2561A чем заменить. Аналоги и замены для оптопары PS2561-1-A: полный обзор альтернатив

Ближайший аналог

Ближайший аналог

Александр Жуков: у сборной России нет равноценной замены Джикии

https://euro2020. ria.ru/20201010/zhukov-1579175605.html

Александр Жуков: у сборной России нет равноценной замены Джикии

Александр Жуков: у сборной России нет равноценной замены Джикии — РИА Новости, 10.10.2020

Александр Жуков: у сборной России нет равноценной замены Джикии

Защитник Георгий Джикия, пропустивший товарищеский матч с командой Швеции, является незаменимым игроком сборной России по футболу, равноценной замены ему нет,… РИА Новости, 10.10.2020

2020-10-10T14:29

2020-10-10T14:29

2020-10-10T14:29

евро-2020

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/156102/88/1561028814_0:0:2561:1440_1920x0_80_0_0_51f70373ee978f0a1b2177dbfb28ee73.jpg

ЕВРО-2020, Олег Богатов. Защитник Георгий Джикия, пропустивший товарищеский матч с командой Швеции, является незаменимым игроком сборной России по футболу, равноценной замены ему нет, заявил РИА Новости почетный президент Олимпийского комитета России (ОКР) Александр Жуков.Сборная России в четверг проиграла в Москве команде Швеции со счетом 1:2 в контрольной встрече. Россияне 11 октября проведут матч группового этапа Лиги наций с турками, а 14 октября — с венграми. Джикия в среду был изолирован от команды из-за сомнительного результата теста на коронавирус.»А во втором тайме игра команды все же смотрелась похуже, — продолжил собеседник агентства. — Но я думаю, что Черчесов проверял игроков: кто в какой форме находится и как оптимально подойти к матчу со сборной Турции с точки зрения формирования основного состава. Но понятно, что Георгию Джикии на сегодняшний день нет равноценной замены. Нет у нас, к сожалению, второго такого же надежного игрока. А в целом мы все же играли неплохо. И, кстати, Антон Миранчук смотрелся хорошо, мне понравилась его игра. И Александр Соболев тоже молодец — вышел и забил мяч».

https://euro2020.ria.ru/20201009/dzhikiya-1578977009.html

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2020

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://euro2020.ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

евро-2020

ЕВРО-2020, Олег Богатов. Защитник Георгий Джикия, пропустивший товарищеский матч с командой Швеции, является незаменимым игроком сборной России по футболу, равноценной замены ему нет, заявил РИА Новости почетный президент Олимпийского комитета России (ОКР) Александр Жуков.

Сборная России в четверг проиграла в Москве команде Швеции со счетом 1:2 в контрольной встрече. Россияне 11 октября проведут матч группового этапа Лиги наций с турками, а 14 октября — с венграми. Джикия в среду был изолирован от команды из-за сомнительного результата теста на коронавирус.

«Я думаю, что матч с командой Швеции Станислав Черчесов рассматривал, прежде всего, как некую проверку возможностей тех футболистов, которые есть у него в обойме — и основного состава, и резервного, — сказал Жуков по телефону. — Первый тайм в целом оставил приятное впечатление, у нас все же было большое преимущество. И забитый шведами гол, безусловно, не вытекал из хода игры. Один удар — и один гол. Наши футболисты неплохо прессинговали, комбинировали, создавали моменты, но не могли их реализовать».

«А во втором тайме игра команды все же смотрелась похуже, — продолжил собеседник агентства. — Но я думаю, что Черчесов проверял игроков: кто в какой форме находится и как оптимально подойти к матчу со сборной Турции с точки зрения формирования основного состава. Но понятно, что Георгию Джикии на сегодняшний день нет равноценной замены. Нет у нас, к сожалению, второго такого же надежного игрока. А в целом мы все же играли неплохо. И, кстати, Антон Миранчук смотрелся хорошо, мне понравилась его игра. И Александр Соболев тоже молодец — вышел и забил мяч».

ИЗМЕНЕНИЯ,КОТОРЫЕ ВНОСЯТСЯ В АКТЫ ПРАВИТЕЛЬСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Утверждены

постановлением Правительства

Российской Федерации

от 11 ноября 2015 г. N 1219

1. Подпункт 5.4.14 Положения о Федеральной службе по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды, утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 23 июля 2004 г. N 372 «О Федеральной службе по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2004, N 31, ст. 3262; 2009, N 6, ст. 738; N 33, ст. 4081; N 38, ст. 4490), изложить в следующей редакции:

«5.4.14. утверждение перечня работ федерального назначения в области гидрометеорологии и смежных с ней областях, организацию и обеспечение проведения таких работ;».

2. В Положении о Федеральной службе по надзору в сфере природопользования, утвержденном постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июля 2004 г. N 400 «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере природопользования и внесении изменений в постановление Правительства Российской Федерации от 22 июля 2004 г. N 370» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2004, N 32, ст. 3347; 2008, N 16, ст. 1707; N 22, ст. 2581; 2009, N 49, ст. 5976; 2010, N 14, ст. 1656; N 42, ст. 5390; 2012, N 42, ст. 5718; 2013, N 24, ст. 2999; 2015, N 17, ст. 2561):

а) подпункт 5.2.2 дополнить словами «(за исключением государственного регулирования в области государственного экологического мониторинга уникальной экологической системы озера Байкал)»;

б) дополнить подпунктом 5.2.5 следующего содержания:

«5.2.5. оператора единой государственной информационной системы учета отходов от использования товаров;»;

в) подпункт 5.5(9) изложить в следующей редакции:

«5.5(9). утверждает нормативы образования отходов и лимиты на их размещение применительно к хозяйственной и (или) иной деятельности индивидуальных предпринимателей, юридических лиц (за исключением субъектов малого и среднего предпринимательства), в процессе которой образуются отходы на объектах, подлежащих федеральному государственному экологическому надзору, осуществляет прием отчетности об образовании, утилизации, обезвреживании, о размещении отходов, представляемой в уведомительном порядке субъектами малого и среднего предпринимательства, в процессе хозяйственной и (или) иной деятельности которых образуются отходы на объектах, подлежащих федеральному государственному экологическому надзору, а также устанавливает предельно допустимые выбросы и временно согласованные выбросы;»;

г) дополнить подпунктами 5.5(9-1) — 5.5(9-7) следующего содержания:

(см. текст в предыдущей редакции)

5.5(9-3). осуществляет подтверждение отнесения отходов I — V классов опасности к конкретному классу опасности;

5.5(9-4). осуществляет прием отчетности о выполнении нормативов утилизации отходов от использования товаров, представляемой производителями, импортерами товаров, подлежащих утилизации, за истекший календарный год;

5.5(9-5). осуществляет учет и контроль выполнения установленных нормативов утилизации в отношении отходов от использования товаров, произведенных на территории Российской Федерации или ввезенных в Российскую Федерацию;

5.5(9-6). осуществляет контроль за правильностью исчисления, полнотой и своевременностью уплаты экологического сбора;

3. В Положении о Федеральном агентстве лесного хозяйства, утвержденном постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2010 г. N 736 «О Федеральном агентстве лесного хозяйства» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2010, N 40, ст. 5068; 2011, N 41, ст. 5740; 2012, N 28, ст. 3905):

а) подпункт 5.4.2 изложить в следующей редакции:

«5.4.2. рассмотрение в установленном порядке ходатайств о переводе земель из одной категории в другую, ходатайств о переводе земельных участков из состава земель одной категории в другую, направление в Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации рассмотренных ходатайств с проектом акта о переводе земель или земельных участков в составе таких земель из одной категории в другую либо проектом акта об отказе в переводе земель или земельных участков в составе таких земель из одной категории в другую;»;

б) дополнить подпунктом 5.4.19(3) следующего содержания:

«5.4.19(3). контроль за правовым регулированием органами государственной власти субъектов Российской Федерации вопросов переданных полномочий Российской Федерации в области лесных отношений с правом отмены не носящих нормативного характера правовых актов органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации, осуществляющих переданные им полномочия, в части, регулирующей осуществление переданных им полномочий, по основаниям и в порядке, которые установлены Правительством Российской Федерации;».

4. В Правилах отмены правовых актов органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации, осуществляющих переданные полномочия Российской Федерации в области лесных отношений, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 29 июня 2011 г. N 524 «Об утверждении Правил отмены правовых актов органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации, осуществляющих переданные полномочия Российской Федерации в области лесных отношений» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2011, N 28, ст. 4217; 2012, N 46, ст. 6339):

а) в пункте 1 слова «правовых актов» заменить словами «правовых актов, не носящих нормативного характера,»;

б) пункт 2 изложить в следующей редакции:

«2. Контроль за правовым регулированием органами исполнительной власти субъектов Российской Федерации вопросов переданных полномочий Российской Федерации в области лесных отношений осуществляет Федеральное агентство лесного хозяйства в пределах своей компетенции.»;

в) в пункте 3 слова «Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации» заменить словами «Федеральное агентство лесного хозяйства»;

г) в пункте 4 слова «Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации» заменить словами «Федеральное агентство лесного хозяйства», слова «одна норма» заменить словами «одно положение»;

д) в пункте 5 слова «Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации» заменить словами «Федеральное агентство лесного хозяйства»;

е) пункт 6 изложить в следующей редакции:

«6. Федеральное агентство лесного хозяйства в течение 30 дней со дня поступления правового акта проводит его экспертизу в порядке, установленном Министерством природных ресурсов и экологии Российской Федерации.

По решению руководителя Федерального агентства лесного хозяйства срок проведения экспертизы правового акта может быть продлен, но не более чем на 30 дней.»;

ж) в абзаце первом пункта 7 и абзаце первом пункта 9 слова «Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации» в соответствующем падеже заменить словами «Федеральное агентство лесного хозяйства» в соответствующем падеже.

(см. текст в предыдущей редакции)

(см. текст в предыдущей редакции)

«5.2.20. порядок представления государственной отчетности пользователями недр, осуществляющими разведку месторождений и добычу полезных ископаемых, в федеральный фонд геологической информации и его территориальные фонды, а также в фонды геологической информации субъектов Российской Федерации, если пользование недрами осуществляется на участках недр местного значения;»;

«5.2.58. порядок подтверждения отнесения отходов I — V классов опасности к конкретному классу опасности;

5.2.59. порядок разработки и утверждения нормативов образования отходов и лимитов на их размещение применительно к хозяйственной и (или) иной деятельности индивидуальных предпринимателей, юридических лиц (за исключением субъектов малого и среднего предпринимательства), в процессе которой образуются отходы на объектах, подлежащих федеральному государственному экологическому надзору;

5.2.60. порядок представления и контроля отчетности об образовании, утилизации, обезвреживании, о размещении отходов (за исключением статистической отчетности) субъектами малого и среднего предпринимательства, в процессе хозяйственной и (или) иной деятельности которых образуются отходы на объектах, подлежащих федеральному государственному экологическому надзору;».

Умная «Квартира» / Хабр

Всем привет! Наконец-таки подошел к концу капитальный ремонт в квартире, и в связи с этим хочу поделиться с Вами, реализованным проектом «Умной квартиры» с базовыми возможностями управления освещением, подогревом теплых полов, контроля температуры и влажности помещений, и прочими плюшками. Описательная часть будет выполнена в виде мануала (так проще излагать что ли).

Оборудование

В виду того, что принципиально хотелось собрать всю автоматику на готовых, но бюджетных решениях исполнительных и управляющих устройств, принято единогласное решение (в одном лице), использовать вот такой перечень оборудования:

Сервер управления – Raspberry Pi 3 + OpenHAB 2 – 1шт (3000р.)
Контроллер многофункциональный – MegaD-2561 – 1шт (3480р.)
Исполнительный блок на 14 релейных выходов – MegaD-14-R – 1шт (4480р.)
Датчики температуры и влажности DHT22 (AM2303) – 4шт (1960р.)
Датчики температуры 1-Wire DS18B20 waterproof – 2шт (180р.)
Блок питания 12V DR-60-12 – 1шт (1420р.)
Корпуса для датчиков Dsen-Box – 4шт (1000р.)
Планшет для управления и отображения параметров – уже есть (3000-10000р.)
Большую часть из списка можно и на АЛИ приобрести.

Вводное

Одними из основных принципов работы систем автоматизации это – бесперебойность и резервирование функций. То есть даже если вся слаботочная автоматика сгорит к чертям, мы не должны потерять функцию управления освещением и прочими, важными, исполнительными устройствами. Таким образом решение управления освещением будет реализовано на, так называемой, «проходной системе» т.е. выключатели (переключатели) в помещениях будут проходными, а роли вторых выключателей (переключателей) будут играть релюшки в исполнительном блоке MegaD-14-R. При условии, конечно, что сами релюшки не выгорят, мы при неисправности блоков автоматики, не потеряем функционал. Поэтому во всех помещениях установлены проходные 2-х и 1-клавишные переключатели Legrand Etika (симпатично смотрятся по сравнению с Valenой).

Подключение

Датчики температуры и влажности DHT22 установлены в корпуса Dsen-Box на уровне около 2-х метров от пола в каждом помещении. Не забываем про то, что в квартире капитальный ремонт и все провода заботливо проложены от щитка до мест расположения датчиков и устройств.

Кабель практически везде закладывал SFTP 4х2х0,5 экранированный. Датчики температуры DS18B20 установлены в момент укладки теплых полов.

Устанавливаем приборы MegaD в щиток, сопрягаем их родным шлейфом 34pin и подключаем к сети Ethernet. Заходим в web интерфейс по адресу 192.168.0.14/sec. В разделе “config” устанавливаем нужный адрес или оставляем по умолчанию, обязательно прописываем адрес Openhab сервера (узнаем позже когда развернем образ Openhab на малинке или пропишем сразу, а на малинке изменим). Подключаем все датчики и провода от выключателей согласно однолинейке.

В настройках портов устройства MegaD устанавливаем типы (OUT – если это реле, IN или Dsen – если вход датчика). Если на портах подключенных датчиков указать правильный тип, то мы сразу же увидим актуальные показания.

Сервер

Собираем сервер. Корпус для малинки сделан из вышедшего из строя блока питания для удобного крепления на дин-рейку (есть конечно специальный корпус для этого, но это не про нас))). Не забываем естественно воткнуть флэшку и кабель Ethernet. Что бы не мучиться с установкой, решил скачать готовый образ

— весь процесс установки и конфигурирования сервера подробно там описан и сводится к развертыванию образа на флэшку, запуску малинки и ожидания 15-45мин. (да долго) при первом конфигурировании. OpenHab готов к работе!

Если мы не хотим менять что либо в конфигурации сервера (как открыть раздел настроек подробно описано на openhab.org) то подключаемся к Openhab openhabianpi:8080, выбираем графический интерфейс Paper UI и начинаем ваять все что нужно.

Настройка

Bindings

Прежде нужно установить связь сервера OH (openhab) и MegaD. Интеграция оборудования на сервере, используя определенные оборудованием протоколы и правила, производится с помощью готовых файлов, так называемых «Биндингов». Скачиваем актуальный биндинг для оборудования

. Закидываем его (можно используя WinSCP) в папку /srv/openhab2-addons на сервере, таким образом мы этот биндинг увидим в “Bindings” Paper UI.

Далее в “Inbox” создаем Bridge MegaD Incoming server adapter это что-то вроде виртуального моста связи между сервером и оборудованием. Прописываем ему нужный порт (адрес сервера и порт нужно прописать в “Config” самого устройства MegaD).

Things

После создания моста мы, также в разделе “Inbox”, создаем “MegaD Binding Things”. Отдельно взятый «Thing» — так определяется на сервере конкретное физическое устройство, будь то датчик или реле, с которым мы будем взаимодействовать при помощи созданного моста. В них мы конкретно прописываем ip адрес MegaD устройства, пароль для доступа и порт устройства (это тот порт входа куда подключен датчик или порт выхода для управления устройствами).

Для удобного распределения по местам нахождения, в поле “Location” указываем где что находится – зал, кухня… После создания этих “Things” они появятся в “Configuration/Things”. Заходим в созданный “Thing” и нажатием на нужный тип (мы должны были его указать в настройках порта устройства MegaD) привязываем его к “Item” создавая новый “Create new Item”.

Items

Отдельно взятый «Item» — на сервере и в графическом интерфейсе, это тот самый элемент который выполняет роль кнопки управления или вывода данных с датчика и прочих возможностей.

Поле “Name” должно быть непрерывной латиницей, а вот “Label” называем как хотим. В настройках “Item” нужно указать тип (если это реле, то – SWITCH, если датчик, то – NUMBER и т.д.

Если мы хотим объединить определенные Item-ы в группы (это по большей части нужно для удобного распределения и просмотра в мобильном приложении или используя интерфейс Basic UI), то в поле “Group” указываем нужную группу, которую предварительно нужно создать в разделе “Items” указав тип “Group”. После этих манипуляций мы увидим тот самый созданный “Item” в разделе “Control” Paper UI и если все правильно сделали, то при нажатии на созданный “Item” типа “Switch”, связанное устройство (релюшка MegaD) щелкнет.

Аналогичные действия производим для всех выключателей и датчиков, правильно называя их и настраивая.

UI

Теперь все это конечно хорошо и работает, но не красиво и неудобно.

Берем планшет заходим через браузер openhabianpi:8080, выбираем графический интерфейс Habpanel и начинаем настраивать под свои нужды.

Нажимаем в правом верхнем углу на шестеренку настроек, кликаем на “Advanced settings” и производим необходимые настройки (тема, название…) на левой стороне настроек, позже после создания готового интерфейса, нужно сохранить его “Save the current configuration to a new panel configuration”.

Возвращаемся из настроек обратно, ползунком выбираем необходимое количество столбцов плиток в интерфейсе и нажимаем “Add a new dashboard”. В настройках плитки указываем цветовую гамму и иконки отображения. Данными плитками мы будем определять локацию или группы наших устройств (например в моем случае это комнаты).

Далее после создания локации переходим в нее нажатием на плитку и сверху, рядом с названием плитки нажимаем на карандаш, будем располагать плитки созданных в системе “Items”. В правом верхнем углу жамкаем “Add a new widget”. Выбираем нужный тип плитки (при подведении курсора всплывут подсказки) “Switch” если это переключатель, “Dummy” если это датчик… и т.д. В настройках созданной плитки привязываем её к существующему в системе “Item” и настраиваем отображение – иконку, цвет, размер… После создания всех нужных плиток “items” нажимаем “Run” в левом углу, тем самым сохраняя настройки и запуская режим отображения. Вот таким макаром создаем под себя интерфейс Habpanel. Очень удобно после конфигурирования, если это делалось в Chrome, добавить страницу Habpanel на рабочий стол планшета из настроек браузера.

Rules

Rules (правила) — те самые правила (скрипты) для реализации логики функционирования отдельно взятого устройства или взаимодействий между несколькими.

Реализуем автоматическое управление вытяжкой в ванной.

Для этого в системе мы должны создать виртуальный “Item” типа “Number” в котором мы будем записывать значения нужного нам уровня влажности. Еще один “Item” типа “Switch” для запуска автоматического контроля уровня влажности. Ну и собственно само правило, которое и будет обрабатывать полученное значение влажности с датчика в ванной, сверять с установленным значением нашей уставки и управлять вытяжкой.

Для создания правила мы должны создать файл с расширением .rules с содержимым на javascript в папку на сервере /etc/openhab2/rules. Вот пример содержимого:

rule «Auto_air»
when
Item Hum_H_T_sens received update
then
if
(Hum_H_T_sens.state > Set_hum.state && Air_H_T_switch.state==OFF && Set_auto_air.state==ON){
Air_H_T_switch.sendCommand(ON)
}
else
if
(Hum_H_T_sens.state < Set_hum.state && Air_H_T_switch.state==ON && Set_auto_air.state==ON){
Air_H_T_switch.sendCommand(OFF)
}
end

Ну и собственно нужно вывести созданные “Item-ы” на экран дашборда в Habpanel. Для “Item” уставки уровня влажности, применить тип “Slider”.

Charts

Еще одна приятная особенность системы, это статистический сбор данных в базы и отображение в виде графиков.

Создадим графики! Прежде нужно настроить работу базы данных.

По умолчанию OpenHab предлагает работу с базой данных Rrd4j, но нормально настроить ее я не смог. Поэтому стал использовать MySQL (как-то привычней).

Для работы с базой необходимо установить в системе дополнение. Во вкладке “Addons” Paper UI выбираем в разделе “Persistence”, MySQL Persistence (install).

Базу мы создали теперь настраиваем.

Для этого мы должны создать файл (если он отсутствует) в папке на сервере: /etc/openhab2/persistence/mysql.persist, в котором мы должны указать стратегию сбора данных (типа почасовая, дневная, недельная…) и указать какие именно “Item” с привязкой к какой стратегии будут храниться. Для примера вот содержимое:

// persistence strategies have a name and a definition and are referred to in the «Items» section

Strategies {

// если для элемента ниже не указана стратегия, будет использоваться список по умолчанию

everyMinute: «0 * * * * ?»

every5Minutes: «0 */5 * * * ?»

everyHour: «0 0 * * * ?»

everyDay: «0 0 0 * * ?»

default = everyChange

}

/*
* Каждая строка в этом разделе определяется, для которых товар(ов), в которых стратегии(иэс) следует применять.
* You can list single items, use «*» for all items or «groupitem*» for all members of a group
* item (excl. the group item itself).
*/

Items {
// сохраняют все элементы один раз в день и при каждом изменении восстанавливают их из базы данных при запуске
//*: strategy = everyChange, everyDay, restoreOnStartup

// кроме того, сохраняются все значения температуры и погоды каждый час
Weather_Temperature, Temp_H_LR_sens, Temp_H_BR_sens, Temp_H_T_sens, Temp_H_KT_sens, TP_H_H_sens, TP_H_KT_sens, Weather_Humidity, Hum_H_LR_sens, Hum_H_BR_sens, Hum_H_T_sens, Hum_H_KT_sens: strategy = everyMinute, restoreOnStartup
}

После создания файла система уже начнет сбор данных. Нам же нужно настроить дашборд Habpanel на отображение графиков.

Возвращаемся в графический интерфейс Habpanel, заходим в нужную локацию и добавляем новый виджет выбрав тип “Charts”. Обзываем как хотим, “Type” выбираем “n3-line-chart (interactive)”, “Service provider” – mysql, “Period” – период отображения день (D). В о вкладке “Series” – привязываем нужный нам “Item”. И вуаля! получаем красивый график!

Ну а дальше чистой воды самодеятельность – крепим планшет на стену! О_о для этого я взял две магнитные карты формата em-marin (те которые очень тонкие) и клеим на клей (Uhu) по краям карты два неодимовых магнита. Такие платформы с магнитами крепим на двусторонний скотч (хороший тонкий) с обратной стороны планшета и на стену. Кстати заранее в подрозетник, установлен блок питания MeanWell 5В, с кабелем microUSB. Планшет на стене!

Прошу прощения за особенность изложения материала (никогда раньше ничего подобного не писал). Если пост будет хоть сколько популярен, в следующем, опишу особенность настройки мобильного приложения. Надеюсь пригодится. Всем умного дома)))

Как перевести питомца с одного корма на другой?

Содержание:

Перевод на другой корм – процесс, требующий правильной организации. Зная нюансы, он займет немного времени и не нанесет четвероногому другу проблем со здоровьем. 

Ситуации, когда питомцу нужно изменить рацион:

• он долгое время употреблял натуральную пищу;
• кастрированные и стерилизованные животные нуждаются в специализированном питании;
• вы решили перейти на корм классом выше;
• привычную марку сняли с производства или ее цена повысилась.

Проблемы со здоровьем – еще одна частая причина смены корма:

• животным с хроническими заболеваниями должны питаться особо;
• домашний любимец начал чесаться. Причиной может быть пищевая аллергия;
• шерсть кошки или собаки потускнела, стала выпадать и терять блеск;
• животное начало набирать лишний вес;
• периодически наблюдаются рвота и/или понос.

ВАЖНО! Ветеринарные врачи рекомендуют периодически менять тип корма для того, чтобы организм питомца не привык перерабатывать только один вид пищи. 

Перевод должен осуществляться постепенно по следующим причинам:

• резкий переход вызывает стресс у животного;
• корм может не подойти, вызвать нарушения желудочно-кишечного тракта;
• питомец может отказываться от нового вида пищи.

Хозяину нужно проявить настойчивость и терпение. Чем плавней будет переход, тем безболезненней пройдет для кошки или собаки. Лучше добавлять новый корм в старый постепенно, от нескольких граммов в день. Постепенно увеличивая количество, нужно полностью вытеснить привычную еду из рациона животного.

Таблица замены одного корма другим:

Полный переход займет около недели.

Важно знать следующее:

• Первое время собака или кошка может отказываться от нового вида питания, и это нормально.
• Лучше приобрести несколько маленьких упаковок нового типа питания. Аппетит питомца подскажет, не ошиблись ли вы.
• Внимательно следите за тем, как пища усваивается. Если вы заметили такие неприятные побочные эффекты, как рвота и понос, пробуйте другой вариант.
• Дополнительный стресс для животного – полная смена вкуса еды. Если любимец всегда употреблял корм с курицей, новый должен быть с аналогичным вкусом. Постепенно можно пробовать другие составы.
• Если вы переводите кошку или собаку с влажного корма на сухой, то можно размочить его в воде или курином бульоне – так желудку будет легче переварить новую структуру.
• Переход щенка или котенка на “сушку” должен осуществляться только после полной смены молочных зубов.

Корма для животных разделяются на сухие и влажные. Производители тщательно следят за качеством продукта: в составе готовых рационов присутствуют необходимые витамины, минералы и микроэлементы. 

Преимущества сухого корма:

• обладает длительным сроком годности;
• хранится при комнатной температуре;
• недоеденный корм можно употребить позже. 

• легче пережевывается;
• продается порционно;
• содержание белка выше, чем в сухом.

Существует определенная классификация готовой еды для животных. 

Всего выделяют четыре класса:

1. Холистик

• отвечает стандартам качества;
• содержание мяса: 65-80 процентов;
• источники клетчатки – крупы твердых сортов, овощи, фрукты;
• добавлены ягоды и травяные сборы, обеспечивающие организм животного полезными веществами. 
  

2. Супер-премиум 


• изготовлены из высококачественных компонентов;
• не вызывают проблем с пищеварением питомца;
• богаты витаминами, необходимыми микро- и макроэлементами.

3. Премиум

• мясо составляет 30% корма;
• присутствует рис, помогающий избежать проблем с желудочно-кишечным трактом и обеспечивающий организм клетчаткой.

4. Эконом 


• изготавливаются в основном из субпродуктов;
• главная составляющая – крупы;
• требуют внимательного изучения состава перед приобретением.



Выбирая корм, следует учитывать:

1. Состояние здоровья питомца. Для животных с хроническими болезнями производятся лечебные корма, а кастрированные и стерилизованные кошки и собаки нуждаются в диетическом питании.

2. Возраст. Нельзя кормить щенка кормами для взрослой собаки: их составы значительно различаются.

3. Размер. Маленькой собаке будет трудно употребить корм для крупных пород.

4. Энергетическую ценность корма. Для активного четвероногого друга нужно подбирать марки с высоким показателем.

5. Тип шерсти. Для длинношерстных пород лучше подойдут варианты с Омегой-3, -6, цинком и железом.

6. Особенности пищеварительной системы. Для собак и кошек с чувствительным ЖКТ также рекомендуются специальные типы кормов.

Читайте также: Чем кормить картированного кота?

С какими трудностями придется столкнуться





Переход на другой тип питания – это стресс как для животного, так и для хозяина. Нужно быть готовым к следующему:

• Перевод займет 1-2 недели;
• Питомец может отказываться от нового корма. В этом случае предложите его кошке или собаке позже;
• Не возвращайтесь к старой марке еды;
• Домашние питомцы – прекрасные манипуляторы. Любимец может смотреть на членов семьи жалостливыми глазами и просить поделиться с ним едой или покормить привычным кормом. Делать этого не следует.
О необходимости воды

Вода – важнейшая составляющая организма. Она участвует в метаболизме и поддерживает правильную работу желудочно-кишечного тракта. В свободном доступе у животного должна быть чистая питьевая вода


Подводим итоги






• Переход на другой корм должен осуществляться правильно. Нужно постепенно заменять привычную еду новой, начиная с малых порций.
• Внимательно следите за состоянием четвероногого друга.
• В миске у кошки или собаки всегда должна находиться питьевая вода.
• Обратитесь к ветеринару за советом относительно выбора марки корма.
Рекомендуем также

ps2561% 20optocoupler% 20 Эквивалентный лист данных и примечания по применению

1992 — NEC 2561 Аннотация: nec pc 2561 NEC 2561 транзистор PS2561 2561 nec изоляция NEC 2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 ПС2561-1, ПС2561Л-1, PS2561L-1-E3, PS2561L-2-E3, E7242законы NEC 2561 nec pc 2561 NEC 2561 транзистор PS2561 2561 н.э. изоляция NEC 2561
pc111 оптрон Аннотация: qtc 2531 qtc 2630 qtc 2731 qtc 2530 qtc 2631 Lh2571 PC123 оптопара PC923 эквивалент 74ol6000 эквивалент Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	UL1577 PS71XX-1A PS71XX-2A E72422 VDE0884 BS415 / EC55 BS7002 / EC950 СС-441-01-55 pc111 оптопара qtc 2531 qtc 2630 qtc 2731 qtc 2530 qtc 2631 Lh2571 Оптопара PC123 Эквивалент PC923 74ol6000 эквивалент
, не включенные в другие категории PS2561 Аннотация: BS415 BS7002 PS2561-1 PS2561L-1 VDE0884 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 ПС2561-1, PS2561L-1, VDE0884 E72422 не включенные в другие категории PS2561 BS415 BS7002
ПС2561-1-В-А Резюме: nec 2561 nec PS2561 PS2561L1-1-V-A W оптопара nec 2561 datasheet 2561 оптопара PS2561L-1-F3-A PS2561L1-1Y-V-A PS2561-1-A PS2561L2-1 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 PS2561-1 PS2561L2-1 PS2561-1-V-A nec 2561 не включенные в другие категории PS2561 PS2561L1-1-V-A W оптопара nec 2561 лист данных 2561 оптопара PS2561L-1-F3-A PS2561L1-1Y-V-A PS2561-1-A
2005 — ПС2561-1 Аннотация: оптопара ps2561 PS2561-4-A 2561 PS2561L-2-E3 PS2561L2-1-E3 PS2561L2-1 PS2561L-1-E3 PS2561L1-1 PS2561-2-A Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 ПС2561-1, ПС2561Л-1, ПС2561Л1-1, ПС2561Л2-1, 80анты ps2561 PS2561-4-A оптопара 2561 PS2561L-2-E3 PS2561L2-1-E3 PS2561L-1-E3 PS2561-2-A
1992 — NEC 2561 Аннотация: nec pc 2561 nec PS2561 оптопара nec 2561 транзистор NEC 2561 2561 nec NEC 2561 de nec 2561 лист данных PS2561-1 транзистор NEC 2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 ПС2561-1, ПС2561Л-1, ПС2561Л1-1, ПС2561Л2-1, NEC 2561 nec pc 2561 не включенные в другие категории PS2561 оптопара nec 2561 транзистор NEC 2561 2561 н.э. NEC 2561 de nec 2561 лист данных NEC 2561 транзистор
1997 — NEC 2561 Аннотация: оптопара nec 2561 nec pc 2561 2561 nec NEC semiconductor 2561 2561 оптопара NEC 2561 транзистор nec PS2561 NEC 2561 h оптопара 2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 ПС2561-1, ПС2561Л-1, PS2561L-1-E3, PS2561L-2-E3, NEC 2561 оптопара nec 2561 nec pc 2561 2561 н.э. Полупроводник NEC 2561 2561 оптопара NEC 2561 транзистор не включенные в другие категории PS2561 NEC 2561 ч оптопара 2561
, не включенные в другие категории PS2561 Реферат: ПС256И LC-2225 SS-441-01-65 марка e3 46 диод Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	PS2561 PS2561L-1 ПС2561-1, ПС2561Л-1, VDE0884 E7242ial не включенные в другие категории PS2561 PS256I LC-2225 СС-441-01-65 mark e3 46 диод
pc111 оптрон Аннотация: оптопара PC123 qtc 2630 qtc 2531 optocoupler qtc 2631 qtc 2531 PC817 SOP-4 qtc 2731 PC113 optocoupler pc120 optocoupler Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PC120 PS2701-1 Labo-89 SFS-EN-60-950 НЕК-ЭН-60-950 A21409 24 часа pc111 оптопара Оптопара PC123 qtc 2630 qtc 2531 оптопара qtc 2631 qtc 2531 PC817 СОП-4 qtc 2731 Оптрон PC113 pc120 оптопара
ps2561 оптрон Аннотация: PS2561 PS2561-2 PS2561-1 VDE0884 PS2561L-4 PS2561L-2 PS2561L1-1 PS2561L-1 оптрон ps2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	ПС2561-1, ПС2561Л-1, PS2561L1-1 PS2561L2-1 24 часа ps2561 оптопара PS2561 PS2561-2 PS2561-1 VDE0884 PS2561L-4 PS2561L-2 PS2561L1-1 PS2561L-1 оптопара ps2561
ps2561 оптрон Аннотация: PS2561 S2561 169ps PS2561-1 Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	ПС2561-1, PS2561 S2561-1 PS2561L-1 PS2561L-4 PS2561L1-1 PS2561L2-1 ps2561 оптопара S2561 169 шт. PS2561-1
транзистор A25 SMD Аннотация: диод rl 254 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 VDE0884 PS2561-1 транзистор A25 SMD rl 254 диод
ps2561 оптрон Аннотация: абстрактный текст недоступен Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	ПС2561-1, PS2561L-1, PS2561 PS2561L1-1 PS2561L2-1 24 часа ps2561 оптопара
2008-пс2561l1-1-в-а Аннотация: Транзисторная оптопара PS2561 NEC 2561 nec 2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 PS2561L2-1 ps2561l1-1-v-a PS2561 NEC 2561 транзистор оптопара nec 2561
2003 — не включенные в другие категории PS2561 Аннотация: оптопара ps2561 PS2561 PS2561-1 CEL PS2561L-4 PS2561L-2 PS2561L1-1 PS2561L-1 PS2561-4 Изолятор Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	ПС2561-1, ПС2561Л-1, не включенные в другие категории PS2561 ps2561 оптопара PS2561 PS2561-1 CEL PS2561L-4 PS2561L-2 PS2561L1-1 PS2561L-1 PS2561-4 Изолятор
1992 — NEC 2561 Аннотация: оптопара nec 2561, эквивалентная nec 2561 nec 2561 лист данных PS2561L-1 транзистор NEC 2561 PS2561-1-V-A 2561 оптопара оптопара nec 2561 техническое описание 2561 nec Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 PS2561L2-1 NEC 2561 эквивалент 2561, не включенный в другие категории оптопара nec 2561 nec 2561 лист данных NEC 2561 транзистор PS2561-1-V-A 2561 оптопара оптопара nec 2561 лист данных 2561 н.э.
1992 — NEC 2561 Аннотация: 2561 nec nec PS2561 nec 2561 datasheet NEC 2561 транзистор nec pc 2561 nec 2561 эквивалент 2561 оптопара оптопара 2561 PN10234EJ03V0DS Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 PS2561L2-1 NEC 2561 2561 н.э. не включенные в другие категории PS2561 nec 2561 лист данных NEC 2561 транзистор nec pc 2561 эквивалент 2561, не включенный в другие категории 2561 оптопара оптопара 2561 PN10234EJ03V0DS
2008 — NEC 2561 Аннотация: PS2561L-1-F3-A PS2561-1-V-A оптопара, не включенная в другие категории 2561 nec PS2561 2561 оптопара ML831 PS2561-1 NEC 2561 транзистор PS2561L1-1-V-A W Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF
Нет в наличии Аннотация: абстрактный текст недоступен Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	PS2561 PS2561L-1, S2561L-1, PS2561L-4 PS2561L1-1 PS2561L2-1
Нет в наличии Аннотация: абстрактный текст недоступен Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	PS2561 2561Л-1,
2010 — Оптрон PC123 Аннотация: оптопара TLP250 ps9402 оптопара 817 TLP121-4 Оптопара HCPL 501 HCPL-501 cosmo 817 PS8551L4 PS9303 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	25кВ / мкс R08CL0002ED0100 EPMC-PU-0116-2 Оптопара PC123 оптрон TLP250 ps9402 оптрон 817 TLP121-4 Оптопара HCPL 501 HCPL-501 космо 817 PS8551L4 PS9303
ПС2561-1-В-А Аннотация: PS2561 PS2561L1-1-V-A W PS2561L-1-V-E3-A PS2561L-1-V-F3-A PS2561L-1-F3-A PS2561-1 PS2561-1-A P03200272 EN60747-5-2 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	PS2561-1 PS2561L-1 PS2561L1-1 PS2561L2-1 PS2561L2-1 PS2561-1-V-A PS2561 PS2561L1-1-V-A W PS2561L-1-V-E3-A PS2561L-1-V-F3-A PS2561L-1-F3-A PS2561-1-A P03200272 EN60747-5-2
2001-ПС2561 Резюме: nec PS2561 Текст: нет текста в файле	Оригинал	PDF	ПС2561-1, ПС2561Л-1, PS2561 не включенные в другие категории PS2561
E72422 Аннотация: BS41 PS2521 PS2533 PS2705-4 PS2701-4 Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	PS1001 PS2501-1 PS2501 E72422 PS2501-2 PS2501-3 PS2501-4 BS41 PS2521 PS2533 PS2705-4 PS2701-4
PS25XX Аннотация: абстрактный текст недоступен Текст: нет текста в файле	OCR сканирование	PDF	PS2501 PS2501L-1 PS2501-2 PS2501-3 PS2501-4 PS2502-1 PS2502 PS25XX

Amazon.com: Сменный стеклянный сосуд Welch Vacuum 1415B для 2561, 2565, 2581, 2585: Industrial & Scientific

---

В настоящее время недоступен.
Мы не знаем, когда и появится ли этот товар в наличии.
• Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели.
• Сменная стеклянная банка
• Для использования с моделями 2561, 2565, 2581 и 2585 (продаются отдельно)
• Упаковать по одному
]]>

---

Характеристики

Фирменное наименование	Велч Вакуум
Серийный номер производителя	14
Материал	Стакан
Номер модели	1415B
Кол-во позиций	1
Номер детали	1415B
Код UNSPSC	41000000

---

Сердечная микрососудистая патология при болезни Фабри: оценка биопсий эндомиокарда до и после заместительной ферментной терапии

Фон: У классических пациентов Фабри ускоренный коронарный атеросклероз и гипертрофия левого желудочка проявляются в четвертой декаде; однако признаки сердечно-сосудистого заболевания также наблюдаются в более позднем возрасте у пациентов с «сердечным вариантом» и у гетерозигот женского пола с симптомами.Эти нарушения вызваны накоплением глоботриаозилцерамида (GL-3) в сердце в результате дефицита лизосомальной альфа-галактозидазы А.

Методы и результаты: Мы проанализировали эндомиокардиальные биопсии до и после лечения у 58 пациентов Фабри, включенных в 5-месячное, фазу 3, двойное слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование, за которым последовало 54-месячное открытое расширенное исследование рекомбинантной человеческой альфа-галактозидазы А. .Исходные оценки выявили отложения GL-3 в эндотелиальных клетках интерстициальных капилляров и крупные слоистые включения внутри кардиомиоцитов. В этом исследовании мы оценивали микроваскулярный клиренс GL-3; клиренса GL-3 в кардиомиоцитах во время этого испытания не наблюдалось. Пять месяцев лечения рекомбинантной человеческой альфа-галактозидазой А в испытании фазы 3 привели к полному микроваскулярному клиренсу GL-3 у 72% пролеченных пациентов по сравнению только с 3% пациентов, получавших плацебо (P <0,001). Группа плацебо достигла аналогичных результатов после 6 месяцев лечения в открытом исследовании.Кроме того, эндотелий капилляров оставался свободным от GL-3 в течение 60 месяцев у 6 из 8 пациентов, согласившихся на биопсию в конце исследования.

Выводы: Полученные данные свидетельствуют о том, что длительное лечение рекомбинантной человеческой альфа-галактозидазой А может остановить прогрессирование сосудистой патологии и предотвратить клинические проявления атеросклеротического заболевания. Это гистопатологическое исследование должно стать полезным руководством для клиницистов и патологов, которые ставят диагноз и наблюдают за пациентами Фабри.

Завершение, или замена, нацеливание на ген у Drosophila

Abstract

Конец и конец относятся к двум расположениям донорской ДНК, которые можно использовать для нацеливания на гены. Оба были использованы для целенаправленного мутагенеза, но требуются доноры разного дизайна. Конечное нацеливание чаще используется у мышей и дрожжей, потому что оно дает простой путь для замены или удаления целевого локуса. Хотя конечное нацеливание было успешным у Drosophila , попытка конечного нацеливания не удалась.Чтобы проверить, может ли таргетинг на концы концов быть использован у Drosophila , мы применили две стратегии для замены концевого гена в эндогенном локусе yellow ( y ) в Drosophila . Во-первых, мутантный аллель был спасен заменой фрагментом ДНК размером 8 kb y ⁺ со скоростью ≈1 / 800 гамет. Во-вторых, ген дикого типа был нарушен вставкой гена-маркера в экзон 1 со скоростью ≈1 / 380 гамет. Компонент эндонуклеазы I-SceI сам по себе недостаточен для нацеливания: рекомбиназа FLP также необходима для создания внехромосомного донора.Когда используются оба компонента, мы обнаруживаем, что нацеливание на конечные точки может быть примерно таким же эффективным, как и нацеливание на конечные точки, и, вероятно, в целом полезно для нацеливания на гены Drosophila .

Нацеливание на ген — это модификация последовательности эндогенного гена путем рекомбинации между введенным фрагментом ДНК и гомологичным геном-мишенью. За последние 25 лет нацеливание на гены широко использовалось у модельных эукариот, сначала у дрожжей, а затем у мышей (1, 2), но сложность введения линейной молекулы ДНК в клетки зародышевой линии препятствовала его развитию для Drosophila .Недавно было сообщено о способе создания такого линейного фрагмента in vivo , сопровождаемом демонстрацией нацеливания на концы внутрь или инсерцию гена (3). Это происходит, когда двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) происходит во фрагменте донорной ДНК в пределах участка ДНК, который гомологичен целевому локусу, и приводит к вставке донора для создания дупликации целевой области. Альтернативное расположение, при котором DSB расположены на каждом конце гомологичного сегмента, называется нацеливанием на конечные точки и вызывает замену сегмента хромосомы на введенный сегмент (рис.1). У мышей и дрожжей некоторые исследования показывают, что нацеливание на конечные точки менее эффективно, чем на конечные точки (4-6), тогда как другие показывают, что оба типа могут быть одинаково эффективными (7, 8). Сомнения в эффективности нацеливания на конечные точки у Drosophila возникли из-за предыдущей неудачи (9). Мы предприняли эту работу, чтобы определить, можно ли с пользой реализовать таргетинг на конечные точки в Drosophila .

Рисунок 1

Две общие формы нацеливания на гены.Молекулы донорской ДНК изображены над их мишенями вместе с ожидаемыми продуктами рекомбинации. Светло-серая область представляет собой гомологичную-мишень ДНК; черная область — положительный маркерный ген.

Материалы и методы

Конечные донорские конструкции.

желтая спасательная конструкция .

Две пары олигонуклеотидов, 5′-GTACATTACCCTGTTATCCCTA-3 ‘, 5′-GTACTAGGGATAACAGGGTAAT-3′ и 5’-TAGGGATAACAGGGTAATTGCA-3 ‘, 5′-ATTACCCTGTTATCCCTATGCA-3′, 5’-ATTACCCTGTTATCCCTATGCA-3 ‘были отнесены к 904 и клонированы в 9049 PICA-3′ сайты pw8 (10), чтобы вставить два сайта распознавания I-SceI.Праймеры 5’-GAGAAAGGATCCAAGCATGCTGCGACGTGAACAGTGAGCTGTA-3 ‘и 5′-GTTAGAGGATCCCCGCATGCAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTTGGT-3’ были использованы для добавления конца-мишени Sph IFC (FLR ) к рекомбинантному фрагменту FR . Праймеры 5′-GTCATAGAATTCACGCACTATGCCGTTCTTCTCATG-3 ‘и 5′-GAGCATGAATTCGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAA-3’ использовали для добавления Eco RI-концов к FRT с помощью ПЦР. В качестве матрицы использовали плазмиду, несущую единственную копию FRT из дрожжевой плазмиды 2μ, с ≈300 п.н. 2μ-фланкирующей ДНК с каждой стороны.Амплифицированные FRT были разрезаны с помощью Sph I и Eco RI, соответственно, и лигированы с сайтами Sph I и Eco RI полилинкера в модифицированном pw8. Были выбраны клоны, в которых два FRT были в одном направлении, генерируя вектор pw30, вектор элемента P , несущий полилинкер, фланкированный сайтами I-SceI, а затем FRT , соседний с белый ⁺ ( w ⁺ ) ген.pw30 был разрезан с помощью Xho I, и в этот сайт был клонирован геномный фрагмент 8 kb Sal I y ⁺ из pS I G (11).

желтая разрушающая конструкция .

Два олигонуклеотида, 5′-CTCGAGGGTACCGCGGCCGCGCATGCCTGCA-3 ‘, 5′-GGCATGCGCGGCCGCGGTACCCTCGAGTGCA-3’, были отожжены и клонированы в сайт Pst I в Карнеги (12). Посредством секвенирования ДНК была выбрана плазмида с новыми сайтами, вставленными как ( Hin dIII) Xho I-Acc65I- Not I- Sph I ( Pst I- Sal I), где сайты в скобках уже присутствовали в Карнеги 4.Впоследствии две пары олигонуклеотидов, 5′-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 ‘, 5′-ATTACCCTGTTATCCCTA-3′ и 5’-GTACATTACCCTGTTATCCCTA-3 ‘, 5′-GTACTAGGGATAACAGGGTAAT-3’, были отожжены и клонированы в 493 и клонированы в модель 493. Сайты Acc65I полилинкера, соответственно, генерируют два сайта распознавания I-SceI. ПЦР использовали для добавления концов Eco RI к FRT , как указано выше. После переваривания с Eco RI его лигировали в сайт Eco RI полилинкера. Затем ген w ⁺ pw6 (10) был удален как фрагмент Pst I– Sph I и клонирован в эти сайты полилинкера. Xho I-фланкированный FRT был получен с использованием праймеров 5′-AGCACTCGAGTGCGACGTGAACAGTGAGCTGTA-3 ‘и 5′-TACCCTCGAGAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGT-904’ для FRT 904 ‘. После переваривания с Xho I его лигировали с сайтом Xho I полилинкера. Был выбран клон, два FRT которого лежат в одном направлении, и был получен вектор pw35, вектор элемента P , который несет ген w ⁺ , фланкированный сайтами узнавания I-SceI, и FRT s. за пределами тех.Уникальные сайты Not I и Sph I выше по течению и Bam HI ниже по течению от w ⁺ доступны для клонирования в pw35. Праймеры 5′-AGCAGCGGCCGCCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAG-3 ‘и 5′-TACCGCATGCGCACTTAGCTCTAAGCTGACAATC-3’ использовали в ПЦР с pS / G в качестве матрицы, чтобы добавить Not I и I фрагмент ДНК к ДНК Not I и I Sph ДНК. (от -3043 до -2 п.н. перед стартовым кодоном), который затем был клонирован в эти сайты pw35.Затем олигонуклеотиды 5′-GATCCACGTACGAGGCGCGCC-3 ‘и 5′-GATCGGCGCGCCTCGTACGTG-3’ были отожжены и клонированы в сайт Bam HI полилинкера, и была выбрана плазмида, Bam которой HI49 находится рядом с сайтом HI49. Сайт I полилинкера, генерирующий Bam сайтов HI-BsiWI-AscI в полилинкере. Праймеры 5′-TACCCGTACGCGTCTTGGGCTGCTTACAAACTTC-3 ‘и 5′-AGCAGGCGCGCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG-3’ были использованы для добавления BsiWI и AscI-концов к первому фрагменту exon ДНК размером 4,77 кб и второму фрагменту exon длиной 4,77 т.п.н. .Этот фрагмент y был клонирован в соответствующие сайты ниже w ⁺ .

желтая спасательная конструкция без FRT.

Две пары олигонуклеотидов, 5′-AATTTAGGGATAACAGGGTAAT-3 ‘, 5′-AATTATTACCCTGTTATCCCTA-3′ и 5’-TAGGGATAACAGGGTAATTGCA-3 ‘, 5’-ATTACCCTGTTATCCCTATGCAne были объединены в 9049 и 9049-R49-3. Pst I сайтов pw8, соответственно, разрушая два сайта рестрикции и создавая два сайта узнавания I-SceI.Затем фрагмент Sal I y ⁺ размером 8 kb клонировали в сайт Xho I этого вектора.

Генетика и тепловой шок.

скрещиваний для определения цели проводили в стандартных флаконах диаметром 25 мм, по три-шесть самок на флакон и соответствующее количество соответствующих самцов. Тепловые удары выполняли в циркуляционной водяной бане, как описано (13). Все конструкции трансформировали в зародышевую линию Drosophila melanogaster стандартными методами (14).

Саузерн-блоттинг.

Для проверки нацеливания ДНК получали от мужчин, несущих целевой аллель. Для анализа I-SceI, разрезанного in vivo , геномную ДНК получали из личинок через 0, 2, 4, 8 или 16 часов после теплового шока, а также из личинок, которые не подвергались тепловому шоку. Геномные ДНК переваривали, как указано, разделяли электрофорезом в агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны. Мембраны зондировали с помощью Dig-меченного фрагментом ДНК размером 8 kb Sal I y из pS / G, и гибридизацию детектировали с помощью хемилюминесценции с использованием системы DIG (Roche).

Результаты

Спасение мутации.

Две ферментные конструкции, использованные в этой работе, такие же, как те, что используются для нацеливания на концы внутрь: индуцируемые нагреванием трансгены рекомбиназы FLP (13) и I-SceI эндонуклеазы (3) ( 70FLP и 70I- SceI ). Мы также сконструировали донорские трансгены, несущие последовательность из целевого локуса.

Сначала мы создали и трансформировали конструкцию донора элемента y ⁺ P , чтобы спасти y ¹ , который имеет мутацию в своем первом кодоне.Эта конструкция несет ген y ⁺ , фланкированный последовательностями распознавания I-SceI, и FRT s, соседний с геном w ⁺ , который находится за пределами FRT (рис. 2 A ) . Для нацеливания экспрессию FLP и I-SceI индуцировали для удаления y ⁺ из хромосомы и создания DSB, которые стимулируют HR. Мы провели тестовые скрещивания, как показано на рис. 3, и провели скрининг на потомство y ⁺ w для выявления событий, которые преобразовали эндогенный аллель y ¹ в y ⁺ .Другими словами, мы провели скрининг на y ⁺ , чтобы переместиться из своего исходного местоположения, рядом с геном w ⁺ на аутосоме, в X-хромосому, а затем отделились от w ⁺ в мейоз. В этом эксперименте y ⁺ были эффективно вырезаны из донорской хромосомы, при этом почти все белые потомки ⁺ показали потерю y ⁺ (33 668 из 33 790 = 99,6% в 772 подсчитанных флаконах). Всего было выявлено 43 независимых целевых события, которые преобразовали и ¹ в и ⁺ , в среднем примерно одно независимое событие на 16 проверенных флаконов (невзвешенные; Таблица 1).В каждом флаконе было получено ≈52 потомства с белыми глазами, что соответствует 1 событию нацеливания на 832 гамет. Также были восстановлены четыре независимых нецелевых события y ⁺ w . В них y ⁺ не отображались на X , и они не исследовались далее. Они могли включать вставку y ⁺ в другие места или потерю y ⁺ из донорской конструкции после разреза I-SceI без удаления y ⁺ . Нацеленная рекомбинация превышала численность нецелевых событий лучше, чем в 10: 1, и была подтверждена саузерн-блоттингом (рис. 4 A ).

Рисунок 2

Конструкции для конечного таргетинга. Показаны местоположения генов y ⁺ и w ⁺ вместе с FRT s и последовательностями узнавания I-SceI (I-сайт). y _u и y _d указывают верхнюю и нижнюю части y. Маленькие стрелки на левом и правом концах каждой конструкции указывают концы инвертированного повтора элемента P .

Рисунок 3

Схемы переходов. Показаны типичные кресты, используемые для экспериментов по спасению и разрушению. Для экспериментов по спасению – самки с пигментом глаз были отобраны для второго скрещивания, гарантируя, что все они несут донора. Для деструктивных скрещиваний в некоторых случаях донорский элемент был гемизиготным у самцов, и поэтому только половина самок, использованных во втором скрещивании, несли донора.Частота нацеливания была соответствующим образом скорректирована в Таблице 1. В других случаях мы выбрали женщин с некоторой степенью пигментации глаза, гарантируя, что они являются носителями донора; или самцы, использованные в первом скрещивании, несли донора, гетерозиготного с доминантно отмеченной балансирующей хромосомой, что позволяет отобрать самок, несущих донора для второго скрещивания.

Таблица 1

Восстановление событий нацеливания

Рисунок 4

Проверка таргетинга.( A ) Геномный Саузерн-блоттинг для проверки целевого спасения и . Буквы над каждой полосой обозначают исследуемый генотип и относятся к ожидаемым структурам донорской конструкции, целевому гену y (который не изменяется после ожидаемого события спасения одной копии) и тандемному событию спасения, указанному справа. Область, используемая в качестве зонда, обозначена сплошной линией под каждой структурой вместе с ожидаемыми размерами фрагментов, полученных при расщеплении Sph I (Sp).Левая и правая дорожки (M) несут маркеры молекулярной массы с размерами, указанными слева. Первые четыре экспериментальные дорожки являются целевыми аллелями; следующие два — это y w мух, несущих донора, и y w отдельно. ( B ) Цитологическая проверка целевого разрушения. Ген w использовали для зондирования политенных хромосом личинки, несущей целевой аллель y . Указаны два сайта гибридизации и их цитологические обозначения.( C ) Геномный Саузерн-блоттинг для проверки целевого разрушения и . Ожидаемые структуры целевого локуса, донорской конструкции, целевого аллеля и целевого аллеля с тандемной вставкой показаны справа вместе с ожидаемыми размерами полос, образующихся при переваривании Sal I (S). Первые две экспериментальные дорожки представляют геномную ДНК от y ⁺ w ¹¹¹⁸ мух и y ⁺ w ¹¹¹⁸ мух, несущих донорскую конструкцию.Остальные — это примеры таргетинга.

Большинство событий нацеливания было результатом простой замены y ¹ на y ⁺ , но ≈20% (9 из 43) имели две копии гена y в целевом локусе. Интеграция донорных димеров наблюдалась ранее с нацеливанием на конечные точки у дрожжей и мух (3, 15, 16) и нацеливанием на конечные точки в ES-клетках мыши (4, 17, 18). Причиной, по-видимому, является образование конкатемеров между несколькими копиями донора.Мухи, использованные в этом эксперименте, несли единственную копию донорного элемента P (подтверждено саузерн-блоттингом). Однако в G ₂ клеточного цикла две копии будут присутствовать на реплицированных хроматидах, что дает возможность двум донорам димеризоваться посредством FLP-опосредованной или гомологичной рекомбинации или посредством негомологичного концевого соединения и подвергаться нацеливанию.

Нарушение гена.

Чтобы расширить этот метод для генерации мутантных аллелей генов-мишеней, мы сконструировали и трансформировали донорный элемент, несущий ген y , нарушенный вставкой гена w ⁺ (рис.2 В ). Приблизительно 50 п.н. кодирующей последовательности –, включая стартовый кодон, также были исключены в конструкции. Ожидается, что при нацеливании с помощью этой конструкции будет генерироваться мутантный аллель y и переноситься w ⁺ в локус.

Мы провели скрининг на нарушение эндогенного гена y ⁺ на фоне y ⁺ w с использованием доноров на хромосоме 3 и поиском потомства yw ⁺ путем тестового скрещивания (рис. .3). Как и в предыдущих экспериментах, удаление донора было очень эффективным (> 99%), о чем можно судить по потере w ⁺ . Мы восстановили 106 независимых событий нацеливания со скоростью ≈1 в 5 флаконах (невзвешенное среднее значение; Таблица 1). Каждая пробирка произвела ≈76 потомков мужского пола, или одно целевое событие на 380 гамет. В каждом случае ген w ⁺ картирован в Х-хромосоме, как и ожидалось, для нацеливания на y . Четыре линии были исследованы с помощью хромосомной гибридизации in situ , и во всех четырех последовательность гена w была обнаружена в его нормальном положении 3C на X-хромосоме, а также в 1B, нормальном местоположении y , подтверждая, что рекомбинация интегрировала w ⁺ в целевой локус (рис.4 В ). Саузерн-блоттинг 89 случаев подтвердил, что все они являются результатом направленной гомологичной рекомбинации на и (фиг. 4 C ). Как и в предыдущих экспериментах, были восстановлены некоторые дублированные аллели (2 из 89).

В этих скрещиваниях мы проверили разрушение y ⁺ и интеграцию w ⁺ одновременно и восстановили только целевые события. Но должно быть почти так же легко восстанавливать события нацеливания путем скрининга только для мобилизации маркера w ⁺ .В трех предыдущих сериях исследований с использованием различных генов-мишеней (3, 16, 19), а также в экспериментах по спасению и , описанных выше, мы увидели, что интеграция доноров у самок происходит в основном в целевом локусе. В общем, мы ожидаем, что большинство событий, обнаруженных с помощью мобилизации w ⁺ , будут вставлены в целевой локус.

Требуется ли для таргетинга FLP?

Поскольку I-SceI разрезает с высокой эффективностью (3), мы предположили, что ген y ⁺ может быть легко высвобожден из хромосомы двумя разрезами I-SceI, а затем действовать как донор для преобразования эндогенного y. ¹ до y ⁺ .Мы построили конструкцию, аналогичную первой спасательной конструкции, но без FRT s (рис. 2 C ). Донорская вставка на хромосоме 3 была использована для обнаружения yellow rescue путем тестового скрещивания, как в предыдущем эксперименте (рис. 3). Мы не наблюдали событий нацеливания в 247 флаконах (таблица 1). Удивительно, но мух ⁺ были очень редки среди потомков w ⁺ (10 из 1154 из 22 подсчитанных флаконов = 0,9% от всего потомства w ⁺ ), хотя мы ожидали, что они будут вполне удовлетворительными. частые в результате иссечения и потери y ⁺ .Одно из возможных объяснений предполагает, что восстановление обрезанных концов хромосом очень неэффективно, и хотя нацеливание могло иметь место, эти клетки погибли из-за неспособности зафиксировать хромосомный DSB на донорском участке. В качестве альтернативы, восстановление DSB, созданного I-SceI, может быть чрезвычайно эффективным, так что оба сайта I-SceI редко могут быть разрезаны одновременно, что необходимо для создания внехромосомного донора.

Чтобы различить эти возможности, мы провели физический анализ резки на участках I-SceI.Личинок второй и третьей возрастных стадий подвергали тепловому шоку при 38 ° C в течение 1 ч, и геномную ДНК получали из образцов этих личинок в разное время после теплового шока. Мы расщепили геномную ДНК с помощью Eco RI (который разрезает один раз в пределах –) и после электрофоретического разделения и саузерн-блоттинга исследовали клон гена –, чтобы оценить частоту DSB в донорном элементе путем сканирования экспонированная пленка (рис. 5 A ). Небольшая часть донора (≈5%) наблюдалась как внехромосомная полоса размером 8 т.п.н. он должен был быть кольцевым, чтобы генерировать эту полноразмерную полосу после переваривания Eco RI, и маловероятно, что он будет участвовать в нацеливании.Вероятно, он был изготовлен путем двойной резки с последующим ремонтом, соединяющим два конца. Мы также оценили приблизительную долю доноров с DSB на каждом участке. Разрез на левом сайте будет генерировать фрагмент размером 6,3 т.п.н. разрез в правом сайте будет генерировать фрагмент размером 1,7 т.п.н. На пике резки, примерно через 4 часа после теплового шока, ≈30% донора демонстрировали DSB на левом участке и ≈5% на правом участке. Это предсказывает, что только 1-2% донорных элементов имеют два DSB одновременно. Чтобы подтвердить это, мы провели блоттинг и гибридизацию с непереваренной геномной ДНК из того же эксперимента (рис.5Б). Только ≈7% донора обнаруживается во внехромосомной линейной форме через 8 ч после теплового шока. Это не тот случай, когда внехромосомный донор был продуцирован и деградировал, потому что мы не наблюдали значительного уменьшения количества донорского гибридизирующего материала в ходе эксперимента. Таким образом, внехромосомный линейный донорный элемент редко был получен только разрезанием I-SceI, и на его пике только 2-7% донорного элемента присутствовали в этой форме.

Рисунок 5

Эффективность генерации доноров.Личинок, несущих донорские конструкции и 70I-SceI ( A и B ) или 70FLP и 70I-SceI ( C ), подвергали тепловому шоку при 38 ° C в течение 1 часа. Геномную ДНК получали в разное время после теплового шока (указано в часах над полосами). Этот эксперимент проводился со смесью личинок самцов и самок, гетерозиготных по донорному элементу: 60% общего сигнала yellow происходит от эндогенного гена yellow ; остальные 40% поступают от донора.( A ) Анализ DSB на сайтах I-SceI в конструкции «только для разрезания» (фиг. 2 C ). Геномную ДНК расщепляли Eco RI. Полоса 13,7 т.п.н. (самая большая полоса на геле) и полоса 6,1 т.п.н. продуцируются эндогенным геном y . Полоса при ≈12 т.п.н. является одной из полос хромосомных доноров, генерируемых расщеплением Eco RI (другая не видна на этом геле). Дублет размером 6,3 / 6,1 кб снова показан внизу с уменьшенной экспозицией. ( B ) Геномная ДНК личинок, несущих 70I-SceI и конструкцию только для разрезания, подвергали блоттингу без рестрикционного переваривания.Пленку переэкспонировали, чтобы визуализировать линейного донора размером 8,0 т.п.н., освобожденного в результате переваривания I-SceI. ( C ) Геномная ДНК личинок, несущих 70FLP и 70I-SceI , и спасательную конструкцию y с FRT (фиг. 2 A ) блоттинг , без рестрикционного переваривания. RC — расслабленный круг; 1CL, однопроходной линейный; 2CL, двояковыпуклый линейный; SC, суперспиральный круг. ( D ) Структуры эндогенного гена и и двух донорных конструкций.Все блоты зондировали зондом y размером 8 kb, обозначенным сплошной полосой под геном y . В спасательной конструкции один FRT добавляет ≈250 пар оснований. R, Eco RI; -HS, без теплового шока; MW, маркеры молекулярной массы.

Если неудача в достижении таргетинга с помощью конструкции cut-only возникла только потому, что этот конкретный донор неэффективно вырезан по сравнению с конструкциями с успешным таргетингом, кажется разумным ожидать, что таргетинг может быть успешным с использованием I-SceI, а не FLP, с y ⁺ разрушающая конструкция (рис.2 В ). Соответственно, мы протестировали доноров 5C и 6C разрушающей конструкции для нацеливания, используя только экспрессию I-SceI. Событий нацеливания не было получено в 232 флаконах (таблица 1), хотя мы ожидали> 60, если бы нацеливание происходило так же эффективно, как при использовании FLP с теми же донорами. Наиболее вероятно, что нацеливание не удается при использовании только I-SceI, потому что внехромосомный донор не продуцируется эффективно без FLP.

Чтобы проверить это более прямо, мы исследовали образование внехромосомного донора после экспрессии FLP и I-SceI у личинок, несущих первую спасательную конструкцию yellow (рис.2 А ). Путем саузерн-блоттинга геномной ДНК, полученной без дальнейшего расщепления, видно, что внехромосомная форма донора появляется быстро: в течение 2 часов большая часть донора обнаруживается вне хромосомы (рис. 5 C и другие результаты не показаны) в четырех диапазонах. Они, вероятно, представляют собой расслабленные круги, линейные формы с одинарным и двойным вырезом и сверхспиральные круги. Во все моменты времени, через 2 часа после теплового шока и позже, более 50% внехромосомного донора находится в линейной форме.Внехромосомные донорные молекулы, включая линейные формы, генерируются гораздо более эффективно с помощью FLP и I-SceI, чем только с помощью I-SceI. Наиболее вероятным объяснением неудачного таргетинга с использованием только экспрессии I-SceI является то, что сгенерированные I-SceI разрывы в хромосоме быстро и эффективно восстанавливаются, и что существует лишь небольшая вероятность того, что оба сайта будут разрезаны одновременно, чтобы освободить донора.

Наши результаты не исключают возможность того, что нацеливание может происходить только с помощью вырезания I-SceI, поскольку была обнаружена небольшая часть освобожденного донора.Но если это может произойти, очевидно, что это гораздо менее эффективный процесс, чем когда FLP используется для удаления донора из его хромосомного участка.

Обсуждение

Эти результаты демонстрируют, что нацеливание на концы гена может быть эффективно использовано для нокаута генов у D. melanogaster . В этой работе мы использовали тот же участок гомологичной ДНК y , который мы ранее использовали для нацеливания на концы y , и эффективность не сильно отличалась от полученной ранее.У самок конечное нацеливание на желтых происходило со скоростью ≈1 независимое событие в четырех-пяти флаконах или ≈1 на 500 гамет (3). В этой работе мы также наблюдали нацеливание со скоростью ≈1 на 5 флаконов, или ≈1 на 380 гамет с конструкцией разрушения концов, и со скоростью ≈1 на 16 флаконов, или ≈1 на 800 гамет, для конечная спасательная конструкция. Эти серии экспериментов не контролировались таким образом, чтобы позволить строгое сравнение частот с предыдущей работой, но они действительно демонстрируют, что нацеливание на конечные гены происходит с приемлемой частотой у Drosophila .Поскольку мы и другие исследователи (16, 20) показали, что нацеливание на конечные точки можно использовать для модификации локусов по всему геному, мы ожидаем, что нацеливание на конечные точки будет одинаково полезным.

В предыдущей попытке нацеливания на конечные точки Bellaiche et ​​al. (9) не смог восстановить события нацеливания на гены при скрининге на нарушение конца w ⁺ . Рассмотрение этой неудачи может дать полезную информацию об ограничениях на использование нацеливания на гены у Drosophila .По нашей оценке, наиболее существенное различие состоит в том, что Беллэйч и его коллеги решили управлять экспрессией FLP и I-SceI с помощью промотора β2-тубулина , промотора, специфичного для мужской зародышевой линии, который управляет транскрипцией в первичных сперматоцитах (21 ). Все наши предыдущие эксперименты показали более эффективное прицеливание у женщин, чем у мужчин (3, 16, 19), и это может быть частично причиной. Когда мы восстановили события таргетинга от самцов, эти события должны были произойти в митотических, а не мейотических клетках, потому что используемый нами промотор теплового шока ограничен в своей активности самыми ранними стадиями сперматогенеза (22, 23).Напротив, β2-tubulin -промотированная экспрессия FLP, по-видимому, является преимущественно постмейотической (24), а постмейотические сперматиды могут быть очень неблагоприятной средой для нацеливания.

Bellaiche и его коллеги также имели большой негомологичный участок ДНК на одном конце донорской ДНК, тогда как у нас этого не было. Но это не является значительным препятствием для эффективности нацеливания на дрожжи или ES-клетки мыши (ссылки 1 и 8 и К. Томас, личное сообщение). Таким образом, мы поддерживаем идею о том, что экспрессия рекомбиназы и эндонуклеазы в позднем сперматогенезе была главным образом ответственна за их неспособность достичь нацеливания.

В этой работе фенотип целевого гена был известен, но в большинстве случаев он не был известен. Нацеливание затем может быть обнаружено в тестовых скрещиваниях путем мобилизации маркерного гена, который вставлен в последовательности, гомологичные мишени (как в случае конструкции на фиг. 2 B ). Это также имеет то достоинство, что продуцируемый мутантный аллель отличается вставкой маркерного гена (рис. 1 A ). Это может быть очень желательно для отслеживания мутантного аллеля при скрещивании, но может вызывать нежелательные побочные эффекты в регуляции целевого локуса или его соседей.Одним из решений этой проблемы было применение сайт-специфической рекомбинации для удаления маркерного гена из хромосомы (25–28). На этом этапе можно использовать систему рекомбиназы Cre- lox (29), и для этой цели мы сконструировали нацеливающий вектор Drosophila , несущий сайтов loxP (неопубликованные данные).

Использование нацеливания на конечные точки, также называемого нацеливанием на замену или замену, обеспечивает значительные новые возможности для модификации генома Drosophila .Это дает очень прямой путь к генерации мутантного аллеля, за один шаг целевой ген может быть разрушен путем встраивания маркерного гена в его кодирующую область. Этапы клонирования относительно просты, потому что нет необходимости создавать точечные мутации в кодирующей последовательности гена, как это обычно бывает с нацеливанием на конец (хотя и не всегда: см. Ссылки 1 и 19). Конструирование доноров для удаления делеций также должно быть простым: сегменты ДНК, фланкирующие, но не включающие целевой ген, помещаются слева и справа от маркерного гена в донорской конструкции (1, 2, 30, 31).Затем при гомологичной рекомбинации целевой ген заменяется маркерным геном.

Одна из причин того, что конечное нацеливание является предпочтительным для ES-клеток мыши, заключается в том, что оно позволяет применять положительный – отрицательный отбор для обогащения нацеленными рекомбинантами (32). В дополнение к положительно селектируемому маркерному гену в области гомологичной мишени ( w ⁺ в нашей схеме) отрицательно селектируемый маркерный ген расположен вне гомологичной мишени ДНК. Случайная интеграция имеет тенденцию включать оба гена, но гомологичная рекомбинация исключает отрицательный маркер.Одновременное применение обоих вариантов значительно улучшает целевые события. Поскольку, по нашему опыту, большинство событий вставки донора в Drosophila являются целевыми, в этом нет необходимости. Однако метод положительно-отрицательного скрининга может быть использован для облегчения восстановления целевых событий у Drosophila . Один маркерный ген, вставленный в нацеливающую ДНК, можно использовать для отслеживания мобилизации этого сегмента, тогда как второй маркерный ген, расположенный за пределами FRT s, останется после FLP-опосредованного иссечения и будет маркировать донорскую хромосому.Разделение этих двух маркеров обеспечило бы простой скрининг для восстановления событий, в которых была транспонирована донорская ДНК. Большинство из них были бы законными целевыми событиями. Это похоже на метод, который мы использовали в эксперименте по спасению yellow , где мы проверили мобилизацию y ⁺ , обнаруженную по его сегрегации от w ⁺ .

Есть еще случаи, когда предпочтение может отдаваться целеуказанию. Процедуры завершения могут быть выполнены так, чтобы вся экзогенная ДНК была удалена из измененного локуса.После того, как тандемная дупликация генерируется исходным событием нацеливания (Fig. 1 A ), обычно сопровождаемое введением сконструированной мутации, между дублированными областями генерируется сайт-специфичный DSB. Ремонт DSB часто происходит с помощью механизма, который уменьшает дупликацию до одной копии целевого гена и устраняет промежуточный маркерный ген. Некоторые из этих событий редукции несут введенную мутацию. Введение специфических миссенс-изменений без изменения окружающей последовательности ДНК легко достигается с помощью этой процедуры аллельного замещения (16).Такие точные изменения могут быть полезны для исследования функции белков с конкретными аминокислотными заменами или для исключения определенного члена семейства транскриптов, подвергнутых альтернативному сплайсингу, без нарушения нормальной регуляции транскрипции. Есть также примеры в Drosophila , где один ген находится внутри интрона другого гена. В таких случаях может быть трудно использовать нацеливание на концы для создания нулевого аллеля одного гена, не влияя на регуляцию второго гена.

В целом, выбор между протоколом нацеливания на конечный результат или конечный результат должен производиться в каждом конкретном случае, с учетом таких переменных, как локальная генетическая структура, желаемый тип мутантного аллеля, скрещивания, используемые для анализа этих мутантов, и время, необходимое для различных типов нацеливания. Эта демонстрация нацеливания на конечные гены у мух предоставляет исследователям Drosophila такой выбор.

Благодарности

Мы благодарим Икан Ронга, Саймона Титена, Мэри Голич и Кейта Мэггерта за помощь и советы во время этой работы.Эта работа была поддержана грантами Национального института здоровья GM60700 и GM65604 и Институтом медицинских исследований Стоуэрса.

Сноски

• ↵ * Текущий адрес: Биологический факультет Университета Юты, 257 South 1400 East, Salt Lake City, UT 84112.

• ↵ † Кому следует адресовать корреспонденцию. Электронная почта: golic {at} biology.utah.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

Сокращения

DSB,

двухцепочечный разрыв;

FRT,

Мишень рекомбинации FLP

• Получено 14 августа 2002 г.
• Авторские права © 2003, Национальная академия наук Рассказчики

  «Класс Рассказчиков». Изображение любезно предоставлено Ghost Foundation и OPEN FIELD

  Некоммерческая некоммерческая организация OPEN FIELD является одним из соучредителей и основных партнеров «Призрак: 2561», серии видео и перформанс-арт, куратором которой является нью-йоркский художник Коракрит Арунанондчай в Бангкоке, Таиланд. Фонд.Основанный в этом году с миссией поддержки образования в области современной культуры как средства развития общества, фонд использует различные подходы, такие как гранты на исследования, сотрудничество, спонсорство и стипендии. Для своего первого проекта OPEN FIELD организовала месячную образовательную программу в рамках подготовки к открытию «Призрака».

  Коракрит Арунанондчай в «Классе рассказчиков». Изображение любезно предоставлено Ghost Foundation и OPEN FIELD

  
  Школа называется «Класс рассказчиков», и как предшественник, программа провела серию уроков по различным темам, важным для многих дискуссий в современном искусстве, таких как эффекты ИИ. о человеческом обществе и цифровом сознании, и он обучил студентов живым рассказчикам, которые будут присутствовать на площадках по всему Бангкоку, чтобы рассказывать о произведениях искусства на различных выставках, включая «Призрак.Рассказчики эффективно заменят дидактические настенные тексты, обычно встречающиеся в художественных музеях, которые фиксируют значение и контекст произведения искусства на основе собственных повествовательных приоритетов учреждения. Рассказчики могут не просто рассказывать факты об искусстве, они могут переплетать свои собственные воспоминания или истории с критическим взглядом на работу художника, создавая опыт, который одновременно является конкретным и непредсказуемым.

  Коракрит Арунанондчай в «Классе рассказчиков». Изображение любезно предоставлено Ghost Foundation и OPEN FIELD

  Основатели OPEN FIELD ранее основали известную Бангкокскую городскую галерею в 2015 году, которая также является одним из основных мест проведения выставок и мероприятий «Призрак: 2561».В 2017 году в галерее прошла персональная выставка одного из участников «Призрака», Чулаярннона Сирипхола, художника и режиссера, который недавно представил фрагмент для фильма-антологии «10 лет Таиланда», который в этом году прошел специальный показ в Каннах, а также показанные части были сняты тайскими режиссерами Апичатпонгом Вирасетакул (который дебютирует в новом видео на «Призраке»), Адитья Ассарат и Визит Сасанатиенг. В 2016 году Арунанондчай провел там персональную выставку в рамках своей серии фильмов «Рисование историей в комнате, заполненной людьми со смешными именами.”

  Создав« Призрак: 2561 », фонд надеется разработать публичную платформу для обсуждения современных проблем с помощью видео и перформанса, а также создать новые инициативы в других областях.

  Коракрит Арунанондчай в «Классе рассказчиков». Изображение любезно предоставлено Ghost Foundation и OPEN FIELD

  
  «Призрак: 2561» проходит с 11 по 28 октября в нескольких залах Бангкока.

  Подробнее о концепции мероприятия и его артистах читайте в нашем интервью с куратором Ghost, художником Коракритом Арунанондчай.

  Соединенные Штаты и Бразильская империя в эпоху »Роберто Саба

  Название степени

  доктор философских наук

  Первый советник

  Стивен Хан

  Аннотация

  Эта диссертация прослеживает триумф свободного труда в двух крупнейших рабовладельческих обществах западного мира девятнадцатого века: Соединенных Штатах и ​​Бразилии.Опираясь на ряд первоисточников из американских и бразильских архивов, он реконструирует интенсивную циркуляцию транснациональных агентов между этими двумя странами с 1840-х по 1880-е годы. Он показывает, как эти обмены трансформировали политическую экономику обеих стран: в то время как Бразилия привлекла американский капитал и опыт, чтобы модернизировать свою экономическую структуру и осуществить плавный переход от рабского труда к свободному; Соединенные Штаты воспользовались возможностью инвестировать, развивать и поощрять бесплатную рабочую силу в Бразилии, которая долгое время находилась под влиянием Британской империи.

  Каким бы важным ни было рабство движимого имущества для мировой экономики девятнадцатого века, коалиция американских и бразильских реформаторов предложила заменить его еще более эффективной и прибыльной системой труда. В эту транснациональную группу сторонников бесплатного труда входили, среди прочего, активисты, дипломаты, инженеры, предприниматели, журналисты, торговцы, миссионеры, плантаторы, политики, ученые, студенты. Работая вместе, они продвигали трудосберегающее оборудование, новые транспортные технологии, научный менеджмент и техническое образование.По их мнению, эти улучшения помогут бразильским и американским капиталистам использовать потенциал коренных жителей, а также свободных от иммигрантов рабочих для расширения производства и торговли.

  В этой работе делается вывод о том, что к концу XIX века свободный труд укрепил капитализм в Бразилии и Соединенных Штатах, сделав американских промышленников и бразильских плантаторов более могущественными, чем когда-либо прежде. Следовательно, ни в Соединенных Штатах, ни в Бразилии торжество свободного труда не привело к продвижению социальной справедливости.Фактически, с самого начала своей кампании сторонники бесплатного труда поддерживали крупных капиталистов: их цель состояла в том, чтобы сконцентрировать капитал, разрушить традиционный образ жизни и контролировать высокомобильных рабочих. Свободный труд означал устранение рабства и в то же время усиление пролетаризации.

  Рекомендуемое цитирование

  Саба, Роберто, «Американское зеркало: Соединенные Штаты и Бразильская империя в эпоху эмансипации» (2017). Общедоступные диссертации Пенсильвании .2561.
  https://repository.upenn.edu/edissertations/2561

  Файлы размером более 3 МБ могут открываться медленно. Для достижения наилучших результатов щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить как …»

  СКАЧАТЬ

  С 26 февраля 2018 г.

  МОНЕТЫ

  Перспективное массовое производство потенциально безвредного заменителя бисфенола А из лигниновой платформы из твердых пород древесины

  Для возобновляемого 4- n -пропилсирингола (PS), основного продукта каталитического гидрогенолиза (природной) древесины лиственных пород, установлена ​​полная цепочка валоризации лигнина в химические вещества — от древесины твердых пород над биссиринголами до ароматических полиэфиров (APE). лигнин.Для этого из древесины березы с помощью восстановительного каталитического фракционирования (RCF) был получен ПС реактивной чистоты и выделен с выходом 34 мас.% В пересчете на лигнин. Дополнительные теоретические расчеты на ранних стадиях, основанные как на относительной летучести ( α ), так и на сопротивлении дистилляции ( Ω ), а также на моделировании Aspen Plus®, предсказывают, что выделение PS посредством дистилляции экономически целесообразно в промышленных масштабах ( 85–95 долларов США за тонну пропилфенолов при 200–400 кт по шкале ^-1 ).Последующая стехиометрическая кислотно-катализируемая конденсация с формальдегидом обнаруживает удивительно высокую селективность 92 мас.% По отношению к димеру 3,3′-метиленбис (4- n -пропилсирингол) ( m , m ‘-BSF-4P), что выделяется с чистотой> 99% простой одностадийной кристаллизацией. Поразительная селективность димера приписывается синергетическому взаимодействию между активирующими метоксигруппами и пропильной цепью, ингибирующей олигомеризацию. Затем был проведен анализ in vitro рецептора эстрогена человека α (hERα), чтобы гарантировать безопасный (r) химический дизайн.Биссирингильный каркас демонстрирует пониженную активность (сродство в ~ 19–45 раз ниже, чем сродство бисфенола А) и меньшую эффективность (~ 36–45% от максимальной активности BPA). Наконец, чтобы оценить функциональность безопасного (r) биссиринголового каркаса, его превратили в APE. APE отображает M _w = 43,0 кДа, M _n = 24,4 кДа, T _г = 157 ° C и T % % 90 = 345 ° С.