подключали к драйверу светодиода оптогенетического стимула на интерфейсной плате. На одном конце был прикреплен разъем (851-43-050-10-001000, Mill-Max ED

-ND, Digi-Key) для подключения к оптогенетическому датчику.

Программное обеспечение для сбора данных NINscope

Программное обеспечение для сбора данных было написано на кроссплатформенном языке обработки (https://processing.org/). Программное обеспечение поддерживает сбор данных с двух мини-микроскопов и одной веб-камеры USB. NINscope управляется через последовательный порт связи с помощью последовательной библиотеки Processing, которая поддерживает настраиваемые микроконтроллеры.

Модуль захвата в видеотеке для Processing версии 2.0 был изменен путем изменения YUV на необработанный формат, чтобы использовать преимущества полной 8-битной шкалы.Чтобы различать камеры и NIN-прицелы одного типа, к строковому списку всех подключенных устройств добавляется префикс.

G4P, библиотека обработки (http://www.lagers.org.uk/g4p/) использовалась для создания пользовательского интерфейса программного обеспечения, предоставляя доступ к наиболее распространенным элементам управления для изменения настроек микроскопа и обновления параметров, таких как интенсивность света , усиление, уровень черного, продолжительность оптогенетического стимула или запись G-сенсора.

В скетче «Обработка» функция события захвата передает каждое захваченное изображение в кольцевой буфер для быстрой обработки изображения и во избежание длительного доступа к жесткому диску (HD), что может вызвать пропадание кадров.Поток используется для сохранения всех изображений из кольцевого буфера в HD. Размер кольцевого буфера можно изменить в скетче, но он установлен на 60. Последние 4 пикселя кадра зарезервированы для счетчика кадров для отслеживания пропущенных кадров. Каждый кадр сохраняется как изображение TIFF в оттенках серого с минимально возможным заголовком для уменьшения размера файла.

Печатные платы и механические конструкции, микропрограммное обеспечение и программное обеспечение для сбора данных можно найти на GitHub по адресу: https://github.com/ninscope

Мыши

Мы использовали мышей C57 / B6 мужского и женского пола (диапазон веса: 22-28 грамм). ).В экспериментах, в которых клетки Пуркинье стимулировали оптогенетически, мы использовали двух трансгенных мышей от помеси Pcp2-Cre Jdhu (JAX # 010536) и линии мышей Ai32 (JAX # 012569) на фоне C57 / B6. Все проведенные эксперименты были лицензированы голландским компетентным органом и одобрены местным органом по защите животных в соответствии с европейскими руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных Директивы 2010/63 / EU.

Имплантаты линз объектива GRIN и инъекции вируса

Перед операцией мышей анестезировали 3% изофлураном перед переводом в стереотаксический аппарат, после чего анестезию поддерживали на уровне 1.5% изофлуран (скорость потока: 0,3 мл / мин O 2 ). Для визуализации коры головного мозга и мозжечка на поверхность мозга имплантировали линзу объектива GRIN (диаметр 1,8 мм, шаг 0,25, 64-519, Edmund Optics). На коже делали небольшой разрез после удаления волос после бритья и дезинфекции кожи раствором йода (5%) и спиртом (70%). Затем на обнаженный череп наносили лидокаин (100 мг / мл, Astra Zeneca, Великобритания) и удаляли надкостницу. Были определены центральные координаты для размещения линзы GRIN, и небольшая чернильная точка была размещена в правильном месте относительно брегмы (симплексная долька мозжечка, AP: -5.8 мм ML: 2,2 мм; долька VI, AP: -7,4 мм, ML: 0,0 мм; кора головного мозга, AP: 1,4 мм, ML: 1,5 мм). Координаты были масштабированы относительно среднего расстояния брегма-лямбда (4,21 мм), как указано в атласе мозга мышей Paxinos. Перед сверлением кости мышам вводили i.p. Инъекции 15% D-маннита в физиологическом растворе (0,55 мл / 25 г) для облегчения диффузии вирусных частиц после инъекции вируса. Затем была просверлена круглая трепанация черепа диаметром 2 мм с центром вокруг отмеченного места. В промежутках между сверлением череп увлажняли стерильным физиологическим раствором.Затем лоскут черепа и твердую мозговую оболочку удаляли и вирус (Cerebellum: AAV1.CAG.FLEX.GCaMP6f / AAV1.CMV.PI.Cre.rBG) смешивали 1: 1 и разводили в физиологическом растворе 1: 3; Cortex: AAV1.Syn.GCaMP6f. WPRE.SV40, разведенный в физиологическом растворе 1: 3, UPenn Vector Core) вводили в четыре точки. В каждое место вводили 25 нл вируса один раз на 350, дважды на 300 и один раз на глубину 250 мкм со скоростью 25 нл / мин. Трепанацию черепа покрывали гелевой пеной (Pfizer, США), пропитанной стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl, B. Braun Medical Inc., США). Линзу GRIN опускали с помощью вакуумного держателя, помещенного в стереотаксический аппарат, до тех пор, пока поверхность линзы не коснулась мозга, а затем опускали еще на 50 мкм.Края краниотомии запломбировали Kwik-Sil (WPI, США). Затем вокруг линзы был нанесен стоматологический цемент (Super-Bond C&B, Sun Medical, Япония), чтобы закрепить ее на месте. Kwik-Cast (WPI, США) использовался для прикрытия и защиты линзы. По окончании операции животным сделали подкожную инъекцию. инъекция Метакама 5 мг / кг.

Для доступа к глубокому мозговому отделу спинного стриатума были имплантированы ретрансляционные линзы GRIN диаметром 0,6 мм (длина: 7,3 мм, числовая апертура: 0,45, Inscopix, CA) (AP: 0,2, ML: 1.5, DV: −3,1). Чтобы облегчить имплантацию и уменьшить повреждение ткани над спинным полосатым телом, с помощью иглы 25G был создан след. Используя моторизованный стереотаксический рычаг, иглу медленно опускали в течение 10 минут, оставляли на месте на 10 минут, а затем отводили с той же скоростью с постоянной скоростью 0,31 мм / мин. Вирус вводили путем опускания шприца Гамильтона в течение 4 минут для введения 500 нл AAVdj.hSyn.GCaMP6s или AAV1.hSyn.GCaMP6f в дорсальное полосатое тело со скоростью 100 нл / мин, после чего шприц оставался на месте. для увеличения диффузии вируса (5 мин), а затем ретракции (5 мин).Впоследствии ретрансляционная линза GRIN была опущена (0,10 мм / мин) в дорсальное полосатое тело (DV: -3,1). Зазор между ретрансляционной линзой GRIN и черепом был покрыт цианакрилатным клеем, и линза была прикреплена к черепу с помощью стоматологического цемента. Линза реле GRIN была закрыта и защищена с помощью Kwik-Cast (World Precision Instruments, США). Линза объектива GRIN 1,8 мм (64-519, Edmund Optics, Великобритания) была прикреплена к опорной плите минископа с помощью цианоакрилатного клея, а затем минископ был установлен на опорной плите.Голову мышей ограничивали с помощью изготовленного на заказ бегового ремня, чтобы обеспечить активное передвижение, затем опускали прицел с опорной пластиной и установленной линзой GRIN над линзой реле GRIN до тех пор, пока клетки в поле зрения не стали видны, опорная пластина была прикреплена к черепу. с зубным цементом (покрытым черным лаком для ногтей) и снятым минископом.

Светодиодные имплантаты над орбитофронтальной и вторичной моторной корой

В экспериментах визуализация дорсального полосатого тела, AAV5.hSyn.ChrimsonR.tdTomato вводили либо в орбитофронтальную кору (AP: 2,8, ML: 1, DV: -2,2), либо во вторичную моторную кору (AP: 2,3, ML: 0,7 DV: -1,2). Светодиодный зонд, покрытый биосовместимой эпоксидной смолой, предназначенный для подключения к NINscope с красным светодиодом (645 нм, KingBright Inc., США), был помещен на поверхность мозга, и светодиод был прикреплен к черепу с помощью стоматологического цемента.

Светодиодные имплантаты над мозжечком

Для стимуляции мозжечка была просверлена небольшая трепанация черепа 1 мм над интересующей областью мозжечка (симплексная долька, AP: -5.8 мм, ML: 2,2 мм; Долька VI, AP: -7,4 мм, ML: 0,0 мм; Crus II, AP: −7,3 мм, ML: + и −2,7 мм;) в соответствии с стерильными процедурами, аналогичными описанным для имплантата линзы объектива GRIN. Светодиод, покрытый слоем биосовместимой эпоксидной смолы, был вставлен с правильной ориентацией в краниотомию, которую затем запечатали слоем Kwik-Sil (WPI, США), а затем слоем Kwik-Cast. Оставшаяся проволока зонда и соединитель зонда впоследствии были прикреплены к черепу стоматологическим цементом (Super-Bond C&B, Sun Medical, Япония).

Imaging

Записи мозжечка и коры головного мозга были выполнены в домашней клетке для мышей, а записи, полученные из спинного полосатого тела, — в специально подобранной арене открытого поля (30 на 30 на 45 см). Минископы были прикреплены либо после кратковременной анестезии (индукция изофлурана 3%, время восстановления после анестезии 30 мин.), Чтобы обеспечить подключение оптогенетического разъема драйвера светодиода к светодиодному датчику, установку одного или двух прицелов и регулировку фокуса, либо — когда использование модифицированной опорной плиты или нестандартной планки для головы — в состоянии с фиксированной головой, когда животные могут бегать по беговой дорожке.

Гистология

Мышам транскардиально перфузировали 4% PFA в 1x PBS (10 мМ PO4 3-, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl). После фиксации мозг извлекали и оставляли на ночь на 10% сахарозе в PBS, после чего их помещали в желатин и оставляли на ночь в 30% сахарозе в PBS. Срезы мозга (50 мкм) вырезали в криостате (LEICA CM3050 S), окрашивали DAPI и затем устанавливали (Dako Fluorescence Mounting Medium, S3023). Конфокальные изображения были получены на конфокальном микроскопе SP8 (Leica, Германия), а изображения всего мозга были получены путем сшивания нескольких (1024 × 1024 пикселей) полученных изображений в окончательное изображение.

Анализ изображений с кальцием

Временные метки для всех осциллографов были записаны на диск, и в случае записи с двойным осциллографом кадры фильмов были выровнены до коррекции движения с помощью NoRMCorre (Pnevmatikakis and Giovannucci, 2017) и извлечения сигнала с помощью CNMF-E ( Чжоу и др., 2018). В экспериментах по стимуляции мозжечка нейроны коры головного мозга классифицировались как отвечающие, если сигнал после стимула превышал среднее значение до стимула + 2 σ . Время начала этих кальциевых переходных процессов определяли путем подбора сигмовидной функции к переходным процессам, и время начала было установлено так, чтобы подобранная функция превышала среднее значение + σ от исходного уровня до стимула.В экспериментах на спинном полосатом теле нейроны классифицировались как отвечающие, если сигнал во время периода стимуляции значительно отличался от исходного сигнала до стимула. Для каждой клетки активность до стимула и во время стимуляции была усреднена в каждом испытании и статистически проверена с использованием парных t-критериев. Фиджи (Schindelin et al., 2012) использовался для проверки исходных данных и для создания фильмов. Анализы проводились в Matlab (Mathworks, Nantucket), Python 3.7 (van Rossum, 1995) и R (R Core Team, 2019).

Внутрирегиональное и межрегиональное обнаружение синхронного шаблона (SP)

Переходные процессы, связанные с кальцием, были выведены с использованием алгоритма конечной скорости инноваций для быстрого и точного обнаружения всплесков (Oñativia et al., 2013), установив τ = 1 для получения время начала переходных процессов кальция при разрешении субкадра по скорости записи переходных процессов кальция на клетку. Эти времена начала были затем свернуты с ядром Епанечникова (крутизна = 0,1) и просуммированы по всем ячейкам, в результате чего была получена сумма ядра.Все временные интервалы, для которых сумма ядра была на два стандартных отклонения выше среднего, считались значимыми глобальными синхронными событиями. Если время начала действия двух ячеек приходилось на одно и то же синхронное событие, считалось, что эти ячейки сработали синхронно один раз. Для всех пар ячеек мы подсчитали, сколько раз эти ячейки срабатывали в рамках одного синхронного события. Впоследствии мы отобрали все синхронные пары, которые сработали вместе как минимум пять раз. Эти пары хранились в графе, где каждый узел представляет ячейку, а каждое ребро — количество общих синхронных событий срабатывания.Эти графики были преобразованы в дуговую диаграмму с помощью пакета arcdiagram (Gaston Sanchez, https://github.com/gastonstat/arcdiagram) в R. Клетки были сгруппированы по областям мозга (мозжечок, кора) и отсортированы внутри группы по степени графа. , то есть количество ячеек, которым они соотносятся. Степень корреляции представлена ​​радиусом узла.

Анализ поведенческого ускорения

Чтобы определить, превышают ли сигналы акселерометра порог среднего значения + 2σ до или после SP, мы сначала определили, где возник наибольший средний сигнал.Затем мы сделали выбор для сигналов до или после SP, которые поднялись выше порогового значения. Для остальных сигналов мы искали 300 мс вокруг SP (-150, +150 мс) на предмет превышения порогового значения.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *