Буфер колонки. Колонки буфер: особенности, виды и применение в хроматографии

Что такое буфер колонки в хроматографии. Какие основные виды буферов используются. Как правильно подобрать буфер для хроматографической колонки. На что влияет буфер при хроматографическом разделении.

Что такое буфер колонки в хроматографии

Буфер колонки в хроматографии — это раствор, который используется для уравновешивания и промывки хроматографической колонки перед нанесением образца и в процессе разделения веществ. Основные функции буфера колонки:

• Создание оптимальных условий pH и ионной силы для разделения компонентов смеси
• Стабилизация неподвижной фазы колонки
• Удаление примесей и загрязнений с колонки
• Элюирование связавшихся с колонкой веществ

Правильный выбор состава и характеристик буфера колонки критически важен для эффективного хроматографического разделения. От буфера зависят селективность разделения, разрешение пиков, время удерживания компонентов и другие параметры хроматографического процесса.

Основные виды буферов для хроматографических колонок

В хроматографии используются различные типы буферных растворов в зависимости от метода разделения и свойств анализируемых веществ. Основные виды буферов колонок:

1. Фосфатные буферы

Фосфатные буферы широко применяются в хроматографии благодаря хорошей буферной емкости в диапазоне pH 6.0-8.0. Обычно используют натрий-фосфатные или калий-фосфатные буферы. Преимущества:

• Высокая буферная емкость
• Совместимость с большинством белков
• Низкое поглощение в УФ-области

2. Трис-буферы

Трис-буферы (на основе трис(гидроксиметил)аминометана) эффективны в диапазоне pH 7.0-9.0. Используются для разделения белков и нуклеиновых кислот. Особенности:

• Хорошая буферная емкость при физиологических pH
• Низкая стоимость
• Возможность осаждения с некоторыми ионами металлов

3. Ацетатные буферы

Ацетатные буферы применяются в кислой области pH 3.8-5.8. Часто используются в ионообменной и гидрофобной хроматографии. Характеристики:

• Хорошая буферная емкость в кислой среде
• Летучесть (удобно для масс-спектрометрии)
• Совместимость с большинством белков

Как выбрать оптимальный буфер для хроматографической колонки

При выборе буфера для хроматографической колонки необходимо учитывать несколько важных факторов:

1. Тип хроматографического метода

Для каждого метода хроматографии (ионообменная, гидрофобная, аффинная и т.д.) оптимальны свои типы буферов. Например:

• Ионообменная хроматография — буферы с низкой ионной силой
• Гидрофобная хроматография — буферы с высокой ионной силой
• Аффинная хроматография — физиологические буферы

2. Свойства разделяемых веществ

Буфер должен сохранять нативную структуру и активность анализируемых соединений. Важно учитывать:

• Оптимальный диапазон pH для стабильности веществ
• Совместимость с функциональными группами молекул
• Предотвращение денатурации белков

3. Характеристики сорбента колонки

Буфер не должен повреждать материал сорбента и изменять его свойства. Необходимо принимать во внимание:

• Химическую стойкость сорбента
• Рабочий диапазон pH колонки
• Совместимость с функциональными группами сорбента

Влияние буфера на эффективность хроматографического разделения

Состав и свойства буфера колонки оказывают существенное влияние на результаты хроматографического анализа:

1. Селективность разделения

От pH и ионной силы буфера зависит селективность разделения компонентов смеси. Изменяя эти параметры, можно добиться лучшего разрешения близких по свойствам веществ.

2. Время удерживания

Буфер влияет на силу взаимодействия веществ с неподвижной фазой, что определяет время их удерживания в колонке. Регулируя состав буфера, можно оптимизировать продолжительность анализа.

3. Форма и симметрия пиков

Правильно подобранный буфер обеспечивает симметричную форму хроматографических пиков. Это улучшает точность количественного определения веществ.

4. Эффективность колонки

Буфер влияет на число теоретических тарелок колонки. Оптимальный буфер позволяет достичь максимальной эффективности разделения.

Особенности приготовления и хранения буферов для хроматографии

При работе с буферами для хроматографических колонок необходимо соблюдать определенные правила:

1. Чистота реактивов

Для приготовления буферов следует использовать реактивы высокой степени чистоты, чтобы избежать загрязнения колонки. Рекомендуется применять:

• Деионизованную или бидистиллированную воду
• Реактивы квалификации «для хроматографии»
• Фильтрацию готовых растворов

2. Контроль pH

Точное значение pH критически важно для воспроизводимости результатов. Необходимо:

• Использовать калиброванный pH-метр
• Проверять pH после разбавления концентрированных буферов
• Учитывать температурную зависимость pH некоторых буферов

3. Условия хранения

Для сохранения свойств буферных растворов важно соблюдать правила хранения:

• Хранить в холодильнике (2-8°C) в плотно закрытой посуде
• Избегать многократных циклов замораживания-оттаивания
• Контролировать сроки годности растворов

Современные тенденции в разработке буферов для хроматографии

Развитие хроматографических методов стимулирует создание новых типов буферов с улучшенными характеристиками:

1. Биосовместимые буферы

Разрабатываются буферные системы, максимально приближенные по составу к физиологическим жидкостям. Это позволяет сохранять нативную структуру биомолекул в процессе анализа.

2. Буферы для масс-спектрометрии

Создаются летучие буферные системы, совместимые с масс-спектрометрическим детектированием. Они не образуют ионных аддуктов и не подавляют ионизацию аналитов.

3. Градиентные буферы

Разрабатываются буферные системы для создания сложных многокомпонентных градиентов. Это позволяет тонко регулировать селективность разделения в процессе анализа.

Заключение

Буфер колонки играет ключевую роль в хроматографическом анализе, определяя эффективность и селективность разделения веществ. Правильный выбор состава и свойств буфера позволяет оптимизировать условия хроматографии для решения конкретных аналитических задач. Развитие технологий создания новых буферных систем открывает дополнительные возможности для совершенствования хроматографических методов.

Колонки буфер

Прежде чем купить колонки для компьютера, необходимо обратить на особо важные параметры модели. Говоря об акустике, всегда нужно учитывать эти основные показатели:. От материала изготовления корпуса во многом зависит чистота звучания. Колонки активные чаще всего изготавливаются из дерева, потому что звук хорошо отражается от стенок и исключает помехи. Купить компьютерные колонки также можно из МДФ, металла, стекла или пластика.

Поиск данных по Вашему запросу:

Схемы, справочники, даташиты:

Прайс-листы, цены:

Обсуждения, статьи, мануалы:

Дождитесь окончания поиска во всех базах.

По завершению появится ссылка для доступа к найденным материалам.

Содержание:

• сабвуфер работает а колонки нет
• Акустические системы в Украине — буфер
• Акустические системы и колонки
• Компьютерная акустика
• Компьютерные колонки
• Акустика (колонки)
• Колонки в Алматы

ПОСМОТРИТЕ ВИДЕО ПО ТЕМЕ: Акустика DNS при включении гудит / РЕМОНТ

сабвуфер работает а колонки нет

Некачественный звук, нет баса, не работает сабвуфер Добрый день! Подскажите пожалуйста, не работает сабвуфер, не басит а пещит, аналогично при Как подключить колонки и сабвуфер Здравствуйте. Подскажите пожалуйста как подключить две колонки и саб вуфер к компьютеру? Новые колонки — сабвуфер гремит даже если немного прибавишь Здравствуйте , помогите пожалуста! Купила калонки с сабвуфером, работают, только вот сабвуфер гремит Конечно, я понимаю, что надо покупать обе вещи для отличного звука, но все же Нет звука, красный крест у значка и не работает не одно гнездо пробывал и колонки и наушники Заходил в диспетчер устройств там только микрофон, во вкладке звук пишет- звуковые устройства не Не работает сабвуфер в системе 2.

Сабвуфер к компу подключается через один 3. Не работает сабвуфер в системе 5. Нужна помощь. У меня есть система 5. Материнская плата: asus Microlab ma 4. В один прекрасный день ни с того ни с сего перестал работать сабвуфер. Блоги программистов и сисадминов. Vkontakte ,. Facebook , Twitter. Тесты Блоги Социальные группы Все разделы прочитаны.

Просмотров Ответов 7. Метки нет Все метки. Что делать? QA Эксперт. Возможно динамики перегорели. Проверить легко — подключить батарейку на полтора вольта — если есть челчок, значит хорошие. А усилитель может выйти из строя по причине большой громкости, перегрев тоже может быть причиной.

Не исключены помехи в сети — импульсом пробило усилитель. Но нам не известно что и как, поэтому трудно точно сказать. Answers Эксперт. Опции темы. Реклама — Обратная связь. Регистрация Восстановить пароль. Все разделы прочитаны.

Ответов 7 Метки нет Все метки всегда все работало хорошо и внезапно перестала работать одна колонка,на следующий день другая отказала,я в недоумении,сабвуфер работает,а колонки нет. Ответы с готовыми решениями: Некачественный звук, нет баса, не работает сабвуфер Добрый день! Искать еще темы с ответами Или воспользуйтесь поиском по форуму:.

КиберФорум — форум программистов, компьютерный форум, программирование.

Акустические системы в Украине — буфер

Компьютеры без монитора Компьютеры с монитором Неттопы. Все ноутбуки Ноутбуки для офиса Мультимедийные ноутбуки Игровые ноутбуки. Кронштейны и крепления. Проекторы Экраны проекционные Лампы для проекторов. USB flash-накопители Карты памяти. Антивирусные программы Операционные системы Офисные программы Подписки.

➤【КОЛОНКИ 】Закажите дешево прямо Сейчас — потому что Сегодня БЕСПЛАТНО ➤【Купить】лучшие модели Недорогие цены и скидки.

Акустические системы и колонки

Низкие звуковые частоты плохо локализуются, то есть человеку сложнее определить, откуда идёт звук и, исходя из этого, — в многополосной аудиосистеме можно сделать одну большую низкочастотную колонку на всю систему, а в остальных колонках » сателлиты » держать лишь средне- и высокочастотные динамики. Это делает акустическую систему более компактной, уменьшает стоимость и позволяет поместить громоздкий и вибрирующий сабвуфер в место, где он не будет мешать например, под стол. Кроме того, подбирая подходящее место для сабвуфера, можно попытаться погасить низкочастотные стоячие волны , неизбежно возникающие в небольшом замкнутом помещении. Сабвуфер обычно применяется в системах, рассчитанных на просмотр современных насыщенных спецэффектами фильмов см. На стыке АЧХ может быть как провал, так и завышение уровня из-за несоответствия частотного диапазона или интерференции волн с разным фазовым сдвигом. Поэтому на некоторых сабвуферах существует возможность подстройки его верхней граничной частоты и фазы. Активный сабвуфер имеет встроенный усилитель мощности который позволяет снять низкочастотную нагрузку с усилителя и активный кроссовер, что позволяет отфильтровывать высокие частоты, упрощает согласование сабвуфера с широкополосными акустическими системами. Может получать сигнал линейного уровня с уже удаленными ВЧ с отдельного канала источника.

Компьютерная акустика

Грудки Сегодня Хотите продавать быстрее? Узнать как. Фастов Вчера Радча 10 окт.

Некачественный звук, нет баса, не работает сабвуфер Добрый день! Подскажите пожалуйста, не работает сабвуфер, не басит а пещит, аналогично при

Компьютерные колонки

Лидеры продаж. Дай ПЯТЬ добру! Скидки на посуду. Скидки на планшеты. Лучшие предложения из мира гейминга! Предзаказ Xiaomi Redmi Note 8.

Акустика (колонки)

Хотите продавать быстрее? Узнать как. Темиртау Сегодня Караганда, Казыбекбийский район Вчера Алматы, Ауэзовский район 11 окт.

В KNS можно купить колонка Микролаб в кредит онлайн. Клубная цена. Купить. черные {, 2 колонки+сабвуфер дерево черные, 12Wx2 + 16W RMS }.

Колонки в Алматы

Колонки, акустика в широком ассортименте! JBL Charge 4 — погрузи колонку в воду! Устал от музыки с проводами и розетками? JBL Xtreme 2 — почувствуй глубину звука!

Лидеры продаж. Дай ПЯТЬ добру! Скидки на посуду. Скидки на планшеты.

Пытаться с лету подобрать себе компьютерные колонки по техническим характеристикам — прямой путь к тому, чтобы ощутить себя слегка неполноценным.

Музыкальные колонки — это не просто дополнение к вашему компьютеру. Не зависимо от того, какую музыку вы предпочитаете слушать, она всегда помогает вам расслабиться и насладиться звучанием любимых мелодий. А уж если вы и соседей любите приобщать к прекрасному — тогда к выбору колонок нужно отнестись с максимальной серьезностью. Колонки для компьютера по размерам чуть меньше, чем обычные колонки, а еще они оснащены специальным изолированным магнитным полем и наличие этих характеристик несколько снижает качество звучания. Компьютерные колонки можно поделить на активные и пассивные. Пассивные устройства по ценовой категории стоят дешевле, но вот качество воспроизведения звука у них не очень хорошее.

Запорожье, Днепровский 11 окт. Запорожье, Шевченковский Вчера Харьков, Киевский 11 окт.

Буфер колонка в Сыктывкаре: 500-товаров: бесплатная доставка [перейти]

Партнерская программаПомощь

Сыктывкар

Каталог

Каталог Товаров

Одежда и обувь

Одежда и обувь

Стройматериалы

Стройматериалы

Здоровье и красота

Здоровье и красота

Текстиль и кожа

Текстиль и кожа

Электротехника

Электротехника

Детские товары

Детские товары

Продукты и напитки

Продукты и напитки

Дом и сад

Дом и сад

Вода, газ и тепло

Вода, газ и тепло

Мебель и интерьер

Мебель и интерьер

Сельское хозяйство

Сельское хозяйство

Все категории

ВходИзбранное

Буфер колонка

Буфер рулевой колонки Heli CPCD15 Номер детали: CPCD15

ПОДРОБНЕЕЕще цены и похожие товары

19 245

Потолочная подвесная Gallo Acoustics A’Diva Single Droplet Sky Blue + black cable (GA1SBDROP) Тип:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

19 245

Потолочная подвесная Gallo Acoustics A’Diva Single Droplet Race Red + black cable (GA1RRDROP) Тип:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

19 245

Потолочная подвесная Gallo Acoustics A’Diva Single Droplet Urban Grey + black cable (GA1UGDROP)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

13 195

Потолочная подвесная Gallo Acoustics Micro Single Droplet Urban Grey + black cable (GM1UGDROP) Тип:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

13 195

Потолочная подвесная Gallo Acoustics Micro Single Droplet Race Red + black cable (GM1RRDROP) Тип:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

14 845

Потолочная подвесная Gallo Acoustics Micro Single Droplet Bronze + black cable (GM1BRDROP) Тип:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

31 400

Портативная музыкальная колонка «Звуковая бомба» Цвет: чёрный (black), Вес: 3. 2, Высота: 29.2

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

36 530

Мини топливораздаточная колонка Piusi CUBE 56, 220 В, 56 л/мин Страна производитель: Италия, Вид

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

39 462

Мобильные топливораздаточные колонки Benza 23-220-93Р, 93 л.мин 24 В Страна производитель: Россия,

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h24 (оранжевый)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

60 768

Блок насосный «КВАНТ-БН-31х», 50л/мин, 380 В, для дизельного топлива, бензина Страна производитель:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h50 (бирюзовый)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h51 (синий)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

63 304

Мобильная топливораздаточная колонка для дизельного топлива Piusi CUBE 90 K44, 90 л/мин, 220 В

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h41 (хаки)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar A7 (бордовый)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

24 884

Мобильные топливораздаточные колонки Benza 24-12-40Р, 40 л. мин 12 В Страна производитель: Россия,

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

93 470

Мобильные топливораздаточные колонки Benza 24-12-80ППО25Р, 80 л.мин 12 В Страна производитель:

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h56 (красный)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h56 (черный)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar T9 (синий)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

66 850

Топливораздаточная колонка Benza 25-220-93Р, мобильная ТРК для дизельного топлива, 77 л/мин, 220 В

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar P16 (красный)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

1 998

9690

Колонка Hopestar h37 (красный)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

122 580

Колонка топливораздаточная Квант 101-11-11, 50 л/мин, 380В Страна производитель: Россия, Вид

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

18 550

Газовая колонка Ariston FAST EVO 11 B Вид водонагревателя: Газовая колонка, Серия товара: FAST EVO,

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

Колонка Hopestar h50 (темно синий)

В МАГАЗИНЕще цены и похожие товары

2 страница из 18

Пересчет координат (МСК, СК 63, СК 64, СК 47, WGS 84, ПЗ 90) онлайн

Пересчет координат (МСК, СК 63, СК 64, СК 47, WGS 84, ПЗ 90) онлайн — GeoBridge

Ручной ввод каталога координат

Введите координаты в текстовое окно «N,E исходные» через запятую.

Загрузка каталога координат из таблицы

Скопируйте 2 колонки с координатами из таблицы (например Excel) и вставьте их в окно «N,E исходные». При этом табуляция разделяющая колонки с координатами будет автоматически заменена на запятую.
Подойдет любая таблица, главное чтобы разделителем колонок была «табуляция», а разделителем строк «перевод строки».

Загрузка каталога координат из AutoCad

Выделите объекты в AutoCad координаты которых хотите пересчитать.
В командной строке введите _list и нажмите Enter.
Скопируйте каталог из появившегося окна и вставьте его в окно «N,E исходные».
После этого необходимо нажать кнопку     чтобы поменять координаты местами.

---

Внимание! Данный сервис создан для определения приблизительного местоположения точек в различных системах координат. Результаты пересчета нельзя использовать в геодезических работах любого вида.

MapBasic.RU

Утилиты и параметры для ГИС MapInfo http://mapbasic.ru/

{{ ucs.source.title }}

{{ ucs.target.title }}

N,E — исходные       г. ггг    г°м’с»

N,E — результат        

Разделитель целой и дробной части «точка». Разделитель между координатами «запятая».

градусы (десятичные)

---

градусы

минуты

секунды

 {{ tr.str }}

---

Зона СК-1942:	{{ tr. zone42 }}
Осевой меридиан:	{{ tr.osm }}°

#	N	E	N	E
{{ $index + 1 }}	{{ t.SourceNorth }}	{{ t.SourceEast }}	{{ t.TargetNorth }}	{{ t.TargetEast }}

   

ссылка на контур: {{ contour. title }}

Копировать данные

---

Копировать в AutoCad:
точками     полилинией

Копировать таблицу:
как есть     реверс N,E

Только результат:
как есть     реверс N,E

KML (полигон):
исходные     результат
исходные R     результат R

Комментарии для сайта Cackle

Как пополнить базу проекций?

Если вы не нашли требуемую систему координат в списке проекций, мы можем ее создать.

Для этого необходимо прислать 4-6 точек в исходной системе и любой другой из списка (в идеале СК-1942, СК-95 или WGS84).

Если у вас уже есть параметры пересчета, то такие данные мы добавим значительно быстрей.

[email protected]

— Выделите содержимое текстового окна (Ctrl+A).

— Скопируйте его в буфер обмена (Ctrl+C).

— Для того что бы отобразить данные в AutoCAD (или другой совместимой системе) поместите курсор в командную строку и нажмите сочетание клавиш Ctrl-V.

— При этом важно чтобы курсор мыши находился в пределах командной строки.

 

Разделитель: табуляция   ;   ,  

Общее число проекций {{ ucses.length }}.    пополнить базу

{{ u.title }}

Проекции пользователей

Общее число проекций {{ ucses.length }}.    пополнить базу

{{ u.title }}

Проекции пользователей

Если вы не нашли требуемую систему координат в списке проекций, мы можем ее создать.

Для этого необходимо прислать 4-6 точек в исходной системе и любой другой из списка (в идеале СК-1942, СК-1963 или WGS84).

Если у вас уже есть параметры пересчета, то такие данные мы добавим значительно быстрей.

[email protected]

Принципы жидкостной хроматографии | Bio-Rad

Независимо от используемых взаимодействий жидкостная колоночная хроматография проводится в шесть этапов:

• Уравновешивание колонки
• Загрузка образца
• Стирка
• Элюция
• Окончательная промывка колонки
• Регенерация колонки

Уравновешивание колонки

Большинство протоколов жидкостной хроматографии начинаются с этапа уравновешивания смолы. Через колонку пропускают буфер, совместимый с интересующим белком и выбранной смолой. Обычной практикой является уравновешивание колонки 5–10 объемами колонки (CV) уравновешивающего буфера.

Например, связывание белков с гидрофобными смолами наиболее эффективно при высокой ионной силе. Поэтому перед нанесением образца смола уравновешивается в буфере с высокой ионной силой.

Свойства интересующего белка также учитываются при выборе уравновешивающего буфера, поскольку такие факторы буфера, как ионная сила, ограничиваются стабильностью белка; как правило, следует избегать уравновешивающих буферных условий, которые денатурируют интересующий белок или предотвращают его взаимодействие со стационарной фазой.

Загрузка образца

После уравновешивания образец загружается в колонку. Образец обычно загружают в буфер того же состава, что и уравновешивающий буфер, чтобы максимизировать взаимодействие белка со стационарной фазой.

Проба может быть загружена вручную или с помощью насоса для проб. Некоторые типы хроматографии ограничивают объем образца, который можно загрузить в колонку. Еще одним важным соображением при загрузке образца является то, что большинство смол имеют конечную способность связывать белок; перегрузка колонки из-за слишком большого количества пробы может отрицательно сказаться на разделении.

Промывка колонки

После иммобилизации белков на стационарной фазе белки, которые слабо или неспецифически взаимодействуют со смолой, удаляют путем промывки колонки несколькими объемами колонки промывочного буфера. Этот промывочный буфер может иметь тот же состав, что и уравновешивающий буфер, или содержать компоненты, нарушающие слабые специфические взаимодействия.

Например, аффинная хроматография с иммобилизованным металлом (IMAC) позволяет элюировать белки, связанные со смолой, с высокой концентрацией иммидазола. Общепринятой практикой является использование промывочного буфера, который включает промежуточную концентрацию иммидазола для удаления загрязняющих белков, которые слабо связаны со смолой.

Колонку промывают до тех пор, пока в элюате не перестанет обнаруживаться белок. При использовании хроматографической системы с УФ-детектором колонку промывают до тех пор, пока показания поглощения при 280 нм не вернутся к базовой линии.

Элюция образца

После того, как все неспецифически и слабо взаимодействующие белки были смыты со смолы, белки, которые сильно взаимодействуют со смолой, элюируются из колонки путем изменения состава буфера, пропускаемого через смолу.

В ионообменной хроматографии белки элюируют буферами с высокой ионной силой или с изменением рН, чтобы разрушить электростатические взаимодействия, которые иммобилизовали интересующий белок. Белки, связанные со смолой гидрофобного взаимодействия, наоборот, элюируются за счет снижения ионной силы буфера. В аффинной хроматографии белки обычно элюируют с колонки путем введения конкурирующего лиганда или расщепления аффинной метки, а также могут элюироваться с использованием буферов с высоким содержанием солей или путем изменения рН. Другие протоколы элюции могут включать смешивание растворителей различной полярности для настройки растворимости каждого компонента в подвижной фазе.

Рис. 3: Пример диаграммы состава буфера для протоколов изократического (вверху) и градиентного (внизу) элюирования.

Условия элюирования могут быть изменены либо линейным градиентом, либо ступенчатым образом. Часто протокол градиентной элюции , в котором состав подвижной фазы изменяется линейно во времени, выбирается для определения профиля элюции и концентрации элюирующего буфера, при которой интересующий белок высвобождается из смолы. Как только эта концентрация была определена, для экономии времени 9Протокол изократической элюции 0048 , в котором состав подвижной фазы постоянен на каждом этапе, может быть разработан для будущих очисток.

Примечание : Эксклюзионная хроматография не требует замены буфера, поскольку она не зависит от специфических взаимодействий между подвижной и неподвижной фазами. Настоящих стадий промывки и элюирования нет, поскольку ЭХ основана исключительно на том факте, что большие молекулы задерживаются пористыми шариками, тогда как маленькие молекулы проходят через смолу с минимальным взаимодействием со смолой.

Окончательная промывка колонки

После элюирования интересующего белка со смолы любые белки, которые остаются связанными со смолой, элюируют путем увеличения концентрации элюирующего буфера. Этот шаг позволяет повторно использовать столбцы для будущих разделений.

Регенерация колонки

После удаления оставшихся соединений, связанных со средой, колонка либо насыщается уравновешивающим буфером для последующего повторного использования, либо заполняется буфером для хранения.

Вернуться к началу

Обзор Affinity Purification | Thermo Fisher Scientific

Для обогащения или очистки интересующего белка от других белков и компонентов в неочищенном клеточном лизате или другом образце используются различные методы. Наиболее мощным из этих методов является аффинная хроматография, также называемая аффинной очисткой, при которой интересующий белок очищается благодаря его специфическим свойствам связывания с иммобилизованным лигандом.

---

Содержание страницы

• ВВЕДЕНИЕ
• Твердая поддержка для очистки аффинной
• Типы сродства очистки

Просмотр и избранные продукты

• Desalting Columns
• Ионообменные колонны
• . Очистка белков

Белки и другие представляющие интерес макромолекулы могут быть очищены из неочищенных экстрактов или других сложных смесей различными методами. Селективное осаждение, пожалуй, самый простой метод отделения макромолекул одного типа от другого.

 Однако большинство методов очистки включают ту или иную форму хроматографии, при которой молекулы в растворе (подвижная фаза) разделяются на основе различий в химическом или физическом взаимодействии с неподвижным материалом (твердая фаза). Гель-фильтрация (также называемая эксклюзионной хроматографией или SEC) использует пористый полимерный материал для разделения молекул по размеру (т. е. физического исключения). В ионообменной хроматографии молекулы разделяются в зависимости от силы их общего ионного взаимодействия с твердофазным материалом (т. е. неспецифических взаимодействий).

Напротив, аффинная хроматография (также называемая аффинной очисткой) использует специфические связывающие взаимодействия между молекулами. Конкретный лиганд химически иммобилизуют или «связывают» с твердой подложкой, так что при пропускании сложной смеси через колонку связываются те молекулы, которые обладают специфическим связывающим сродством к лиганду. После вымывания других компонентов образца связанная молекула отщепляется от носителя, что приводит к ее очистке от исходного образца.

Каждая конкретная система родства требует своего собственного набора условий и ставит свои особые задачи для данной исследовательской цели. Другие статьи о белковых методах описывают факторы и условия, связанные с конкретными системами очистки (см. ссылки на боковой панели в конце этой страницы). Тем не менее, общие принципы одинаковы для всех систем связывания лиганд-мишень, и эти концепции находятся в центре внимания этого обзора.

Узнать больше

• Гель-фильтрация (обессоливание)
• Центр поддержки очистки белков
• Технический совет № 49: Очистка белков ацетоном

---

Справочник по приготовлению белков

В этом 32-страничном справочнике содержится полезная информация о нашем широком ассортименте реагентов и инструментов для выделения, очистки, иммунопреципитации и очистки белков. Практическая информация, руководства по выбору и соответствующие данные включены, чтобы помочь вам улучшить выход белка и дальнейший анализ.

Специфические темы, охватываемые следующими:

• Лизис и фракционирование клеток
• Белковой диализ и другие методы очистки
• Иммунопреципитация и анализы распада
• Другие методы для белкового препарата

Загрузка Протеиновой подготовки

67

Загрузка Протеина. Как работает аффинная очистка

Аффинная очистка обычно включает следующие этапы:

1. Инкубируйте неочищенный образец (например, клеточный лизат, супернатант клеточной культуры или сыворотку) с аффинной поддержкой, чтобы молекула-мишень в образце могла связать с иммобилизованным лигандом.
2. Смыть несвязанные компоненты образца с подложки, используя соответствующие буферы, поддерживающие связывающее взаимодействие между мишенью и лигандом.
3. Элюируют (диссоциируют и извлекают) молекулу-мишень из иммобилизованного лиганда, изменяя условия буфера таким образом, чтобы больше не происходило связывающего взаимодействия.

Мелкомасштабная аффинная очистка с использованием антител, иммобилизованных на твердом носителе.  Хроматография состоит из трех основных компонентов: подвижной фазы или растворителя, содержащего белки, стационарной или твердой фазы, также называемой средой или смолой (которая может представлять собой агарозу или другую пористую смолу), и хроматографической колонки. Аффинная хроматография очень селективна и обеспечивает высокое разрешение при емкости загрузки образца от средней до высокой. Исследуемый белок прочно связывается со смолой в условиях, способствующих специфическому связыванию с лигандом, а несвязанные загрязнения смываются. Затем связанный белок извлекают в высокоочищенной форме путем изменения условий в пользу элюирования. Условия элюирования могут быть специфическими, например, при использовании конкурентного лиганда, или неспецифическими, например, при изменении pH, ионной силы или полярности. Целевой белок элюируется в очищенной и концентрированной форме.

---

Однократное пропускание образца (клеточного лизата, супернатанта клеточной культуры или сыворотки) через аффинную колонку может обеспечить более чем 1000-кратную очистку определенного белка, так что после гель-электрофореза обнаруживается только одна полоса (например, , SDS-PAGE) анализ.

Чаще всего лиганды иммобилизуют или «связывают» непосредственно с твердым материалом носителя путем образования ковалентных химических связей между определенными функциональными группами лиганда (например, первичными аминами, сульфгидрилами, карбоновыми кислотами, альдегидами) и реакционноспособными группами на носителе ( см. соответствующую статью о ковалентной иммобилизации). Однако возможны и непрямые подходы к связыванию. Например, слитый белок, помеченный глутатион-S-трансферазой (GST), может быть сначала захвачен глутатионовой подложкой посредством аффинного взаимодействия глутатион-GST, а затем вторично химически сшит для его иммобилизации. Затем иммобилизованный слитый белок с GST-меткой можно использовать для аффинной очистки партнера(ов) связывания слитого белка.

Лиганды, которые связываются с общими классами белков (например, антителами) или часто используемыми метками слитых белков (например, гистидиновой меткой или гистидиновой меткой), коммерчески доступны в предварительно иммобилизованных формах, готовых к использованию для аффинной очистки. Альтернативно, более специализированные лиганды, такие как специфические антитела или интересующие антигены, могут быть иммобилизованы с использованием одного из нескольких коммерчески доступных носителей активированной аффинности; например, пептидный антиген можно иммобилизовать на подложке и использовать для очистки антител, распознающих пептид.

Учить больше

• GST-меченные белки: производство и очистка
• HIS-меченные белки: производство и очистка
• Ковалентная иммобилизация
• Протеиновый образцы.
• Продукты для очистки белка

---

Связывающие и элюирующие буферы для аффинной очистки

В большинстве процедур аффинной очистки, включающих взаимодействие белок: лиганд, используются связывающие буферы с физиологическим pH и ионной силой, такие как фосфатно-солевой буфер (PBS). Это особенно верно, когда взаимодействие антитело:антиген или нативный белок:белок является основой для аффинной очистки. Как только происходит взаимодействие связывания, подложку промывают дополнительным буфером для удаления несвязанных компонентов образца. Неспецифическое (например, простое ионное) связывающее взаимодействие можно свести к минимуму путем добавления небольшого количества детергента или умеренного регулирования концентрации соли в связывающем и/или промывочном буфере. Наконец, добавляется элюирующий буфер, чтобы разорвать взаимодействие связывания и высвободить молекулу-мишень, которую затем собирают в ее очищенной форме.

Буферы для элюирования диссоциируют связывающие партнеры из-за крайних значений pH (низкого или высокого), высокого содержания солей (ионной силы), использования детергентов или хаотропных агентов, которые денатурируют одну или обе молекулы, удаления связывающего фактора или конкуренции со счетчиком лиганд. В большинстве случаев требуется последующий диализ или обессоливание, чтобы заменить очищенный белок из элюирующего буфера на более подходящий буфер для хранения или последующего анализа.

Наиболее широко используемый элюирующий буфер для аффинной очистки на основе белковых взаимодействий представляет собой 0,1 М глицин•HCl, pH 2,5–3,0. Этот буфер эффективно диссоциирует большинство взаимодействий связывания белок:белок и антитело:антиген без необратимого воздействия на структуру белка. Однако некоторые антитела и белки повреждаются при низком рН, поэтому элюированные белковые фракции лучше всего немедленно нейтрализовать добавлением 1/10 объема щелочного буфера, такого как 1 М трис•HCl, рН 8,5. Другие буферы для элюирования для аффинной очистки белков перечислены в таблице ниже.

 

Подробнее

• Технический совет № 27. Оптимизируйте условия элюирования для аффинной очистки

---

Общие буферные системы для элюции для аффинной очистки белков

Эти условия применяются, прежде всего, к взаимодействиям связывания белок-белок, например, между антителом и его пептидным антигеном. Элюирующие буферы для связывающих взаимодействий между другими типами молекул могут быть совершенно другими.

Состояние	Buffer
pH	100 mM glycine•HCl, pH 2.5-3.0 100 mM citric acid, pH 3.0 50–100 mM triethylamine or triethanolamine, pH 11.5 150 mM ammonium hydroxide , pH 10,5
Ионная сила и/или Хаотропные эффекты	3,5–4,0 М хлорида магния, pH 7,0 в 10 мМ Трис 5 М хлорида лития в 10 мМ натрий-8,9-2,9 йо-фосфатном буфере, pH 10 рН 7,5 0. 2-3.0 M sodium thiocyanate
Denaturing	2–6 M guanidine•HCl 2–8 M urea 1% deoxycholate 1% SDS
Organic	10% dioxane 50% этиленгликоль, pH 8–11,5 (также хаотропный)
Конкретный конкурент	>0,1 М противолиганд или аналог (например, использование глутатиона для элюирования GST-меченых белков из иммобилизованной глутатион-агарозной смолы)

Узнать больше

• Технический совет № 29. Дегазационные растворы для использования в колонках для аффинной и гель-фильтрации

---

Твердые подложки для аффинной очистки на различия связывающего взаимодействия с лигандом, иммобилизованным на неподвижном материале (твердой фазе). Подложка или матрица в аффинной очистке представляет собой любой материал, к которому ковалентно присоединен биоспецифический лиганд. Как правило, материал, используемый в качестве аффинной матрицы, нерастворим в системе, в которой находится целевая молекула. Обычно, но не всегда, нерастворимая матрица представляет собой твердое вещество. Сотни веществ были описаны и использованы в качестве аффинных матриц, включая агарозу, целлюлозу, декстран, полиакриламид, латекс и стекло с регулируемыми порами. Полезными аффинными носителями являются носители с высоким отношением площади поверхности к объему, химическими группами, которые легко модифицируются для ковалентного присоединения лигандов, минимальными свойствами неспецифического связывания, хорошими характеристиками текучести и механической и химической стабильностью.

Узнать больше

• Ковалентная иммобилизация

Выбрать продукты

• Продукты для очистки белков
  

---

Пористые гелевые опоры

Пористые носители (также называемые смолами или гелями) обычно обладают наиболее полезными свойствами для аффинной очистки белков. Эти типы подложек обычно представляют собой полимерные смолы на основе сахара или акриламида, которые получают в растворе (т. е. гидратированном) в виде шариков диаметром 50–150 мкм. Гранулированный формат позволяет подавать эти смолы в виде влажных суспензий, которые можно легко дозировать для заполнения и «упаковки» колонок со слоями смолы любого размера. Гранулы являются чрезвычайно пористыми и достаточно большими, чтобы биомолекулы (белки и т. д.) могли проникать в гранулы и через них так же свободно, как и между и вокруг поверхности гранул. Лиганды ковалентно присоединены к гранулированному полимеру (внешняя и внутренняя поверхности) различными способами. В результате получается рыхлая матрица, в которой молекулы образца могут свободно протекать мимо большой площади поверхности иммобилизованного лиганда.

На сегодняшний день наиболее широко используемой матрицей для методов аффинной очистки белков является поперечно-сшитая гранулированная агароза, которая обычно доступна с плотностью 4% и 6%. (Это означает, что 1 мл слоя смолы состоит из более чем 90% воды по объему.) Агароза с гранулами хороша для рутинных применений, поскольку она легко измельчается, что делает ее пригодной для гравитационного потока, низкоскоростного центрифугирования и низкого давления. процедуры. Дополнительное сшивание и/или химическое отверждение гранулированных агарозных смол может повысить их способность выдерживать более высокие давления, но также может привести к снижению связующей способности.

Смолы на основе полиакриламида также используются в качестве носителей для колоночной аффинной хроматографии. Одним из примеров является Thermo Scientific UltraLink Biosupport, который не так легко сжимается, как обычная гранулированная агароза. UltraLink Biosupport может использоваться в системах среднего давления с перистальтическим насосом или другими жидкостными хроматографическими системами. И агароза, и UltraLink обладают низкими характеристиками неспецифического связывания; тем не менее, в определенных приложениях они ведут себя немного по-разному.

 

Узнать больше

• Технический совет № 13. Заполните колонку гранулированной аффинной смолой
• Технический совет № 7. Удалите пузырьки воздуха из колонок для восстановления скорости потока

---

Физические свойства смол для аффинной хроматографии

Сшитая 4%-ная агароза с гранулами и сшитая 6%-ная агароза с гранулами обычно обозначаются аббревиатурой агароза CL-4B и агароза CL-6B соответственно. Также см. таблицу ниже о выборе опор в зависимости от масштаба использования.

	Crosslinked 4% beaded agarose	Crosslinked 6% beaded agarose	Superflow agarose (highly crosslinked)	UltraLink Biosupport (acrylamide-azlactone polymer)
Bead size range	45 to 165 µm	45 to 165 µm	45 to 165 µm	50 to 80 µm
Exclusion limit	20,000 kDa	4000 kDa	6000 kDa	2000 kDa
Pressure limit	0.35 MPa	0.35 MPa	0.65 MPa	0.69 MPa
Methods	gravity- проточное или низкоскоростное центрифугирование	самотечное или низкоскоростное центрифугирование	Системы FPLC, самотечные	Системы FPLC, ВЭЖХ, гравитационные
Coupling capacity	medium	medium	medium	high
pH range (tolerance)	3–11	3–11	2–12	1– 13

---

Магнитные частицы

Магнитные частицы представляют собой совершенно другой тип аффинной подложки, отличный от гранулированной агарозы и других пористых смол. Они намного меньше (обычно диаметром 1–4 мкм) и твердые (непористые). Их небольшой размер обеспечивает достаточное соотношение площади поверхности к объему, необходимое для эффективной иммобилизации лиганда и аффинной очистки. Магнитные шарики производятся в виде частиц суперпарамагнитного оксида железа, ковалентно покрытых производными силана. Покрытие делает гранулы инертными (чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание) и обеспечивает определенные химические группы, необходимые для присоединения интересующих лигандов.

Аффинная очистка с использованием магнитных частиц не выполняется в колонке. Вместо этого несколько микролитров гранул смешивают с несколькими сотнями микролитров образца в виде рыхлой суспензии. Во время смешивания гранулы остаются взвешенными в растворе образца, позволяя происходить аффинным взаимодействиям с иммобилизованным лигандом. По истечении достаточного времени для связывания гранулы собирают и отделяют от образца с помощью мощного магнита. Как правило, простые лабораторные процедуры выполняются в микроцентрифужных пробирках, а пипетирование или декантация используются для удаления образца (или промывочных растворов и т. д.), в то время как магнитные шарики удерживаются на месте на дне или сбоку пробирки с помощью подходящего инструмента. магнит.

Преимущества магнитных частиц по сравнению с пористыми смолами:

• Магнитные шарики обладают меньшим неспецифическим связыванием, чем пористые носители.
• Магнитные шарики можно использовать для процедур разделения клеток.
• Магнитные шарики подходят для высокопроизводительной автоматизации.

Магнитные шарики, как правило, заменили агарозную смолу в качестве предпочтительной основы для методов очистки в масштабе анализа, таких как иммунопреципитация (IP) и метод pull-down. Кроме того, все более сложные и мощные инструменты для работы с образцами доступны для проведения анализов и процедур очистки с использованием магнитной сепарации.

Узнать больше

• Иммунопреципитация (ИП)
• Автоматическое магнитное разделение для протеомики

---

Приложения и масштабы использования

Предполагаемый масштаб очистки и последующее применение, возможно, являются наиболее важными соображениями при выборе типа аффинити-поддержки. Различия в пределах давления (см. таблицу выше), максимальной скорости потока и таких факторах, как стоимость (например, магнитные частицы будут слишком дорогими для использования в больших масштабах), определяют, какой носитель подходит для использования в данной хроматографической системе.

Соответствующие области применения и масштабы использования аффинной хроматографии поддерживаются.

	Screening or Assay Scale	Batch Scale	Pilot Scale	Process Scale
Yield	Microgram (µg)	Milligram (mg)	Milligram to грамм	Грамм в килограмм
Техника	Автоматизированный процессор частиц; 96-луночные вращающиеся планшеты	Гравитационный поток; Спин-колонки	FPLC при низкой и средней скорости потока	FPLC при высокой скорости потока
Приложения	Высокопроизводительный скрининг; интракционных исследований; мутационный анализ; Вестерн-блоттинг	Функциональные анализы; Структурный анализ	Структурный анализ; Производственные масштабы	Массовое производство
Подходящие опоры

---

Типы аффинной очистки

Различные классы аффинных мишеней, а также разные цели очистки требуют учета различных приоритетов (например, высокая чистота или высокий выход), технических ограничений и буферных условий для разработка успешной процедуры. В следующих разделах описаны некоторые из наиболее распространенных систем аффинной очистки. Ссылки на более подробные статьи о конкретных методах очистки указаны в серых прямоугольниках.

---

Очистка антител

Некоторые методы очистки антител включают методы аффинной очистки. Типичное лабораторное производство антител включает относительно небольшие объемы сыворотки, асцитной жидкости или культурального супернатанта. В зависимости от того, как антитело будет использоваться для различных методов анализа и обнаружения, оно должно быть частично или полностью очищено. Три уровня специфичности очистки включают следующие подходы:

• Осаждение сульфатом аммония. Этот простой метод обеспечивает грубую очистку общего иммуноглобулина от других белков сыворотки.
• Аффинная очистка с иммобилизованным белком A, G, A/G или L. Эти белки связываются с большинством видов и подклассов IgG, наиболее распространенного типа иммуноглобулина, вырабатываемого млекопитающими в ответ на иммуногены. Готовые к использованию смолы и наборы для очистки с этими белками доступны во многих упаковках и форматах.
• Аффинная очистка с иммобилизованным антигеном. Ковалентная иммобилизация очищенного антигена (т. е. пептида или гаптена, используемого в качестве иммуногена, чтобы индуцировать выработку антител животным-хозяином) на аффинной подложке позволяет очистить специфическое антитело из неочищенных образцов. Доступны активированные смолы и полные наборы для приготовления иммобилизованных антигенов с помощью различных химических процессов.
   

Узнать больше

• Обзор продуктов для очистки антител

Выбрать продукты

• Продукты для очистки антител

---

Очистка антигена с использованием антител

Специфические антитела чаще всего используются для обнаружения представляющих интерес антигенов в анализах, но их также можно использовать для очистки антигенов. Поскольку специфические антитела дорого производить или приобретать в коммерческих целях, этот подход редко используется для крупномасштабной очистки антигена. Вместо этого его использование почти полностью ограничено очень небольшими масштабами, в первую очередь для анализов иммунопреципитации (см. следующий раздел).

Тем не менее, когда очищенное антитело доступно, его можно ковалентно иммобилизовать на гранулированной агарозе или другом аффинном носителе с помощью любого из нескольких эффективных способов конъюгации. Ковалентная иммобилизация через первичные амины, как и в случае с наборами связывания AminoLink Plus от Thermo Scientific, является особенно простым и эффективным методом подготовки аффинной колонки с антителами.

Узнать больше

• Ковалентная иммобилизация

---

Иммунопреципитация и коиммунопреципитация

Иммунопреципитация (IP) относится к мелкомасштабной аффинной очистке антигена с использованием специфического антитела. Традиционная иммунопреципитация включает захват комплекса антитело-антиген с иммобилизованным белком A или G на агарозной смоле (белок A или G связывает антитело, которое связано с его антигеном), а затем выделение очищенного антигена в буфере для загрузки образца для гель-электрофореза.

Ко-иммунопреципитация (Co-IP) включает попытку захвата и обнаружения не только прямого антигена, но и любых белков в милле клеточного лизата, которые взаимодействуют (т. е. связываются) с антигеном. В традиционном формате с протеином А или протеином G эта схема очистки включает не менее трех уровней аффинного взаимодействия.

Путем адаптации и оптимизации других методов иммобилизации антител для небольших масштабов, необходимых для IP и Co-IP, было разработано несколько инноваций, которые преодолевают многие ограничения и сложности, связанные с традиционными методами IP.

Узнайте больше

• Иммунопреципитация (IP)
• Коиммунопреципитация

SELECT Products

• Объединение иммунопреципитации
• Ко-иммунопреципитация (CO-IP).

.0075

Pull-down анализы

Подобно ко-иммунопреципитации, пулл-даун-анализ представляет собой аффинный подход, часто используемый для изучения белок-белковых взаимодействий. Однако, в отличие от IP или Co-IP, pull-down не требует использования антител, специфичных к изучаемому белку-мишени. Минимальным требованием для анализа с вытягиванием является наличие очищенного и помеченного белка (приманки), который используется для «вытягивания» партнера по связыванию белка (жертвы). Белок-приманка создается путем клонирования и экспрессии слитого белка или в виде ковалентной модификации, такой как добавление биотиновой метки (см. следующие две темы). Меченый (например, биотинилированный) белок-приманка может быть иммобилизован на специфической для метки аффинной подложке (например, стрептавидине). Затем иммобилизованный белок приманки инкубируют с белковым раствором, экспрессирующим белок (белки) (жертвы), который может связываться с приманкой. Затем эти белковые комплексы приманка-добыча могут быть идентифицированы. В качестве альтернативы можно использовать активированные подложки для непосредственной иммобилизации почти любой молекулы приманки.

Узнать больше

• Анализы методом Pull-Down

Выбрать продукты

• Наборы для анализа Pull-Down

---

Очистка белка Fusion Tag

Когда белки экспрессируются рекомбинантно, часто добавляют дополнительные аминокислоты, функциональный домен или целый белок, чтобы облегчить очистку и манипуляции. Эти добавления к рекомбинантному белку известны как метки слияния и добавляются к ДНК, которая кодирует нативную последовательность белка. Одна из наиболее распространенных меток слияния представляет собой короткую цепочку из шести-девяти остатков гистидина (известную как метка 6xHis или полиHis), которая связывается с ионами металлов, таких как никель или кобальт. Другой меткой слияния является глутатионS-трансфераза (GST), которая прочно связывается с восстановленным глутатионом.

Другие метки слияния включают HA, Myc, FLAG (Sigma-Aldrich Co.), MBP, SUMO и Protein A. В отличие от меток His и GST, большинство этих других меток называются эпитопными метками, поскольку для них требуются специфические антитела (например, иммобилизованное анти-HA антитело) для очистки. Эпитопные метки редко используются для крупномасштабной очистки, потому что аффинные смолы на основе антител относительно дороги по сравнению с простыми лигандными средами, такими как никель- или глутатион-агароза. Вместо этого эпитопные метки чаще используются для мелкомасштабной иммунопреципитации (IP) или Co-IP.

Свойства слитых меток позволяют легко манипулировать мечеными белками в лаборатории. Наиболее важно то, что хорошо охарактеризованная химия метки-лиганда позволяет проводить одноэтапную аффинную очистку меченых молекул с использованием иммобилизованных версий их соответствующих лигандов. Антитела к меткам слияния также широко доступны для использования в последующих методах обнаружения и анализа, что устраняет необходимость в получении или разработке зонда для каждого конкретного рекомбинантного белка.

Узнать больше

• Белки с меткой GST
• Белки с меткой His

Выбрать продукты

• Очистка белков Fusion

---

Авидин-биотиновые системы

Биотин, также известный как витамин Н, представляет собой небольшую молекулу (молекулярная масса 244,3), которая присутствует в крошечных количествах во всех живых клетках. Боковая цепь валериановой кислоты молекулы биотина может быть дериватизирована для включения различных реакционноспособных групп, которые используются для присоединения биотина к другим молекулам. Как только биотин присоединен к молекуле, молекула может быть захвачена для обнаружения, иммобилизации или аффинной очистки с использованием конъюгатов или подложек на основе белков авидина или стрептавидина, которые прочно и специфически связываются с группой биотина.

Нативные и рекомбинантные производные белков авидина и стрептавидина легко доступны в большом количестве модифицированных, меченых и иммобилизованных форм. «Система авидин-биотин» (общее название для всех методов биотин-аффинности) была адаптирована для использования во многих видах исследовательских приложений для обнаружения или очистки.

Поскольку аффинное взаимодействие авидин-биотин настолько сильное, обычно нецелесообразно элюировать биотинилированные мишени, которые были захвачены, на иммобилизованный авидин или стрептавидиновый носитель. Однако были разработаны модифицированные версии реагентов для мечения биотина, такие как расщепляемый биотин, иминобиотин и дестиобиотин; они обеспечивают легко обратимое взаимодействие со стрептавидином, что делает их полезными инструментами для приложений мягкого высвобождения.

Узнайте больше

• Авидин-биотин взаимодействие

Избранные продукты

• Биотин-связывающие аффинные поддержки
• Реагенты биотинилирования
• Дестриобиобиотинилирование. Обогащение и изоляция класса

  В дополнение к аффинным носителям и лигандам, которые позволяют очищать очень специфические мишени (например, определенные антигены или сконструированные метки), определенные виды лигандов обеспечивают общее обогащение или изоляцию определенных классов биологических молекул. Белок А и белок G, обсуждавшиеся выше, можно рассматривать как пример этого типа аффинной системы, поскольку они связываются с общими классами иммуноглобулинов. Как правило, любое уникальное химическое свойство или функциональная группа, общие для всех членов целевого набора молекул, могут стать основой для схемы обогащения или выделения, если может быть идентифицирован подходящий аффинный лиганд.

  Посттрансляционные модификации (ПТМ) являются хорошими примерами таких функциональных групп, которые определяют несвязанный набор молекул. Будь то фосфорилирование, гликозилирование или убиквитинирование, PTM обладает химическими свойствами, которые лишь слегка отличаются от других химических групп с помощью большинства известных химических лигандов. Таким образом, любая аффинная система может в лучшем случае обогащать только целевой класс соединений.

  Подробнее

  • Обзор посттрансляционной модификации (PTM)

  Некоторые продукты

  • Наборы для обогащения и изоляции PTM

  ---

  Удаление загрязнений

  В некоторых случаях целью аффинной очистки является удаление определенного класса нежелательных компонентов пробы, а не очистка одной целевой молекулы. В этом смысле единственная разница между удалением загрязнений и традиционной аффинной очисткой заключается в том, что желательно сохранить проточный образец и выбросить связанную молекулу. В таком сценарии важно, чтобы буфер для связывания подходил для восстановления образца.

  Общее удаление низкомолекулярных соединений из образца белка или других высокомолекулярных соединений обычно осуществляется с помощью гель-фильтрации (см. следующий раздел), а не аффинной хроматографии. Однако, когда нежелательные примеси невозможно отличить по размеру и известны аффинные лиганды, которые могут специфически связываться с ними в образце, аффинная очистка полезна.

  Удаление загрязнений с помощью аффинности обычно выполняется в конце процедуры. Например, детергенты, необходимые для лизиса клеток и солюбилизации белков, могут мешать последующим приложениям и анализам. Для обработки образцов в таких ситуациях доступны несколько смол, связывающих моющие средства.

  Другой сценарий, в котором желательно удалить определенные компоненты, касается протеомного анализа образцов сыворотки. Часто основное внимание при анализе уделяется белкам, которых в образце сыворотки или плазмы гораздо меньше, чем альбумина и IgG. В этих случаях особенно полезны аффинные смолы на основе специфических антител к альбумину и анти-IgG или на основе других лигандов (краситель цибакрон для связывания альбумина и белок A/G для связывания IgG).

  Узнать больше

  • Технический справочник по очистке белков

  View и Select Products

  • Desalting Columns
  • Ионообменные колонны
  • Очистка белка
  • Поддержка для иммобилизации белка

  • ---

    7

  • протеино Родственные виды хроматографии для очистки

    Гель-фильтрация (также называемая эксклюзионной хроматографией или SEC) использует пористую смолу для разделения молекул по размеру. Небольшие молекулы проникают в поры смолы, проходя через колонку окольными путями; Напротив, крупные молекулы исключаются из пор, минуя внутренние пространства шариков и мигрируя через колонку быстрее, чем мелкие молекулы.

    Ионообменная хроматография (IEX или IEC) разделяет белки в соответствии с силой их общего ионного взаимодействия либо с отрицательно, либо с положительно заряженными группами на смоле. Управляя буферными условиями (например, ионной силой и pH), молекулы более или менее ионного характера могут быть связаны с твердофазным материалом или диссоциированы от него. Носители IEX могут быть либо положительно заряжены (для связывания анионов), либо отрицательно заряжены (для связывания катионов). Кроме того, носители для аниона и катиона IEX могут быть охарактеризованы как для сильных, так и для слабых взаимодействий; это отражает не силу связывания, а скорее изменение ионизации в зависимости от pH. Связывание с сильными обменниками минимально зависит от изменения pH, тогда как связывание со слабыми обменниками сильно зависит от изменения pH.

    Хроматография гидрофобных взаимодействий (HIC) разделяет белки на основе взаимодействий внешних гидрофобных аминокислотных остатков белка с гидрофобными группами на смоле.

    Мультимодальная хроматография (MMC) разделяет белки аналогично хроматографии IEX. MMC использует заряженные группы на смоле, но группы модифицированы второй группой, которая дает второе взаимодействие, с помощью которого можно очистить белок.

    Все наиболее распространенные методы очистки белков основаны на хроматографии. Эти стратегии можно разделить на четыре типа применения, которые основаны на свойствах очищаемого белка, уровне чистоты и лиганде/химическом составе. Обратите внимание, что HIC, SEC и IEX полезны при выделении нового белка или когда аффинная хроматография (AC) недоступна. Чистота, полученная этими методами, зависит от белка. Ионный обмен и аффинная хроматография являются двумя широко используемыми хроматографическими стратегиями частичной или одностадийной очистки.

    Узнать больше

    • Гель-фильтрация (обессоливание)
    • Электронный учебный курс по подготовке образцов белков
    • Центр поддержки по очистке белков

    ---

    Рекомендуемая литература

    Walker JM. 2009. Справочник по белковым протоколам. Третье издание. Springer-Verlag New York, LLC

    Обзор диализа, обессоливания, замены буфера и концентрации белка | Thermo Fisher Scientific

    В контексте исследований белков и протеомики подготовка и очистка образцов относится к эклектичному набору методов, направленных на получение извлеченных или очищенных образцов белка, пригодных для длительного хранения или совместимых с последующими приложениями. Диализ, диафильтрация и гель-фильтрация (обессоливание) являются наиболее широко применимыми методами пробоподготовки. Эти методы основаны на хорошо известных принципах исключения размера и использовались в лабораторных исследованиях в течение многих десятилетий. Достижения в области качества материалов и конструкций, используемых для изготовления устройств для диализа, диафильтрации и обессоливания, идут в ногу с изменениями в масштабах, совершенствовании и удобстве, которых требуют современные исследовательские эксперименты.

    ---

    Страница Содержание

    • ВВЕДЕНИЕ
    • Диализ
    • Оспания и обмен буфетами
    • Диафильтрация
    • Связанные методы
    9007

    View и Select Products

    • Cell Lyise REAGENS 9007

      DIALY DIALLIS Руководство

    • Руководство по выбору белкового концентратора
    • Руководство по выбору продуктов для ионообменной хроматографии
    • Очистка белков с помощью аффинной хроматографии
    • Набор для подготовки проб SDS-PAGE

    Введение

    Исторически механическое разрушение использовалось для лизиса клеток и тканей; однако совсем недавно были разработаны растворы на основе детергентов для эффективного лизиса клеток и обеспечения возможности разделения субклеточных структур без физического разрушения. В процессе подготовки образца белка многие детергенты, соли и другие молекулы, используемые или образующиеся во время экстракции белка или последующей очистки, могут оказывать неблагоприятное воздействие на функцию или стабильность белка или мешать последующим приложениям; поэтому может потребоваться удалить или уменьшить количество этих загрязнителей с помощью одного или нескольких методов очистки от белков. Выбор конкретного метода очистки белка зависит от типа и объема образца, характеристик белка (нативный или рекомбинантный) и предлагаемых последующих приложений, которые могут включать кристаллографию, масс-спектрометрию, мечение белков и другие приложения.

    Общий рабочий процесс экстракции белка.  Протокол выделения общего белка из клеток млекопитающих состоит из культивирования и сбора клеток, помещения образца пипеткой в ​​чистые микроцентрифужные пробирки и немедленного помещения на лед. Затем пробирку центрифугируют для осаждения клеток и отсасывают надосадочную жидкость. После физического разрушения клеток или добавления буфера для лизиса клеток проводят инкубацию на льду. Наконец, образцы центрифугируют для сбора супернатанта, который содержит общие клеточные белки.

    Учите больше

    • Обзор лизиса клеток и экстракции белка
    • Очистка белка и поддержка изоляции Центр
    • . Экстракция) Руководство по выбору
    • Свойства обычных детергентов для солюбилизации белков

    ---

    Технический справочник по очистке белков

    Узнайте больше о том, как обессоливать, заменять буфер, концентрировать и/или удалять примеси из образцов белка с помощью различных инструментов Thermo Scientific для биологии белков, из этого 48-страничного руководства.

    • Надежный диализ образцов белка с помощью диализных кассет и устройств Slide-A-Lyzer
    • Быстрое обессоление образцов с высоким извлечением белка с использованием колонок и планшетов для обессоливания Zebaspin
    • Эффективное извлечение конкретных загрязнителей с помощью смол, оптимизированных для удаления детергентов или эндотоксинов
    • Быстро концентрируйте разбавленные образцы белка с помощью концентраторов белка Pierce

    Загрузите техническое руководство по очистке белков

    ---

    Диализ

    Диализ — это классический метод разделения, который облегчает удаление небольших нежелательных соединений из макромолекул в растворе путем селективной диффузии через полупроницаемую мембрану. Отсечка по молекулярной массе (MWCO) мембраны определяется размером ее пор. Образец и буферный раствор (называемый диализатом, обычно в 200–500 раз превышающий объем образца) помещают на противоположные стороны мембраны. Молекулы пробы, размер которых превышает размер пор мембраны, удерживаются на стороне пробы мембраны, но небольшие молекулы свободно диффундируют через мембрану и достигают равновесной концентрации со всем объемом диализата. Таким образом, концентрация мелких загрязняющих веществ в образце может быть снижена до приемлемого или незначительного уровня.

    Как работают диализные мембраны. Диализная мембрана представляет собой полупроницаемую пленку (обычно лист регенерированной целлюлозы), содержащую поры различного размера. Молекулы большего размера, чем поры, не могут пройти через мембрану, но маленькие молекулы могут сделать это свободно. Таким образом, диализ можно использовать для очистки или замены буфера для образцов, содержащих макромолекулы.

    ---

    Посмотрите это видео, чтобы узнать больше о белковом диализе

    Узнайте больше

    • Методы диализа для исследования белка
    • Применение Примечание: Характеристики разделения диализа мембран

    Выбор продуктов

    • Dialys Selection. солей из образца, в то время как замена буфера относится к замене одного набора буферных солей другим набором. Обе цели легко достигаются с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭХ), также называемой гель-фильтрационной хроматографией. Обессоливание проводят, сначала уравновешивая хроматографическую колонку водой. Замена буфера, однако, выполняется путем предварительного уравновешивания смолой колонки с буфером, в котором должен оказаться образец. В обоих случаях компоненты буфера, несущие образец в колонку, будут заменены раствором, которым колонка предварительно заполнена. уравновешенный.

      Как обессоление, так и буферный обмен являются процессами разделения, основанными на гель-фильтрации, также известной как хроматография на молекулярном сите. В этом методе раствор, содержащий макромолекулы, пропускают через колонку, заполненную пористой смолой. При правильном подборе макромолекулы будут слишком большими, чтобы проникнуть в поры смолы, и быстро пройдут через колонку. Напротив, буферные соли и другие небольшие молекулы будут попадать в поры смолы, замедляя скорость их миграции через слой смолы. Это уменьшение скорости потока приводит к тому, что более быстрые макромолекулы отделяются от более медленных и меньших молекул. Собирая отдельные фракции по мере их выхода из колонки, интересующая макромолекула может быть извлечена отдельно от малых молекул, которые позже покидают колонку.

      Поскольку раствор, несущий образец в колонку, вытесняет раствор, в котором уравновешивается смола, макромолекулы, выходящие из колонки, переносятся в уравновешивающий буфер. Исходный буфер остается в смоле, отсюда и термин «замена буфера».

      ---

      Посмотрите это короткое видео, чтобы узнать больше об обессоливании образцов белка.

      Существует ряд имеющихся в продаже вариантов обессоливающих устройств. Например, продукты Thermo Scientific Zeba содержат смолы с исключительными свойствами обессоливания и извлечения белка. Доступны несколько форматов колонок Zeba для обработки образцов объемом от 2 мкл до 4 мл.

      По сравнению с альтернативными продуктами, спиновые обессоливающие колонки Zeba от Thermo Scientific обеспечивают высокое извлечение белка и минимальное разбавление образца в более широком диапазоне концентраций и объемов образца. Колонки Zeba Spin для обессоливания, 10 мл (MWCO 7K) и колонки GE PD-10 использовались для обессоливания образцов BSA объемом 1,5, 2,5 и 3,5 мл при концентрации 0,04, 0,2 и 1 мг/мл. Обессоливание проводили в соответствии с протоколами, рекомендованными производителями, а выделение белка анализировали с помощью SDS-PAGE. Для каждого геля для электрофореза аликвоту исходного образца, равную 1 мкг BSA, загружали на дорожку 1 в качестве контроля загрузки; все остальные обессоленные образцы загружали в гель в том же объеме, что и контрольную загрузку. Различия в интенсивности между дорожками являются комбинацией извлечения белка и разбавления образца, вызванного обессоливанием. Наибольшие различия в восстановлении и концентрации были отмечены в выделенной области.

      ---

      Диафильтрация

      Диафильтрация, как и диализ, использует полупроницаемую мембрану для отделения макромолекул от низкомолекулярных соединений. В отличие от диализа, который основан на пассивной диффузии, диафильтрация включает проталкивание растворов через мембрану под давлением (например, обратный осмос, картриджи для стерилизации наконечников шприцев) или центрифугирование. В продаже имеется множество различных типов белковых концентраторов.

      Во время диафильтрации как вода (растворитель), так и низкомолекулярные растворенные вещества проталкиваются через мембранный фильтр, где они собираются на другой стороне. Макромолекулы остаются на стороне образца мембраны, где они концентрируются до меньшего объема, когда вода вытесняется через мембрану на противоположную сторону. Следовательно, типичные устройства для диафильтрации, включающие центрифугирование, называются концентраторами, и этот метод используется в основном для концентрирования образцов, а не для замены буфера.

      Сравнение извлечения белка с использованием концентраторов различных поставщиков. Растворы образцов белков центрифугировали в концентраторах Thermo Scientific Protein Concentrators и концентраторах других поставщиков в соответствии с инструкциями производителя (20 мл (4700 x г )). Образцы центрифугировали до более чем 15-30-кратного уменьшения объема образца; концентрацию белка измеряли по абсорбции при A280.

      ---

      Посмотрите это видео, чтобы узнать больше о белковых концентраторах

      Узнать больше

      • Справочник по приготовлению протеина
      • Справочник по исследованию протеина

      Выбрать продукты

      • Руководство по выбору концентратора протеина

      ---

      4 Родственные методы Осадки

      Обычные методы анализа белков зависят от измеримого развития окраски в результате химических реакций или взаимодействий реагентов для анализа с функциональными группами белка. Однако развитие окраски и точное измерение белка даже самыми популярными методами анализа чувствительны к конкретным мешающим веществам, которые могут присутствовать в образцах. Например, большинство моющих средств мешают точному количественному определению белка с использованием анализов на основе красителя Кумасси, а восстановители мешают анализу белка BCA. Один из методов, используемых для удаления мешающих веществ, заключается в селективном осаждении белков с использованием трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или ацетона. Раствор, содержащий мешающее вещество, удаляют, а затем белок повторно растворяют в совместимом с анализом буфере. Имеющиеся в продаже наборы упрощают предварительную обработку образцов для анализа белков. Небольшие молекулы можно отделить от крупных белков в образце путем осаждения ацетонитрилом. При использовании в сочетании с 96-луночные центрифужные фильтровальные планшеты, этот метод идеально подходит для одновременной обработки большого количества образцов.

      Протокол удаления веществ, мешающих колориметрическому анализу белков.  Реагентный набор Thermo Scientific Compat-Able Protein Assay Preparation Regent Set в четыре этапа удаляет соли, детергенты, восстановители и другие вещества из образцов белка, чтобы устранить влияние на результаты анализа белка. Этот набор реагентов обеспечивает более стабильные результаты по сравнению с самодельными реагентами для осаждения ТХУ или ацетоном.

      Подробнее

      • Обзор анализов белков
      • Технический совет № 8. Исключите мешающие вещества из образцов для анализа белков BCA

      ---

      Ионообменная хроматография

      Другим общим методом очистки или обогащения белка является ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии образец пропускают через заряженную колонку. Заряженные группы на поверхности белка взаимодействуют с противоположно заряженными группами, иммобилизованными на ионообменном носителе. Ионообменные свойства основаны на изоэлектрической точке (pI) белка. Когда белок находится в буфере с pH выше, чем его pI, белок будет иметь отрицательный суммарный заряд и будет связываться с положительно заряженной подложкой или анионообменной средой. Когда буфер имеет pH ниже pI белка, белок будет иметь положительный суммарный заряд и связываться с отрицательно заряженной подложкой или катионообменной средой. Изменение pH буфера для связывания позволит элюировать интересующий связанный белок. Текущие протоколы в науке о белках (1990). доп. 8.4, John Wiley & Sons, Inc., содержит подробное обсуждение

      Очистка белков с помощью ионообменной (IEX) хроматографии.  Эта форма хроматографии разделяет белки на основе обратимого взаимодействия между заряженным белком и противоположно заряженной хроматографической средой, также называемой смолой , и обеспечивает разделение от среднего до высокого разрешения и высокую емкость загрузки образца. Белки-мишени концентрируются, когда они связываются с хроматографической средой при низкой ионной силе и дифференциально элюируются в очищенной, концентрированной форме за счет увеличения концентрации соли или изменения рН в градиенте.

      Узнать больше

      • Курс электронного обучения по подготовке образцов белков

      ---

      Аффинная хроматография

      Аффинную очистку можно использовать для очистки молекул определенного типа (положительный отбор) или для удаления определенного вида загрязняющих веществ (отрицательный отбор). Оба метода часто включают буферный обмен. Аффинная очистка включает разделение молекул в растворе (подвижная фаза) на основе различий в связывающем взаимодействии с лигандом, иммобилизованным путем прикрепления к неподвижной опоре (твердая фаза). Носителем или матрицей в аффинной очистке является любой материал, к которому ковалентно присоединен биоспецифический лиганд. Как правило, материал, используемый в качестве аффинной матрицы, нерастворим в системе, в которой находится молекула-мишень. Обычно, но не всегда, нерастворимая матрица представляет собой твердое вещество. Сотни веществ были описаны и использованы в качестве аффинных матриц, включая агарозу, целлюлозу, декстран, полиакриламид, латекс и стекло с регулируемыми порами. Полезными аффинными носителями являются носители с высоким отношением площади поверхности к объему, химическими группами, которые легко модифицируются для ковалентного присоединения лигандов, минимальными свойствами неспецифического связывания, хорошими характеристиками текучести и механической и химической стабильностью.

      Аффинная хроматография (АС). Аффинная хроматография основана на обратимом взаимодействии между целевым белком или группой белков и специфическим лигандом, иммобилизованным на хроматографической смоле. Этот процесс отличается исключительной селективностью и обеспечивает высокое разрешение при емкости загрузки образца от средней до высокой. Исследуемый белок прочно связывается со смолой в условиях, способствующих специфическому связыванию с лигандом, а несвязанные загрязнения смываются. Затем связанный белок извлекают в высокоочищенной форме путем изменения условий в пользу элюирования. Условия элюирования могут быть специфическими, например, при использовании конкурентного лиганда, или неспецифическими, например, при изменении pH, ионной силы или полярности. Целевой белок элюируется в очищенной и концентрированной форме.

      Узнать больше

      • Обзор аффинной очистки
      • Электронный курс подготовки образцов белков

      Выбрать продукты

      • Очистка белков с помощью аффинной хроматографии 6057
      • 7
      • 7 Очистка образца для электрофореза

        Разделение и анализ белков с помощью электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE) – обычная лабораторная процедура. Однако многие вещества мешают анализу SDS-PAGE. Доступные в продаже продукты помогают ускорить обработку образцов для анализа SDS-PAGE образцов, содержащих мешающие вещества. Многие из них способны быстро удалять широкий спектр соединений, включая высокие концентрации солей, гуанидин, мочевину и неионогенные детергенты. Набор для подготовки проб SDS-PAGE от Thermo Scientific содержит запатентованную смолу, которая связывает белки в присутствии органической фазы. Любые мешающие загрязнения смываются, а белки затем элюируются в буфере, совместимом с анализом белков BCA, что позволяет количественно определить часть обработанного образца.

        Удаление детергентов увеличивает разрешение разделения белков. Содержащие детергент, мембранные (m) и растворимые (s) белковые фракции, полученные в результате экстракции с помощью набора Thermo Scientific Mem-PER (номер детали 89826), разделяли с помощью SDS-PAGE с предварительной обработкой SDS-PAGE Sample и без нее. Подготовительный комплект.