Мин 1 индикатор напряжения цена
| Основные атрибуты | |
| Страна производитель | СССР Россия |
| Состояние | Новое |
| Функции | Прозвонка цепи |
| Монитор | Нет |
| Индикация | Световая |
| Питание | Сеть от 110В |
| Напряжение | 500.0 (В) |
Показать все
Индикатор напряжения МИН 1Цена указана без НДС и действительна при оплате на ООО. При оплате на ИП возможна скидка до -30%.
Назначение.
МИН1 предназначен для работы в электрических цепях с частотой тока 50 Гц и напряжением от 110В до 500В.
Делаем доставку по городам и регионам: Москва, Тверь, Тула, Брянск, Липецк, Смоленск, Нижний Новгород, Ярославль, Вологда, Санкт-Петербург, Петрозаводск, Казань, Ульяновск, Пенза, Самара, Саратов, Волгоград, Ростов-на-Дону, Краснодар, Ставрополь, Владикавказ, Махачкала, Уфа, Оренбург, Челябинск, Мурманск, Салехард, Ханты-Мансийск, Омск, Тюмень, Барнаул, Абакан, Красноярск, Иркутск, Чита, Хабаровск, Владивосток, Майкоп, Улан-Удэ, Горно-Алтайск, Назрань, Нальчик, Элиста, Черкесск, Петрозаводск, Сыктывкар, Йошкар-Ола, Саранск, Якутск, Казань, Кызыл, Ижевск, Чебоксары, Благовещенск, Архангельск, Астрахань, Белгород, Владимир, Воронеж, Иваново, Калининград, Калуга, Петропавловск-Камчатский, Кемерово, Киров, Кострома, Курган, Курск, Магадан, Великий Новгород, Новосибирск, Орел, Пермь, Псков, Рязань, Южно-Сахалинск, Екатеринбург, Тамбов, Томск, Анадырь и т.
д.
- 2 — с хранения
- —
- Описание
- Предложить цену
- Наличие
Характеристики
Номенклатурная группа индикатор напряжения Базовая единица шт Модель МИН-1 Вы можете задать любой интересующий вас вопрос по товару или работе магазина.
Наши квалифицированные специалисты обязательно вам помогут.
Предложить цену
- Персональные рекомендации
© LLC AMEO 2006 — 2019
Automation and Electrical
Marine Equipment
Указатель напряжения УННУ-1Н 50-1000В
Указатель напряжения WN-1-1
Стабилизатор напряжения Uniel (09496) 500ВА RS-1/500LS
Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04.
007.006)
Указатель напряжения УННУ-1Н, световой индикатор, поляр.
Указатель высокого напряжения УВН80-2М 6-10кВ с газораз.
Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04.007.006)
Указатель тока цифровой F&F WT-1 (ЕА04.008.001)
Указатель напряжения ЭИ-9000 от 50-1000В
Индикатор напряжения ПИН-90М 50В-1000В переменного и по.
Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ с испытанием
Указатель напряжения СЕМ DT-9902
указатели напряжения тока F&F WN-1 230в
IEK Мультиметр MY64 + индикатор напряжения ОП-1 TMD-5S-.
Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля)
Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ ИП М с испытанием
Указатель напряжения однофазный LK-712 (EA04.007.001)
Указатель напряжения УНН-1Д (40-1000В) Диэлектрик
Указатель напряжения ПИН-90М ВЛ (UNN102)
Указатель напряжения «WN-1-1», 1 фаза, 230 В.
Указатель напряжения УНН-1 СЗ ИП с испытанием
тестер напряжения yato 1.
5-9v 70-250v звуковой
Указатель напряжения «WN-1-1», 1 фаза, 230 В.
Указатель напряжения ПИН-90
Указатель напряжения и правильности подключения DT-9021.
Указатель напряжения ЭИ-9000, световой индикатор, поляр.
Вольтметр (индикатор напряжения) РН-11 1-ф, диапазон из.
Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.
Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.
Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля) (за 1шт.
DMV-1T указатель напряжения
Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.
Указатель напряжения Мегеон 55001
Указатель низкого напряжения унн-1 д 40-1000В диэлектри.
Указатель напряжения WN-1, однофазный, 100-300В, цифров.
Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.
Указатель напряжения трехфазный LK-713 (EA04.007.002)
Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.
Указатель напряжения УН-1Н-М с испытанием
Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.
Указатель низкого напряжения Контакт 53 ЭМ (UNN127)
Детектор напряжения FLUKE 1AC-E2-II
Беcконтактный индикатор напряжения Fluke LVD1A с фонаре.
Указатель напряжения wn-1-1 (1ф 100-300в цифр. индик. 3.
Индикатор напряжения IEK ОП-2Э
Однофазный индикатор тока и напряжения VA1F (2 модуля).
Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.
Указатель высокого напряжения увн-10 д световая индикац.
Детектор напряжения — 5 шт FLUKE 1AC-E1-II-5PK
|
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Нижний Новгород,
0 Голосов: 1 
.. +45°С
1 сек, для ЖК-дисплея – 2 сек
1 сек, для ЖК-дисплея – 2 сек
0 Голосов: 1 
.. +45°С
х 1,5 В тип AAA
х 1,5 В тип AAA
0 Голосов: 1 Указатели напряжения до 1 кВ промышленного изготовления
- Подробности
- Категория: Средства защиты
Примечания: 1.
Для указателей ИН-92 и ПИН-90 в числителе указано рабочее напряжение на переменном токе, в знаменателе — на постоянном; в скобках (для ИН-92) указаны размеры щупа с контактом.
- Длина соединительного провода для указателя УН-1 0,6 м, МИН-1 0,64 м, ПИН-90 0,8 м, УНН-10, ИН-92, УННУ-1 и УНН 1 м и УННЛ-1 1,1 м.
- Напряжение зажигания указателя ПИН-90 не более 50 В, остальных типов — не более 90 В.
- Размеры двухполюсных указателей приведены для развернутого состояния указателя.
Таблица 2. Указатели и сигнализаторы напряжения свыше 1 кВ промышленного изготовлении
Примечания:
- Расшифровка буквенной части обозначения: УВН — указатель высокого напряжения (Ф — для фазировки, Б — бесконтактный, У — универсальный), СН — сигнализатор напряжения (И — индивидуальный, С — стационарный), СОН — сигнализатор опасного напряжения.
- В числителе — габариты в рабочем состоянии, в знаменателе — в транспортном положении (в чехле).
- Указатель УВН-80М заменяется указателем УВНУ.
- Указатель УВНУ комплектуется трубкой фазировки ТФ-10, в рукоятку указателя встроено устройство проверки указателя ПН-0,1.
- Напряжение зажигания указателя УВН-90 9 кВ, УВНУ 1,5 — 7,6 кВ (при 6 кВ) и 2,7—12,7 кВ (при 10 кВ) соответственно для встречного и согласного включения, УВНФ 20—40 кВ (при 35 кВ) и 50 — 100 кВ (при 110 кВ) соответственно для встречного н согласного включения; для остальных указателей 6—10 кВ напряжение зажигания 0,55 кВ. Для указателя УВНБ и сигнализаторов напряжения минимальное расстояние между рабочей и токоведущей частями, находящимися под напряжением 6 кВ, не менее 50 мм для УВНБ, 1,4 м для СНИ и 0,4 м для СНС-1.
- Для проверки указателей напряжения может использоваться приспособление ППУ, изготовленное СКТБ ВКТ Мосэнерго по ТУ 34-28-10032 —80: габариты 114 x 70 x 40 мм, масса 230 г, напряжение на выходе 600-800 В.
| ИНДИКАТОРЫ НАПРЯЖЕНИЯ, УКАЗАТЕЛИ НАПРЯЖЕНИЯ | ||||
| Рисунок | Наименование изделия, назначение |
Тип | Параметры | Информация |
| Индикатор напряжения — однополюсный (отвертка) | ИН-91 индикатор-отвертка ИН 91 М, ИН 1 УНО |
110 — 380 В 110 — 380 В |
||
Индикаторы напряжения двухполюсные —
определяют наличие напряж. между неизолир. проводн. |
ПИН-90 ЭИ 9000/1 ЭИ9000 ПИН-90-2М ПИН-90М (МИН-1) |
50-1000 В 90-1000 В 90-1000 В 50-1000 В 50-1000 В |
Узнать больше -> | |
| Указатели напряжения со штангой | УН-500 УН 500И УН 500М |
90- 500 В | Узнать больше -> | |
| Указатели низкого напряжения однополюсные | УНН УНН-1 УНН1СЗ УНН1 СЗ ИП |
40-660 В 50 — 1000 В |
||
| Указатели напряжения со светозвуковой индикацией — определяет фазу, полярность и примерную величину | ЭЛИН-1 ЭЛИН-1СЗ-ИП ЭЛИН-1СЗ ЭИ 9000 СЗ |
25 — 400 В 40-400 В 70-500 В |
Узнать больше -> | |
| Указатели напряжения для воздушных линий с возможностью примерного определения напряжения | ЭЛИН-1-СЗ ВЛ | 12 — 400 В | ||
| Электронный указатель напряжения для троллейбусных линий | ЭЛИН-075 ТР | 10 — 750 В | ||
| Указатель напряжения для воздушных линий со светозвуковой индикацией | УН-1 УН-1 Н |
для ВЛ 60-660 В |
Узнать больше -> | |
| Указатель напряжения для воздушных линий | ПИН-90-2МУ | для ВЛ до 1000 В | ||
| Указатель напряжения — для подземных электроустановок переменного тока (шахт), взрывобезопасный | УН-453 | 800 — 1140 В | Узнать больше -> | |
| Указатели напряжения двухполюсные — может прозвонить цепи за счет встроенного заряженного конденсатора, ЭМ — кроме светодиодного имеют также звуковую индикацию | Контакт 55Э Контакт 55ЭМ (светозвуковой) Контакт 57Э |
24, 220, 380 В 24, 220, 380 В 70 — 1000 В |
||
| Указатель напряжения двухполюсный | УННУ-1 УННУ-1МС УННУ-1Н (М) |
12-500 В 25-1000 В |
||
| Устройство для проверки указателей напряжения | УПУН-1 | свыше 1000 В | ||
Указатели высокого напряжения — для
кабельных линий. Длина изолирующей части 280(380)мм |
УВН-80 УВН80-2М, УВН 80-2М/1 УВН 80-2МН (новинка) УВН80-3М (УВН-80) УВНУ-2М, УВНУ-2М/1 УВН-90 УВН-35, УВН90М35 УВН-110 (УВН90), УВН 90 М 110 УВН-220 (УВН90), УВН 90 М 220 УВН 35-220 УВН 90 М 35-220 |
2 — 10 кВ 2 — 10 кВ 20 — 35 кВ |
Узнать больше -> | |
| Указатели высокого напряжения — имеют встроенное устройство самопроверки | УВН-90 С УВН90М-35С УВН90М-110С УВН90М-220С |
20 — 35 кВ 35 — 110 кВ 110 — 220 кВ |
||
| Указатели высокого напряжения контактные и бесконтактные (дистанционные), типа УВНК-10 Б | УВН-10 УВНУ-10 УВНУ10 СЗ ИП КБ УВНУ10 СЗ ИП КБ с ТФ УВН 90 М 35 СЗ ИП КБ УВН 90 М 110 СЗ ИП КБ УВН 90 М 220 СЗ ИП КБ УВН 90 М 35-220 СЗ ИП КБ УВНУ-10 СЗ ИП Комби УВНУ-35 СЗ ИП Комби УВНУ-110 СЗ ИП Комби |
2 — 10 кВ |
||
| Указатели высокого напряжения — для
кабельных линий и воздушных линий со светозвуковой индикацией (УВНУШ-10СЗ-ИП со штангой) |
УВНУ-10 СЗ УВНУ-10 СЗ ИП УВНУ-35 СЗ УВН-90 М35 СЗ УВНУ-110 СЗ УВН-90 М110 СЗ УВН-90 М220 СЗ УВНУШ-10 СЗИП |
2 — 10 кВ |
Узнать больше -> | |
| Указатели высокого напряжения бесконтактные | УВНБ УВНБ-35 УВНБ-110 УВНБ-220 УВНБ-6-35 УВНБ-35-220 |
|||
| Устройство ускоренного поиска повреждений — при коротких замыканиях на землю для кабельных и воздушных линий | УПП-10 УПП-10М УПП-6/10-3Г |
6 и 10 кВ | Узнать больше -> | |
| Указатели высокого напряжения для фазировки — состоят из указателя и фазировки | УВН80-2М с ТФ УВН80-2М/1 с ТФ УВН80-3М с ТФ УВНУ-2М с ТФ УВНУ-2М/1 с ТФ УВНУ-10СЗ-ИП с ТФ |
2,2 — 10 кВ | Узнать больше -> | |
Однополюсные индикаторы напряжения.
Как пользоваться индикаторной отверткой С электричеством нужно быть на Вы!!! (мудрость, проверенная временем).
Многие, наверное, слышали, что настоящий электрик не тот, что не боится электричества, а тот, который способен избежать прямого контакта с электричеством. По статистике, от поражения электрическим током, погибают чаще всего электрики со стажем от десяти и более лет. Именно в этом возрасте притупляется чувство опасности. Некоторые электрики со стажем проверяют наличие электричества на ощупь, да-да, именно на ощупь. Но зачем рисковать жизнью собственной, когда есть приборы, показывающие наличие напряжения?
Приборов показывающих наличие напряжения достаточно много — от самого простого индикатора напряжения на газоразрядной лампочке (неонке) и заканчивая приборами показывающими не только наличие напряжения но и множество других параметров.
В данной статье мы рассмотрим индикаторы и указатели напряжения
, которые чаще всего используют в своей практике, как профессиональные электрики, так и домашние мастера.
В электроустановках чаще всего применяются указатели с сигнальными лампами.
Относительно недавно у нас появились индикаторы напряжения, позволяющие обнаружить наличие напряжения без прямого контакта с токоведущим проводником.
Примером данного типа приборов служит индикатор китайского производства (хоть везде и пишется, что сделано в Германии) — MS-18, MS-58 и.т.д.
Состоят такие индикаторы из светодиода, двух миниатюрных батареек и пары радиодеталей. Такими индикаторами можно безопасно пользоваться, имея достаточно опыта и знаний в электричестве, так как индикаторы эти реагируют на все подряд. Начинающим электрикам и людям без опыта, использовать данные пробники нежелательно и даже опасно.
Двухполюсный указатель напряжения
состоит из неоновой лампы, добавочного сопротивления и контактов 1. Неоновая лампа , чтоб не возникало свечения под действием емкостного тока. Элементы указателя закреплены в двух пластмассовых корпусах 2, соединенных гибким проводом 3 длиной 1 м с изоляцией повышенной надежности.
Двухполюсные указатели требуют прикосновения к двум точкам электроустановки, между которыми необходимо определить наличие или отсутствие напряжения.
Разновидностей таких индикаторов достаточно много. По функционалу они тоже отличаются.
Самые простые индикаторы показывают только наличие напряжения. Примером такого индикатора можно назвать приборы серии ПИН-90 (-2м, -2му), УН500,-453, УННУ-1, УНН-10, МИН-1 и т.д. Более продвинутые модели — серии ЭЛИН-1 (-СЗ, -С3 ИПМ, -С3 Комби) и многие другие приборы, показывают не только наличие напряжения на исследуемом участке цепи, но еще и его номинал, полярность напряжения.
В качестве индикации используются: неоновые лампочки, светодиоды различных цветов, цифровые и индикаторы. Также существуют и комбинированные индикаторы, где наряду со световой индикацией присутствует и звуковая, что делает работу с приборами более комфортной и безопасной.
В отличие от однополюсных указателей и индикаторов, для того чтобы узнать о наличии напряжение данными (двуполюсными) приборами, необходимо использование двух щупов.
Применение таких приборов дает более полную картину о наличии или отсутствии напряжения, что, несомненно, очень важно в работе электриков.
Кроме проверки на наличие или отсутствия напряжения на участке исследуемой цепи, некоторые двуполюсные индикаторы можно использовать в качестве «прозвонки», то есть, проверить цепь на обрыв.
Также достаточно популярны среди электриков цифровые приборы — . Эти универсальные приборы позволяют проверить напряжение, сопротивление и т.д. В качестве индикации используется цифровое табло, звуковая и световая индикация.
Некоторые модели оснащены , не нарушая изоляции проводника. Также многие модели тестеров комплектуются термодатчиком, при помощи которого можно измерить температуру оборудования — трансформаторов, двигателей, силовых ключей.
Предостережения:
1. Использовать в качестве указателя напряжения контрольную лампу (обычный патрон с двумя выводами) в сетях с линейным напряжением больше 220 В не разрешается, так как при ошибочном включении на линейное напряжение в сети 380/220 В лампа взрывается и осколки могут ранить работающего.
2. В практике часто изготовляют однополюсные указатели напряжения своими силами, обычно в виде отвертки. При этом бывают случаи неправильного изготовления, и тогда возникает опасность поражения током. Нельзя делать стержень отвертки длиной более 20 мм. Если стержень длинный, возникает опасность прикосновению к нему во время проверки напряжения. Желательно плотно натягивать на стержень изолирующую трубку, оставляя неизолированным участок длиной не более 5 мм. Со стороны, близкой к источнику напряжения, обязательно должно быть упорное кольцо, выступающее на 3-4 мм, чтобы не допустить соскальзывания руки.
Особое внимание нужно уделить выбору неоновой лампочки, чтоб порог зажигания не превышал 90 В. Наиболее подходит лампа типа ИН-3. Добавочное сопротивление должно быть не менее 200 кОм.
Корпус следует изготовлять из эбонита или пластмассы темного цвета, при котором легче заметить свечение лампочки. Изготовленные указатели следует обязательно испытать.
В любом случае, используя индикаторы и указатели напряжения, необходимы знания и навыки при работе с ними.
Также не стоит забывать и о технике безопасности. И, доверяйте профессионалам, электричество, как известно, шуток и ошибок не прощает!
Электричество является непременным атрибутом современной жизни. Уже трудно себе представить дом без всяких бытовых приборов, которые обеспечивают комфорт и облегчают хозяйке домашние хлопоты. Но в то же время большое количество мощных потребителей негативно сказывается на электрической проводке. Часто случаются мелкие неисправности, например, стала искрить розетка, выключатель или другие поломки. Каждый раз вызывать квалифицированного электрика накладно, да и большинство подобных поломок легко можно устранить самостоятельно. Для правильного подключения бытовых приборов и дополнительной безопасности работы с электропроводкой нужно определить не только фазу, но и ноль. Чаще всего для этого используется пробник напряжения в виде отвертки. О том, как пользоваться индикаторной отверткой и поговорим сегодня.
Индикаторная отвертка — принцип действия и виды
.
Сегодня в виде обычной отвертки выпускается большое количество индикаторов напряжения. Все они имеют общий принцип работы, но могут отличаться устройством и формой исполнения. Условно такие индикаторы делятся на три группы. Рассмотрим их более подробно.
Простая индикаторная отвертка
Устройство обычного пробника в виде отвертки достаточно простое:
Жало выступает в роли проводника;
К нему подключен тиристор, понижающий силу тока до безопасной для человека величины;
Затем расположен светодиод, который соединен с контактным элементом, выведенным на торец отвертки;
Корпус выполнен из прозрачного пластика, который позволяет видеть, когда светодиод загорается.
Такую конструкцию имеет самый простой и дешевый пробник напряжения, который позволяет определить только рабочую фазу. Ноль этой отверткой можно найти методом исключения. Для того чтобы найти фазу в проводах с помощью индикаторной отвертки, нужно поступить следующим образом:
Жалом отвертки поочередно касаются ко всем проводам контактной группы: розетки, выключателя или обрыва в проводке.
При этом нужно пальцем (удобнее большим) прикасаться к контактной пластине, которая выведена на корпус;
При прикосновении к фазе, индикатор начнет светиться, а ноль свечение диода не вызывает.
Таким нехитрым способом индикатор показывает, где фаза или ноль в проводах или розетке. После этого можно правильно сделать подключение бытового прибора, для которого важно соблюдать полярность.
Обратите внимание! Такие работы проводятся при включенном автомате на щитке. Если необходимо определить фазу на концах проводов, их предварительно нужно зачистить и развести в стороны, чтобы не вызвать короткое замыкание.
Индикаторная отвертка с батарейкой
Принцип работы, внешний вид и устройство такого пробника напряжения ничем не отличается от вышеописанной отвертки. Отличием является наличие двух или трех батареек «таблеток», скрытых в ручке. Этот прибор является более универсальным и позволяет выполнить такие действия:
Найти фазу и ноль в проводах под напряжением;
Определить обрыв в обесточенной цепи.
Для этого одного конца провода нужно коснуться рукой, а другой — щупом отвертки. Если цепь не нарушена, индикатор загорится. При обрыве в проводке, индикатор напряжения ничего не покажет;
Кроме этого, такой инструмент за счет приведенного магнитного поля показывает расположение скрытой проводки. Для этого отвертка пальцами берется за жало, а ручкой ведется вдоль стены. При обнаружении запитанной проводки светодиод загорится.
Совет. Такая особенность данного устройства очень полезна в случае, когда необходимо проверить стену и определить расположение проводки перед сверлением отверстия.
Универсальная индикаторная отвертка
Такое устройство отверткой называют больше по привычке, скорее это мини-тестер. Работает инструмент от батареек, а внешний вид сильно отличается от предыдущих вариантов. На передней панели прибора располагается два светодиода (красный и зеленый), также в зависимости от модели может быть небольшой дисплей, на который выводится показатель измеренного напряжения.
Индикатор имеет кнопку выбора режима измерения. Рассмотрим принцип и назначение различных режимов:
Режим O применяется для того, чтобы найти фазу контактным способом. При наличии напряжения на проводнике, загорается красный светодиод;
В режиме L прибор работает при пониженной чувствительности. Этот режим позволяет бесконтактно определить наличие напряжения в скрытой проводке глубиной залегания до 1,5 см. При обнаружении электромагнитного поля загорается зеленый светодиод и раздается писк зуммера;
Положение H обозначает режим высокой чувствительности. Этот режим позволяет найти фазу и ноль (подключенной проводки) на глубине до 3 см.
Также это устройство позволяет провести проверку цепи на разрыв, измерить сопротивление до 100 МОм, можно определить полярность, и измерить напряжение источника постоянного тока до 36 В. Этот прибор пригодится в качестве домашнего тестера: он позволяет проверить работоспособность лампы или другого электрического прибора с замкнутой цепью.
Можно проверить любой нагревательный прибор, например, тен или камин при пробое на корпус.
две фазы
Разобравшись, как пользоваться индикаторной отверткой, хотелось бы рассказать об интересной неисправности в электрической сети. Бывает так, что во время проверки, например, розетки, пробник определяет фазу на обоих проводах. В этом случае не пугайтесь, ничего страшного не произошло. Скорее всего, просто пропал ноль, а фаза по замкнутой цепи пошла дальше, потому тестер и определяет ее на обоих проводах. Рассмотрим вероятные места, где мог пропасть ноль и причины, по которым это произошло:
1. Наиболее распространенным местом обрыва нулевого провода является подъездной щиток. Практически всегда он находится в общем доступе, и проводов там намотано много. Поэтому прежде всего нужно проверить свой вывод на щитке, разобрать, зачистить место подключения и заново прикрутить ноль;
2. Второй распространенной причиной является выбитый автомат или пробка на счетчике в самой квартире.
Причиной этого могла стать повышенная перегрузка. Стоит отметить, именно потому, что это приводит к появлению фазы на обоих проводах, по новым требованиям ПУЭ установка автоматического размыкателя на нулевом проводе запрещена;
3. Часто ноль «теряется» в распределительной коробке, расположенной в комнате. Причина — слабый контакт и повышенная нагрузка;
4. В частных домах кабель могут повредить мыши. Причем до сих пор непонятно, чем грызунов привлекает изоляция, но факт остается. Поэтому в коттеджах не рекомендуется прокладывать открытую проводку, особенно на чердаке и под полом. Все провода должны быть уложены в штробы или дополнительно защищены;
5. Сверление стен — один из факторов, который может повлечь за собой обрыв провода. Поэтому профессиональные электрики перед подобными работами всегда рекомендуют проверять место сверления с помощью индикатора скрытой проводки.
подводим итоги
В заключение отметим, что пробник должен быть в любом доме. Это может быть как простая индикаторная отвертка или дорогой электронный вариант: каждый выбирает по возможностям и потребностям.
Сложности в их использовании нет никакой: при правильной эксплуатации вероятность поражения током полностью исключена.
Вы, наверное, не раз видели индикатор напряжения в форме ручки. Его удобно носить в нагрудном кармане рубашки или спецовки. Некоторые современные модели таких индикаторов могут обнаружить напряжение даже без металлического контакта с токоведущим проводником. Этому виду электрозащитных средств и посвящена наша статья.
Терминология
В многочисленных статьях, размещенных в Сети, можно встретить термины «указатель напряжения», «указатель низкого напряжения», «индикатор напряжения». При этом зачастую никакого разграничения между областями их использования не приводится, а иногда они даже отождествляются. Попробуем разобраться в этом вопросе.
Многочисленные правила применения электрозащитных средств, которые постоянно изменяются и переиздаются, всегда оперируют термином «указатель напряжения». При этом все подобные приборы разделяются на двухполюсные, состоящие из двух корпусов, соединенных гибким изолированным проводником; и однополюсные, содержащие один корпус.
Первые работают на активном токе, протекающем через оба корпуса, а вторые — на емкостном, протекающем через тело пользователя.
Широко используемый в обиходе термин «индикатор напряжения» относится именно ко второму типу указателей. Их ранние модели выпускались в виде отвертки с индикатором-лампочкой в рукоятке. Современные устройства больше похожи на строительный маркер (правда, с металлической контактной частью на конце).
Несколько слов об окружающих нас емкостях
Как работает емкостный индикатор напряжения? Чтобы понять это, давайте вернемся на мгновение к электрической теории цепей и вспомним, как функционирует конденсатор. Он имеет два проводника, или пластины, разделенные диэлектриком. Многие думают, что конденсаторы — это отдельные элементы электронных схем, но в действительности мир заполнен конденсаторами, присутствия которых мы обычно просто не замечаем. Вот пример. Предположим, что вы стоите на ковре, покрывающем бетонный пол прямо под горящим светильником с напряжением 220 В.
Хотя вы этого и не ощущаете, но ваше тело проводит очень небольшой (порядка микроампера) переменный ток, так как оно является частью цепи, состоящей из двух последовательно включенных конденсаторов. Двумя пластинами первого конденсатора являются нить накала в электролампочке и ваше тело. Диэлектриком — воздух (и, возможно, ваша шляпа) между ними. Пластинами второго конденсатора являются ваше тело и бетонный пол (он достаточно хороший проводник).
Диэлектрик второго конденсатора — это ковер плюс ваши ботинки и носки. Поскольку бетонный пол хорошо заземлен, как и нулевой провод питающей сети, к цепи из двух этих последовательных конденсаторов приложено напряжение в 220 В.
А где же здесь индикатор напряжения?
Понимание того, как напряжение сети делится между двумя последовательными конденсаторами, имеет решающее значение для выяснения, как работает емкостной индикатор.
Вернемся к теории электрических цепей. В последовательной цепи напряжение будет распределяться по величине сопротивления (закон Ома).
У конденсатора, чем меньше его емкость, тем больше так называемое емкостное сопротивление переменному току. Таким образом, когда два конденсатора соединены последовательно, наибольшая доля приложенного к ним напряжения будет падать на меньшем приборе.
В приведенном выше примере только несколько вольт находится между ногами и полом (на большой емкости), а остальная часть из 220 В приложена между вашей головой и нитью накала лампочки (к меньшей емкости). Теперь, если вы держите большой палец на контактной площадке на торце рукоятки емкостного индикатора и прикасаетесь им к оголенному участку провода, питающего светильник, то вместо малой емкости в цепь протекания емкостного тока оказывается включенной чувствительная к малым токам схема индикатора напряжения. Ток этот, конечно, возрастает, но высокоомный резистор внутри индикатора ограничивает его до неопасной величины. В результате протекания тока в индикаторе светится неоновая лампа или светодиод либо звучит зуммер.
Традиционный емкостный индикатор
Индикаторы напряжения сети в виде отвертки, показывающие, на какой контактный штырек электророзетки выведена фаза, а на какой — нуль, появились еще в 60-х годах прошлого века.
Их электросхема включает последовательно соединенные металлическое щуп-жало, высокоомный резистор в диапазоне сопротивлений от 0,47 до 1 МОм с малой собственной емкостью между его выводами (например, типа МЛТ-1,0, ВС-0,5, МЛТ-2,0), неоновую лампочку и контактную площадку на торце рукоятки. При касании жалом отвертки «фазного» проводника и замыкании цепи емкостного тока через контактную площадку и тело пользователя неоновая лампочка светится, что является признаком напряжения в рабочем диапазоне индикатора от 90 до 380 В (иногда — от 70 до 1000 В) при частоте тока 50 Гц.
Почему именно неоновая лампочка?
Можно ли ее заменить на другой индикатор? Долгое время считалось, что нет. Действительно, при емкости человеческого тела порядка сотен пФ и напряжении U = 220 В максимальный емкостной ток частотой f = 50 Гц через него на «землю» составляет U/(1/ωC) = U2πfC = 220 х 6,28 х 50 х n100 пФ = n7 мкА. А чтобы засветился светодиод, через него должен пройти ток порядка миллиампера. Тем не менее, были найдены особые схемные решения, позволившие создать индикатор напряжения на светодиодах, пьезокерамических зуммерах и других элементах индикации.
От неоновой лампочки к светодиоду
Решение состояло в изменении самого режима свечения с непрерывного на импульсный. Если попробовать оценить мощность, потребляемую неоновой лампой, то при напряжении 100 В и емкостном токе 20 мкА она составит 100 х 20 мкА = 2 мВт. Если подводить такую мощность к светодиоду в течение интервала времени, например, 10 мс, а не целую секунду, то он на этом интервале вполне хорошо засветится. Ведь при напряжении 100 В ток через него составит 0,002 Вт х 100/100 В = 0,002 А = 2 мА.
Если обеспечить накопление энергии в некоторой схеме (например, в релаксационном генераторе) в течение долей секунды, а затем — резкий ее сброс на светодиод за 10 мс, то последний будет периодически ярко вспыхивать. Получится светодиодный индикатор напряжения без встроенной батарейки.
Каким путем пошли в Китае?
Китайские разработчики решили, что раз светодиоду для непрерывного свечения требуется постоянный ток порядка нескольких миллиампер, то нужно встроить в индикатор пальчиковую батарейку (или две).
При этом ток через светодиод открывает простейший транзисторный ключ, управляемый емкостным током через тело пользователя.
Упростилась ли схема? В общем-то, да, но она стала чрезвычайно чувствительной к разного рода наводкам. Поэтому надежность показаний таких индикаторов под вопросом.
Индикатор напряжения цифровой
Свечение неоновой лампочки или светодиода, конечно, надежный способ индикации наличия напряжения, но уж слишком малоинформативный, если цепь имеет несколько уровней напряжения. В этом случае на помощь приходит бурно развившаяся в последние десятилетия измерительная электроника.
Самым простым способом придать индикатору большую информативность является введение в его схему нескольких компараторов напряжения, которые срабатывают при разных его уровнях. Выход каждого из компараторов управляет своим элементом индикации на корпусе прибора.
Настоящий же индикатор напряжения цифровой получается, если измеряемое напряжение оцифровывается на встроенном АЦП, а затем через специальную схему подается на семисегментные элементы индикации, способные отобразить цифры от 0 до 9, или на малогабаритный матричный цифровой индикатор.
По такой схеме строятся дорогостоящие профессиональные индикаторы напряжения.
Применяемые во время эксплуатации и ремонтов электроустановок.
Сегодняшняя статья будет посвящена указателям низкого напряжения.
Указатели низкого напряжения (УНН) применяются для проверки наличия, либо отсутствия напряжения в электроустановках до 1000 (В) на тех токоведущих частях, где будут выполняться работы. Также УНН используют для проверки совпадения фаз, т.е. фазировки низковольтного .
Указатели низкого напряжения, или по-другому их еще называют указатели напряжения до 1000 (В) бывают 2 типов:
- однополюсные
- двухполюсные
Поэтому и применение будет зависеть от того, какой Вы указатель используете.
Существует большое количество разновидностей указателей низкого напряжения от различных производителей.
На каждом виде я останавливаться не буду, а расскажу только о самых распространенных и надежных указателях низкого напряжения, применяемых лично мною.
Например, однополюсный указатель низкого напряжения в виде индикаторной отвертки применяется в электроустановках только переменного тока напряжением от 100 (В) до 500 (В) и частотой 50 (Гц). Принцип действия такого указателя основан на протекании емкостного тока.
Двухполюсный указатель низкого напряжения (УНН-10К) имеет более широкое применение. Его можно использовать в электроустановках, как переменного тока напряжением от 110 (В) до 500 (В) и частотой 50 (Гц), так и постоянного тока напряжением от 110 (В) до 500 (В).
Его принцип действия основан на свечении газаразрядной лампы при протекании через нее активного тока.
Двухполюсный указатель низкого напряжения (ПИН-90М) использую ни чуть не реже. Его принцип действия и конструкция аналогична УНН-10К.
Разница заключается лишь в пределах контролируемого напряжения. У него рабочее напряжение находится в пределах от 50 (В) до 1000 (В).
- испытание изоляции рукояток и проводов
- испытание повышенным напряжением
- определение напряжения индикации
- измерение тока, проходящего через УНН при наибольшем рабочем напряжении
1.
Испытание изоляции рукояток и проводов указателей низкого напряжения
Испытание изоляции рукояток корпусов и проводов указателей низкого напряжения проводится 1 раз в год по следующей принципиальной схеме:
Оба корпуса (рукоятки) двухполюсного указателя низкого напряжения заворачивают в фольгу. Соединительный провод опускают в ванну с водой, где температура воды должна находиться в пределах 10 — 40° С. Необходимо выдержать расстояние 0,8 — 1,2 (см) между водой и корпусами указателя.
Первый вывод от испытательного трансформатора соединяем к электродам-наконечникам. Второй (заземленный) вывод необходимо опустить в ванну с водой и соединить с фольгой.
Аналогично, проводят испытание изоляции корпуса (рукоятки) и у однополюсных указателей низкого напряжения. Корпус заворачивают в фольгу по всей длине. Необходимо выдержать расстояние 1 (см) между фольгой и электродом, находящимся на торцевой части указателя. Один вывод от испытательного устройства соединяем к электроду-наконечнику.
Другой (заземленный) вывод — к фольге.
Для УНН с рабочим напряжением до 500 (В) испытательное напряжение 1000 (В) подается в течение 1 минуты.
Для УНН с рабочим напряжением до 1000 (В) испытательное напряжение 2000 (В) подается в течение 1 минуты.
2. Испытание указателей низкого напряжения повышенным напряжением
Испытание указателей низкого напряжения повышенным напряжением проводится следующим образом.
Испытательное напряжение величиной 1,1 от наибольшего рабочего напряжения УНН прикладывается между электродами-наконечниками у двухполюсных указателей, или между электродом-наконечником и торцевой частью у однополюсных указателей в течение 1 минуты.
3. Определение напряжения индикации
Напряжение от испытательного устройства плавно повышают, при этом фиксируя напряжение индикации указателя напряжения (УНН).
Указатели низкого напряжения должны иметь напряжение индикации не более 50 (В).
4. Измерение тока, проходящего через УНН при наибольшем рабочем напряжении
Напряжение от испытательного устройства плавно повышают до наибольшего рабочего напряжения 1000 (В), при этом фиксируют величину тока, протекающего через УНН.
У двухполюсных указателей напряжения величина тока не должна превышать 10 (мА).
У однополюсных указателей напряжения величина тока не должна превышать 0,6 (мА).
Как пользоваться указателем напряжения?
Перед применением и использованием указателя низкого напряжения, необходимо убедиться в его исправном состоянии, путем прикосновения к токоведущим частям электроустановки, находящимся заведомо под напряжением. Также необходимо проверить наличие штампа о проведении испытаний УНН.
Проверка отсутствия напряжения указателем низкого напряжения производится на токоведущих частях путем непосредственного контакта. Время контакта должно быть не менее 5 секунд.
При использовании однополюсного указателя низкого напряжения применение не допустимо, т.к. необходимо обеспечить контакт между электродом на торцевой части корпуса и пальцем человека.
P.S. На этом статью на тему указатель низкого напряжения я завершаю. Если у Вас возникли вопросы при изучении материала статьи, то прошу задавать их в комментариях. Не забывайте подписываться на новые статьи с сайта. Новость о выходе новой статьи будет приходить Вам прямо на почтовый ящик.
Обзор линейно-интерактивного ИБП Ippon Back Comfo Pro II 1050 с большим количеством выходных розеток
Новая линейка источников бесперебойного питания Ippon Back Comfo Pro II предназначена для обеспечения бесперебойной работы персональных компьютеров и графических станций, периферийной компьютерной техники, а также телекоммуникационного оборудования.
В нее входят три недорогих линейно-интерактивных ИБП с максимальной мощностью нагрузки 1050 В·А / 600 Вт, 850 В·А / 480 Вт и 650 В·А / 360 Вт.
Мы рассмотрим старшую модель Ippon Back Comfo Pro II 1050.
Описание
Для всей линейки заявлено:
- выходное напряжение в виде модифицированной синусоиды,
- наличие AVR (Auto Voltage Regulation),
- защита от всплесков, перегрузок и коротких замыканий,
- светодиодная индикация состояния,
- функция холодного старта,
- коммуникационный порт USB.
Количество выходных розеток у всех моделей линейки одинаковое: восемь типа CEE7/4 (или Schuko, с двумя боковыми плоскими контактами защитного заземления). Шесть из них подключены к инвертору/AVR и обеспечены бесперебойным питанием, еще две имеют только фильтрацию скачков напряжения в сети.
Кабель для подключения к сети переменного тока у всех трех моделей несъемный.
О чем не сказано прямо:
- о совместимости с нагрузками, источники питания которых имеют активную коррекцию фактора мощности (Active PFC),
- о поддержке стандарта Smart Battery.
Параметры и комплектация
В таблице представлены заявленные характеристики рассматриваемой модели, взятые из руководства пользователя и из русскоязычного раздела сайта производителя.
| Входное напряжение (номинальное) | 220 В |
|---|---|
| Диапазон входного напряжения | 165—290 В |
| Частота входного напряжения | 45—65 Гц |
| Выходная мощность | 1050 В·А / 600 Вт |
| Выходное напряжение (номинальное) | 220 В ±10% |
| Частота выходного напряжения | 50 или 60 Гц ±1 Гц |
| Автоматическая регулировка напряжения (AVR) | если Uвх > 242 В, то Uвых = 0,85 × Uвх если Uвх < 198 В, то Uвых = 1,18 × Uвх |
| Форма выходного сигнала при работе от батарей | модифицированная синусоида |
| Время работы от батареи на нагрузку | 30% — 6 минут 50% — 2 минуты 70% — 1 минута 100% — 1 секунда |
| Время переключения | типовое 2-6 мс, макс. 10 мс |
| Функция запуска оборудования без подключения к электросети (холодный старт) | есть |
| Тип, напряжение и емкость батареи | свинцово-кислотная необслуживаемая 1 × 12 В, 9 А·ч |
| Возможность подключения дополнительной батареи | нет |
| Максимальный ток заряда | н/д |
| Типовое время заряда | 4 часа до 90% |
| КПД | в линейном режиме >95% в режиме AVR >88% |
| Звуковая сигнализация | есть (отключается в программе Winpower) |
| Фильтрация импульсных помех | есть |
| Перегрузочная способность в линейном режиме | >110% выключится в течение 5 минут >120% выключится немедленно |
| Перегрузочная способность в режиме работы от батареи | >110% выключится через 5 с >120% выключится немедленно |
| Выходные разъемы | 6 × CEE7/4 (Schuko) с батарейной поддержкой 2 × CEE7/4 (Schuko) с защитой |
| Дополнительные разъемы | нет |
| Интерфейс | USB |
| Защита линий передачи данных | нет |
| Размеры (Ш×Д×В) | 125×254×150 мм |
| Вес нетто/брутто | 5,65 / 6,09 кг |
| Шум | < 40 дБ |
| Условия работы | влажность 0—90% (без конденсации) температура от 0 до +40 °C |
| Стандартная гарантия | 2 года (на батареи 1 год) |
| Описание на сайте производителя | ippon. ru |
Надо сказать, что перечень характеристик вполне исчерпывающий.
ИБП поставляется в коробке из обычного картона, в комплекте, кроме самого источника, лишь инструкция на русском языке и гарантийный талон. ПО для мониторинга и управления предлагается скачивать с официального сайта самостоятельно.
Внешний вид и органы управления
Корпус целиком выполнен из пластика матового черного цвета — отсутствие металлических внешних деталей и шасси стало уже стандартом для недорогих ИБП, причем нередко и более мощных.
Выходные розетки расположены не сзади, как у большинства аналогов (включая и многие модели Ippon), а «на спине», то есть на верхней крышке. Это не уникальное решение, однако встречается относительно редко, хотя позволяет разместить существенно большее количество розеток, да и добираться до них удобнее как при настольной, так и при напольной установке источника.
Соответственно задняя стенка практически пустая, из нее лишь выходит кабель для подключения к сети переменного тока (длина 1,6 м, отверстие снабжено защитой от перетирания), а еще имеется шток автоматического предохранителя и наклейка с информацией, включая серийный номер.
На лицевой панели органов минимальное количество: кнопка Power, единственный индикатор — зеленый светодиод (он горит непрерывно при питании от сети и мигает во время работы от батарей), а также разъем USB-B. По нашему мнению, этот порт все же лучше размещать на задней стенке: торчащий вперед USB-кабель легче случайно задеть и выдернуть или даже повредить, чем если бы он выходил сзади, а подключать или отключать его приходится редко.
Вентиляционные отверстия имеются на боковых и задней плоскостях, охлаждение у моделей линейки пассивное, без вентилятора.
Ножки есть, но «условные» — четыре небольших выступа на днище (подобное скорее является правилом, чем исключением). Снизу находится и крышка батарейного отсека.
Внутреннее устройство
Чтобы вскрыть корпус, нужно перевернуть его «вверх ногами», снять крышку батарейного отсека и извлечь АКБ, после чего удалить четыре больших самореза в колодцах на днище. Затем надо вернуть ИБП в нормальное положение и снять верхнюю крышку вместе с розетками.
В нижней части остаются: сзади — трансформатор с сердечником на Ш-образных пластинах, спереди — плата с электронными компонентами; в верхней — только розетки.
Инвертор выполнен на четырех МОП-транзисторах CS150N03, закрепленных на алюминиевом радиаторе в виде небольшого бруска без оребрения, но с боковыми выступами. Радиатор расположен рядом с трансформатором, то есть все нагревающиеся элементы сосредоточены в задней части источника.
Как уже говорилось, вентилятора в конструкции не предусмотрено.
Коммутация осуществляется пятью реле Golden GH-1C-12L, защита от импульсных помех содержит варистор и конденсатор.
Батарея
В нашем экземпляре была установлена свинцово-кислотная аккумуляторная батарея Ritar RT1290 с заявленными напряжением 12 В и емкостью 9 А·ч.
Обозначенные на корпусе батареи 9 А·ч действительны для 20-часового разряда, то есть для токов порядка 0,4-0,5 А, что соответствует всего нескольким ваттам отдаваемой в нагрузку мощности. А для нагрузок, близких к максимальной заявленной для ИБП, токи исчисляются десятками ампер, и емкость будет существенно меньше.
Обычно для защиты цепи заряда-разряда используют плавкие предохранители, но в данном случае они отсутствуют. Плохо это или не очень, подсказать могут лишь сотрудники сервисных центров, обладающие статистикой полезности таких предохранителей. Можно лишь сказать, что если они имеются, то всегда распаяны на плате, а потому явно не предназначены для замены пользователем.
Батарея начинает заряжаться, как только кабель питания ИБП подключается к розетке, в том числе когда источник не включен кнопкой.
В общем случае оптимальным для заряда считается ток порядка 0,1С, где С — обозначенная емкость аккумулятора, то есть в данном случае 0,9 А. В нашем случае в самом начале процесса зафиксирован заметно больший ток, но он очень быстро спадает.
Чтобы наглядно показать влияние потребляемого от батареи тока на глубину разряда и соответственно на время последующего восстановления энергии, мы сделали два цикла замеров для заряда после отключения при автономной работе с нагрузками 600 Вт и 200 Вт и последующего восстановления напряжения на входе ИБП. Результаты замеров зарядного тока, сделанные внешним прибором, приведены в таблице.
| Начальный ток | 5 мин. | 15 мин. | 30 мин. | 45 мин. | 1 час | 1,5 часа | 2 часа | 2,5 часа | 3 часа | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| После 600 Вт | 1,3 А | 1,2 А | 0,75 А | 0,4 А | 0,2 А | 0,1 А | менее 0,05 А | |||
| После 200 Вт | 1,4 А | 1,3 А | 1,2 А | 1,0 А | 0,7 А | 0,5 А | 0,25 А | 0,1 А | менее 0,05 А | |
Судя по току, вполне можно считать, что в первом случае для заряда потребовалось около 1,5 часов, во втором около 2,5 часов. Конечно, при разряде на меньшие нагрузки время еще увеличится, но в целом можно сделать вывод, что заявленные в спецификации «4 часа до 90%» соответствуют действительности, причем для большинства реальных нагрузок даже с немалым запасом.
Нагрев корпуса во время заряда практически не ощущается.
Программное обеспечение Winpower
Во время тестирования на сайте производителя предлагалась версия 5.7.0.3, скачивать ее нужно самостоятельно: в комплекте диска с ПО нет. Кроме того, потребуется ключ активации, он приведен на соответствующей странице официального сайта: 511C1-01220-0100-478DF2A. Зачем вообще потребовался такой запрос при установке — сказать трудно.
После установки программа включается в автозагрузку и отслеживает состояние ИБП, иконка для нее появляется в области уведомлений (системном трее). В случае каких-либо событий появляются небольшие окна с соответствующими предупреждениями.
В настройках программы можно выбрать русский язык.
Подключать источник к USB-порту компьютера можно как до, так и после установки ПО.
Как часто бывает, возможности программы гораздо шире, чем представляется необходимым и достаточным для рассматриваемого ИБП, о чем свидетельствует левое поле ее окна (см. скриншоты ниже). По понятным причинам мы не будем исследовать то, что не имеет прямого отношения к Back Comfo Pro II.
При этом наш источник сразу не отображается как задействованный программой, надо сначала войти в нее в качестве администратора (пароль по умолчанию Administrator, его можно изменять), после чего станет доступным автопоиск локального устройства.
Несмотря на то, что для данной модели предусмотрено только локальное подключение, источник отнесен в графу «LAN».
Клик по единственной строчке в правом поле открывает анимированную картинку с различными параметрами и схематичным изображением происходящего.
Как видите, из «недр» источника считывается довольно много информации: уровни заряда и нагрузки, напряжения на входе, выходе и батарее, частота и даже температура.
Пожалуй, единственное, что отсутствует, это оценка времени автономной работы на текущих уровнях нагрузки и остатка заряда, но подобные сведения обычно бывают очень и очень приблизительными, поэтому сильно сожалеть об этом нет смысла.
На схеме не учитывается срабатывание системы AVR, оно отображается лишь в виде текстового сообщения в нижней части окна. Переход на батарею приводит и к соответствующей смене «потоков энергии» на картинке, и даже если выключить ИБП кнопкой, оставив его подключенным к розетке, изображение тоже поменяется.
Теперь о том, насколько точно отображаются параметры. Естественно, значения определяются не программой, а поступают из ИБП.
Итак: нагрузка в изображенный на первом скриншоте момент не была подключена, а отображалось 10%, причем в разных режимах (AVR, переход на батарею) значение менялось от 8 до 16 процентов. Нагрузки до 100 Вт включительно никак не влияли на эти цифры, 125 Вт отобразились как 15%, хотя составляют 20% от 600 Вт. При нагрузке 200 Вт: в программе 20%, а реально это 33%; при 350 Вт: в программе 31%, реально 58-59%; при 450 Вт: в программе 42%, реально 75%. Таким образом, отображаемые цифры не очень-то пригодны даже в качестве оценочных.
Напряжение: при 220 В ±0,5% по внешнему вольтметру показания в программе менялись между 217,4 и 218 вольтами, что представляется вполне приемлемым для практического использования.
Переходим к возможным настройкам. Делать это следует лишь после входа в качестве администратора, иначе сохранить заданные параметры не получится, даже в заголовке окна программы написано «Только для чтения».
В меню программы перечень настроек довольно длинный, но не все одинаково полезны на практике.
В параметрах управления ИБП единственная строчка — отключение звуковых сигналов при работе от батарей. Они действительно отключаются, но лишь до тех пор, пока работает программа: если выключить компьютер, на котором она запущена, то сигналы возобновятся.
Дальше по порядку: можно переименовать источник («Установка модели ИБП»), но вряд ли это следует называть параметром управления. «Действия над событиями» подразумевают разного рода оповещения и необходимые для них установки:
Пожалуй, наиболее полезным будет пункт «Параметры завершения работы»:
Реагирование на сигналы из локальной сети рассматривать не будем, вряд ли такая функция актуальна для ИБП подобного класса.
Следующие пункты меню посвящены тестированию батареи, а также заданию расписания включения источника — наверно, это порой может быть полезно, но вряд ли регулярно и каждому владельцу Back Comfo Pro II.
Ведется журнал событий, который можно просматривать и чистить от лишнего, для содержимого предусмотрен экспорт в формате CSV.
Кроме того, можно воспользоваться веб-интерфейсом, для чего нужно в настройках WinPower запустить веб-сервер — собственно, это сделано по умолчанию. И тогда, обратившись через порт 8888 к IP-адресу компьютера, к которому подключен ИБП (но надо либо отключить брандмауэр, либо открыть этот порт), получим ту же информацию, что и в WinPower, хоть и в менее наглядном текстовом виде. Для управления источником потребуется ввести пароль администратора, но доступные настройки здесь и вовсе сводятся к запуску самотестирования.
Тестирование
Уточнения к спецификации
Сначала уточним несколько достаточно важных моментов.
Поддержка стандарта Smart Battery не заявлена (более того: в инструкции прямо говорится «используйте специализированное ПО») и не обнаружена нами при проверке: при подключении источника к USB-порту компьютера новое устройство «Батарея ИБП HID» не появляется. Но сожалеть об этом большинство владельцев вряд ли будет, поскольку возможности получаются весьма скудными.
Входной автоматический предохранитель имеет номинал 8 А, вполне соответствующий заявленной мощности (с запасом на возможные пусковые токи), а с некоторой натяжкой и сечению проводов входного кабеля (0,75 мм²).
Работа от батарей при малых нагрузках: много нареканий в некоторых моделях ИБП вызывает «режим экономии заряда» (или Green Mode), не позволяющий использовать их для работы с устройствами, потребляющими небольшую мощность (компьютер в режиме энергосбережения, сетевой роутер): источник считает, что если нагрузки нет (или почти нет), то лучше выключиться, чтобы сэкономить электроэнергию и/или заряд батареи.
В данном случае ничего подобного нет: мы попробовали автономную работу вообще без нагрузки, в течение получаса источник не отключился.
Холодный старт: проверили — работает, подать напряжение на подключенные нагрузки в отсутствие питания на входе ИБП вполне можно.
Совместимость с нагрузками, БП которых оснащен APFC: для проверки мы ограничиваемся подключением компьютера среднего класса, имеющего блок питания be quiet! Straight Power 10 с заявленной мощностью 500 Вт и с APFC. При работе в офисных приложениях он потребляет 150—230 В·А (вместе с монитором), никаких проблем не наблюдалось.
Проводить тесты с разными блоками питания и в диапазоне потребляемых мощностей нет смысла: все равно это будут лишь частные случаи, не дающие однозначного ответа на животрепещущий вопрос «А будет ли нормально работать именно с моим компьютером?».
Собственное потребление: при полностью заряженном (с вечера до утра) аккумуляторе выключенный кнопкой источник потребляет 12-12,5 В·А (или 9-9,5 Вт, PF = 0,73), при включении, но без нагрузок, получается чуть больше: 13 В·А / 10 Вт.
В начале процесса зарядки встроенной батареи, разряженной до автоотключения ИБП при нагрузке 200 Вт, его собственное потребление ожидаемо выше: 38 В·А (PF = 0,96, то есть также заметно больше), но довольно быстро снижается: через час до 23 В·А, через полтора часа до 17 В·А (PF = 0,82 — снизился), и примерно через 2,5 часа становится близким к приведенному в предыдущем абзаце значению для включенного ИБП.
Форма выходного напряжения
Выходное напряжение при работе от батареи — вполне обычная для подобных ИБП «модифицированная синусоида», ничего общего с синусоидой не имеющая, но вполне пригодная для работы c нагрузками, оснащенными импульсными блоками питания.
Вот ее внешний вид на холостом ходу и на нагрузке 400 В·А (PF = 0,7), цена деления по горизонтали здесь и далее 5 мс:
Без нагрузки Нагрузка 400 В·А (PF = 0,7)Температурный режим, шум
В любом режиме ИБП нагревается или слабо, или совсем слабо. Автономная работа со средними и большими нагрузками длится от десятков секунд до нескольких минут, за такое время не только внешние части корпуса, но даже радиатор транзисторов инвертора сколь-нибудь существенно нагреться просто не успевают. При малых нагрузках и токи небольшие, соответственно нагрев едва ощутимый даже за большое время.
Вклад трансформатора AVR тоже незначительный — по крайней мере, если судить по температуре расположенной непосредственно над ним части верхней крышки. При срабатывании той или иной ступени ситуация практически не меняется: за час работы повышающей ступени на нагрузку 450 Вт корпус в этом месте нагрелся всего на 3-4 градуса.
То есть отсутствие вентилятора можно считать вполне оправданным, тем более, что такое решение делает источник практически бесшумным. Трансформатор гудит, но очень тихо — услышать это можно, лишь прижавшись ухом к корпусу.
Единственным источником шума, кроме звуковых сигналов, являются щелчки реле — возможно, именно из-за них в спецификации указано «< 40 дБ», а не меньшее значение. Но, понятно, эти звуки слишком кратковременные и нерегулярные, чтобы всерьез воспринимать их как шум.
Автономная работа
Перейдем к тестированию автономной работы с разными нагрузками. Вот результаты в виде графика:
Более точные значения приведены в таблице.
| Нагрузка, Вт | Время работы от батарей, ч:мм:сс |
|---|---|
| 25 | 2:18:05 |
| 100 | 0:25:35 |
| 200 | 0:12:40 |
| 350 | 0:02:13 |
| 500 | 0:00:31 |
| 550 | 0:00:25 |
| 600 | 0:00:22 |
| 650 | 0:00:14 |
| 700 | 0:00:06 |
Две нижних строчки — работа с перегрузкой, причем в последнем случае довольно существенной, около 15%. ИБП при этом не только не отключился из-за перегрузки, но даже отработал от батареи заметное время. Понятно, что 6-14 секунд, скорее всего, не хватит даже на завершение работы ОС компьютера, но если предполагается регулярная работа с нагрузками, превышающими заявленный для данной модели предел, то следует выбирать ИБП помощнее.
Отклонение по частоте на выходах в автономном режиме не превышало ±1 Гц.
Полученные нами значения неплохо соответствуют сведениям, приведенным в спецификации. Что особенно приятно: на максимальных нагрузках время работы заметно больше обещанного.
Автоматическая регулировка выходного напряжения
ИБП серии оснащены двухступенчатой системой AVR, одна ступень (повышающая) срабатывает при уменьшении входного напряжения, а вторая (понижающая) при увеличении.
Имеющийся у нас автотрансформатор при текущем напряжении питающей сети выдавал выходное напряжение не более 240 В, поэтому поведение ИБП при более высоких напряжениях, в том числе вызывающих срабатывание понижающей ступени, не исследовалось.
Приводим результаты при работе на нагрузку 200 Вт (номинальное значение при 220 В).
| Входное напряжение (при понижении от 240 до 0 В) | Выходное напряжение | Режим работы |
|---|---|---|
| 240—201 В | 240—201 В | напрямую от сети |
| 200—164 В | 235—193 В | от сети с повышением (AVR) |
| 163 В и менее | 220—221 В | от батареи |
| Входное напряжение (при повышении от 0 до 255 В) | Выходное напряжение | Режим работы |
| менее 168 В | 220—221 В | от батареи |
| 169—206 В | 199—241 В | от сети с повышением (AVR) |
| 207—240 В | 206—240 В | напрямую от сети |
Для оценки ИБП мы ориентируемся на ГОСТ 32144-2013, который допускает отклонения в пределах ±10%, то есть для установленного номинального выходного напряжения 220 В «законным» будет диапазон от 198 до 242 вольт. В спецификации пределы точно такие же.
Из таблицы видно: «в минус» напряжение на выходе ИБП может уходить до 193 В, что на 12% меньше номинальных 220 В, то есть не совсем в рамках ГОСТа. Превышение: зафиксированный нами максимум составил 241 В, здесь разница по сравнению с номиналом чуть меньше 10% (но с учетом того, что мы не смогли проверить работу понижающей ступени).
Если не очень придираться, то соответствие и требованиям стандарта, и данным в спецификации достаточно полное.
Разница между значениями для перехода в какой-то режим и возвратом из него (или гистерезис) является необходимой — без нее при небольших колебаниях входного напряжения вокруг значения переключения источник постоянно переходил бы из режима в режим.
Переходные процессы
Спецификация гласит: «Время переключения — типовое 2-6 мс, макс. 10 мс». Но при этом не уточняется, о каком именно переключении идет речь, а вариантов много — с AVR на прямую трансляцию входной сети, с инвертора на трансляцию, обратные операции, да еще и переход с инвертора на повышающую ступень AVR, когда входное напряжение не пропало совсем, а сначала понизилось ниже 160 и потом поднялось до 180—190 В.
Поэтому придется считать, что любой переходной процесс должен длиться не более 10 мс. Рассмотрим некоторые варианты, сначала с нагрузкой 150 Вт. Напомним: одно деление по горизонтали — это 5 мс.
Входное напряжение понизилось, включается повышающая ступень AVR:
Дребезга контактов реле не видно, переключение происходит за 2-3 мс.
Теперь обратный переход — с повышающего AVR на прямую трансляцию:
Здесь переходной процесс длится немного дольше, около 4 миллисекунд, и есть небольшой участок, который можно отнести к дребезгу
Задействуем инвертор в ситуации перехода между батареей и повышающей ступенью AVR.
Переход на батарею при сильном снижении входного напряженияЗдесь переход занял максимум 2 мс.
Переход с батареи на трансляцию с повышениемТут сложно определить момент начала переключения, но в любом случае не больше 10 мс.
Теперь нагрузка с реактивной составляющей 400 В·А, PF = 0,7.
Переход на батарею при сильном снижении входного напряжения Включение повышающей ступени AVRНа обоих осциллограммах переключение занимает не более 2-3 мс.
Таким образом, во всех случаях переходные процессы укладываются в декларированный интервал, причем чаще даже в типовой, а не максимальный.
Итог
Источник бесперебойного питания Ippon Back Comfo Pro II 1050 по всем проверенным нами параметрам можно считать соответствующим заявленным значениям.
Не столь уж часто встречающееся расположение выходных розеток — не сзади, а на верхней плоскости — дало возможность существенно увеличить количество одновременно подключаемых нагрузок и сделало доступ к этим розеткам более удобным.
Отсутствие режима Green Mode позволит использовать источник для бесперебойного питания малых нагрузок — например, сетевого оборудования или систем наблюдения.
Индикация режимов на панели управления простейшая — единственный светодиод, об отображении каких-то параметров и речи нет. Но предлагаемая программа мониторинга и управления исправляет ситуацию: можно наблюдать практически все необходимые данные.
Наличие в линейке нескольких моделей позволит потенциальным покупателям выбрать ИБП в соответствии со своими потребностями (мощностью нагрузок), не переплачивая при этом.
Индикатор Земля и реверс в электрическом счётчике
Вопрос:
В электросчетчике горят индикаторы (реверс и земля) постоянно. Говорят так в трое больше электричества считает. Правда. Даже пакетники отключал, все равно горят.
Ответ
Не думаю, что считает больше, скорей всего либо его неправильно подключили (что вряд ли), либо Вы потребляете очень мало энергии, либо ветхая проводка.
Подробнее про индикаторы:
Индикатор земля обозначает то, что где-то идёт утечка тока на землю (например когда стиральная машина бьется током либо утечка происходит где-то в электросети как правило из-за ветхой проводки), либо тот же ноль в щитке прикручен к корпусу электрощитка
Индикатор реверс загорается в случае, если ток течет в обратном направлении.
Оба индикатора могут загораться в случае, если потребление тока либо очень маленькое, либо вообще отсутствует.
Если
Определить правильность работы счетчика можно следующим образом:
Отключить ВСЕ электроприборы из цепи
Записать показания счетчика
Включить один прибор мощность которого Вы знаете на заданное время Утюг, плита (новые модификации), некоторые обогреватели — не подходят т.к. имеют датчики температуры, которые отключают прибор от нагрузки при достижении заданного параметра.
Отключив прибор, рассчитать показания потребленной электроэнергии и сравнить их с показаниями счетчика.
Считаем в киловаттах.
Например, мощность прибора 600 ватт, т.е. если включить его на час, он «съест» 600 ватт (0,6киловатта)
включили его на 20 минут (одна треть часа)
получаем 0,6 х 1/3 часа = 0,2 киловатта
Если включили на пол часа, то 0,6 х 1/2 = 0,3 киловатта
Показания счетчика должны измениться на полученную при расчете цифру
ps Мне позвонил молодой человек и сообщил, что работал с этими счетчиками. Благодарю за участие и публикую его сообщение:
счетчик нік будет больше считать если нули двух квартир скручены вместе, так как он считает где больше нагрузка.
Лучший бесконтактный тестер напряжения
Наш выбор
Klein NCVT-3
Klein обнаруживает стандартное и низкое напряжение и оснащен удобным фонариком — приятный штрих для инструмента, который может вам понадобиться, когда свет погас. .
Варианты покупки
* На момент публикации цена составляла 24 доллара.
Изучив тему, поговорив с электриком и потратив часы на тестирование семи ведущих моделей, мы рекомендуем Klein NCVT-3. NCVT-3 имеет очень интуитивно понятный индикатор, красивую кнопку включения / выключения и встроенный светодиод, который работает как маленький фонарик.Это отличная функция, поскольку при проверке напряжения на проводах свет может работать не слишком хорошо. Он также совместим с защищенными от взлома розетками, что теперь требуется по кодексу. NCVT-3 имеет индикатор заряда батареи и прочный корпус, который защищает его чувствительную электронику от падения с высоты до 6,5 футов.
Прежде всего, NCVT-3 очень проста в использовании. Это двухдиапазонный блок, поэтому он может обнаруживать стандартное напряжение (розетки, обычная проводка), а также низкое напряжение (дверные звонки, термостаты, проводка для полива).Большинство тестеров обнаруживают только стандартное напряжение. В отличие от большинства других моделей с двумя диапазонами, он переключается между диапазонами автоматически, без использования суетливой ручки чувствительности. Светодиодная гистограмма сбоку от инструмента показывает, с каким напряжением вы имеете дело. При обнаружении низкого напряжения загораются два нижних оранжевых индикатора, а при стандартном напряжении загорается один или несколько из трех верхних красных индикаторов. Многие компании продают отдельные детекторы высокого и низкого напряжения, но для неспециалистов имеет смысл объединить их в один инструмент, особенно если он работает так же легко, как Klein.
В моем собственном подвале провода прикреплены скобами к потолку над люминесцентными лампами, поэтому даже при включенном свете сложно работать с проводами. Из двух моделей со встроенным фонариком NCVT-3 — единственная, которая может работать независимо от функции тестирования, что действительно приятно.
Светодиодный фонарик — изюминка НЦВТ-3. В моем собственном подвале провода прикреплены скобами к потолку над люминесцентными лампами , поэтому даже при включенном свете с проводами работать сложно.Из двух моделей со встроенным фонариком NCVT-3 — единственная, которая может работать независимо от функции тестирования, что действительно приятно. Когда тестер активирован, раздается серия звуковых сигналов и мигающих огней, и приятно иметь возможность обойти это, если вы просто пытаетесь использовать фонарик. Наш занявший второе место детектор напряжения Milwaukee 2203-20 со светодиодной подсветкой также имеет функцию фонарика, но он включается только тогда, когда тестер активирован, поэтому, несмотря ни на что, вы должны слушать звуковые сигналы, и нет возможности выключите фонарик, даже если вы работаете в хорошо освещенном помещении.Светодиод NCVT-3 также ярче, чем Milwaukee.
Фонарик на Klein NCVT-3 (справа) намного ярче, чем на Milwaukee 2203-20 (слева). Его также можно включать и выключать независимо от детектора напряжения.NCVT-3 на ощупь очень прочный. По словам производителя, он может выдержать падение с высоты 6,5 футов, поэтому, если вы заболеете водянкой, эта модель даст вам шанс выжить. Кроме того, все кнопки герметичны, а крышка батарейного отсека уплотнена, поэтому NCVT-3 может выдержать небольшой дождь и сырость.У Кляйна есть видео, на котором инструмент выглядит так, как будто он находится под непрерывно капающим краном.
Когда мы спросили электрика Марка Тирни, есть ли производители, которые он порекомендовал бы домовладельцу, он сказал нам, что «самый надежный — это Klein». Ему также нравятся модели, которые поставляются со светодиодами, и говорит, что для домовладельца «они получат две замечательные функции в одном инструменте».
Что касается времени автономной работы, Кляйн говорит, что две батареи AAA обеспечат 15 часов непрерывного использования тестера и шесть часов непрерывного использования фонарика.Этого достаточно для случайного пользователя, и, как мы уже говорили, приятно, что есть индикатор заряда батареи, чтобы вы знали, когда он становится низким.
И мы не единственные, кому нравится NCVT-3. Клинт ДеБоер, пишущий в ProToolReviews, говорит, что этот инструмент «настолько прост, насколько это возможно, если вы хотя бы время от времени выполняете электромонтажные работы». Он завершает свой обзор словами: «Это хорошо разработанный инструмент, который делает то, что должен, и делает это хорошо. Возьми одну. Вы не пожалеете.”
NCVT-3 также получает в целом положительные отзывы владельцев на Amazon и Home Depot. Большинство негативных отзывов на Amazon исходят от людей, которым нравится этот инструмент, но которые разочарованы тем, что его нельзя вставить в розетку. Как мы описали выше, это не проблема, потому что он все еще может обнаруживать ток, отображая его только как низкое напряжение (и делая его совместимым с требующими кода розетками с защитой от несанкционированного доступа). Чтобы действительно подтвердить стандартное напряжение на розетке, достаточно просто отвинтить крышку и поместить наконечник инструмента сбоку от розетки, где находятся провода.
% PDF-1.4 % 1880 0 объект > эндобдж xref 1880 81 0000000016 00000 н. 0000001975 00000 н. 0000002176 00000 н. 0000003444 00000 н. 0000003713 00000 н. 0000003800 00000 н. 0000003980 00000 н. 0000004089 00000 н. 0000004225 00000 н. 0000004287 00000 н. 0000004404 00000 п. 0000004466 00000 н. 0000004579 00000 п. 0000004641 00000 п. 0000004751 00000 н. 0000004813 00000 н. 0000004933 00000 н. 0000004994 00000 н. 0000005176 00000 н. 0000005237 00000 п. 0000005342 00000 п. 0000005434 00000 н. 0000005608 00000 н. 0000005669 00000 н. 0000005774 00000 н. 0000005866 00000 н. 0000006038 00000 н. 0000006099 00000 н. 0000006204 00000 н. 0000006296 00000 н. 0000006357 00000 н. 0000006418 00000 н. 0000006531 00000 н. 0000006592 00000 н. 0000006653 00000 н. 0000006714 00000 н. 0000006827 00000 н. 0000006888 00000 н. 0000006949 00000 п. 0000007010 00000 п. 0000007123 00000 н. 0000007184 00000 н. 0000007245 00000 н. 0000007308 00000 н. 0000007399 00000 н. 0000007508 00000 н. 0000007569 00000 н. 0000007632 00000 н. 0000007773 00000 н. 0000007988 00000 н. 0000008516 00000 н. 0000009304 00000 н. 0000009929 00000 н. 0000010631 00000 п. 0000010655 00000 п. 0000013941 00000 п. 0000013965 00000 п. 0000016976 00000 п. 0000017000 00000 н. 0000019995 00000 п. 0000020019 00000 н. 0000022655 00000 п. 0000022679 00000 п. 0000025140 00000 п. 0000025164 00000 п. 0000025488 00000 п. 0000026028 00000 п. 0000028271 00000 п. 0000028295 00000 п. 0000030908 00000 п. 0000030932 00000 п. 0000031073 00000 п. 0000031213 00000 п. 0000036344 00000 п. 0000041056 00000 п. 0000042877 00000 п. 0000045933 00000 п. 0000072321 00000 п. 0000099188 00000 п. 0000002219 00000 н. 0000003420 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 1881 0 объект > эндобдж 1882 0 объект > эндобдж 1959 0 объект > поток HTmLewoN, 5} 3wЪUqcɵ ب? MӤiaRS && F4_N
% PDF-1.6 % 1 0 obj > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > поток application / postscript2010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 00Adobe Illustrator CS4
Яркий и быстрый красный флуоресцентный индикатор напряжения белка, который сообщает об активности нейронов в органотипических срезах мозга
Молекулярная биология для создания вариантов FlicR.
ПЦР-амплификацию использовали для конструирования ДНК-матрицы для FlicR. Синтетические олигонуклеотиды (Integrated DNA Technologies) использовали в качестве праймеров для амплификации, а полимеразу Pfu (Thermo Fisher Scientific) использовали для поддержания репликации ДНК с высокой точностью. ПЦР с перекрытием использовали для связывания CiVSD с cpmApple FP. Произвольный мутагенез выполняли с помощью подверженной ошибкам ПЦР-амплификации с использованием полимеразы Taq (New England Biolabs) в присутствии MnCl 2 (0,1 мм) и 800 мкМ избытка dTTP и dCTP.Рандомизацию целевых кодонов проводили с помощью наборов QuikChange Lightning (Agilent Technologies). Эндонуклеазы рестрикции (Thermo Fisher Scientific) использовали для переваривания продуктов ПЦР и векторов экспрессии. Электрофорез в агарозном геле использовали для очистки продуктов ДНК от ПЦР и реакций рестрикционного переваривания. ДНК экстрагировали из гелей с использованием набора для экстракции гелей GeneJET (Thermo Fisher Scientific). Лигирование выполняли с использованием ДНК-лигазы Т4 (Thermo Fisher Scientific).
ДНК, кодирующая первые 242 а.о. из CiVSD (VSD242), была получена с помощью ПЦР-амплификации домена CiVSD от датчика напряжения VSFP3.1 (Lundby et al., 2008) с использованием прямого праймера (FW-BamHI-VSD) и обратного праймера (RV-cpmApple-VSD242). ДНК, кодирующая вариант cpmApple, была получена с помощью ПЦР-амплификации гена, кодирующего R-GECO1, с использованием прямого праймера (FW-VSD242-cpmApple) и обратного праймера (RV-XbaI-cpmApple). Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple содержат перекрывающуюся область, которую использовали для соединения этих двух генов с помощью перекрывающейся ПЦР. Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple также содержали два полностью рандомизированных кодона (кодоны NNK), которые связывают два гена вместе, создавая 1024 варианта.Длина VSD, амплифицированного с помощью ПЦР, варьировалась (VSD 236, VSD237, VSD238, VSD239, VSD240 и VSD241). Другие наборы перекрывающихся праймеров, наряду с праймером FW-BamHI-VSD и праймером RV-XbaI-cpmApple, использовали для связывания ДНК, кодирующей cpmApple, с более короткими VSD, как описано выше для VSD242. Это привело к библиотеке из 1024 вариантов FlicR для каждой длины VSD.
ПЦР с предрасположенностью к ошибкам вместе с перетасовкой ДНК были использованы для создания библиотек в следующих раундах направленной эволюции вариантов FlicR из библиотеки VSD239.Продукты ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле, расщепляли и лигировали в модифицированный вектор pcDNA3.1 (+), как описано ниже.
Плазмида для двойной экспрессии
E. coli и клеток млекопитающих.Вектор для экспрессии в прокариотических и эукариотических системах был сконструирован на основе вектора экспрессии млекопитающих pcDNA3.1 (+). Для облегчения прокариотической экспрессии с помощью реакции QuikChange (Agilent Technologies) вводили сайт связывания рибосомы E. coli (agaggaa) для прокариотической трансляции.Получившийся вектор мы назвали pcDuEx0.5. Транскрипция кодируемых генов зависит от слабой активности промотора цитомегаловируса (CMV) в клетках E. coli (Lewin et al., 2005). pcDuEx0.5 продемонстрировал умеренную экспрессию вариантов FlicR в клетках E. coli и показал сопоставимые уровни экспрессии в клетках HeLa по сравнению с исходной pcDNA3.1 (+). Мы использовали pcDuEx0.5 в качестве вектора для скрининга библиотек FlicR. Другие векторы двойной экспрессии были разработаны ранее (Mullinax et al., 2002).
Плазмида для экспрессии нейронов.
Для экспрессии FlicR1 в нейронах FlicR1 клонировали из плазмиды pcDuEx0.5 в сайты BamHI / HindIII вектора AAV2 с использованием праймеров FW-BamHI-VSD и RV-HindIII-cpmApple. Экспрессию FlicR1 контролировали с помощью промотора синапсина I человека, который предпочтительно экспрессировался в нейронах. Последовательность 3′-посттранскрипционного регулирующего элемента вируса гепатита сурка (WPRE) использовали для усиления экспрессии. Для экспрессии канального родопсина слияние TsChR-TS-eGFP клонировали в ту же плазмиду, где TS представляет собой KiR2.Последовательность 1-трафика, используемая для улучшения мембранного транспорта канальных родопсинов. Аминокислотная последовательность последовательности TS — KSRITSEGEYIPLDQIDINV. ChR2 (h234R) -eGFP экспрессировался из лентивирусной конструкции под промотором CaMKII, описанным ранее (Hochbaum et al., 2014).
Скрининг вариантов библиотеки FlicR в
E. coli .Генные библиотеки вариантов FlicR трансформировали в электрокомпетентный штамм E. coli Dh20B (Invitrogen). Затем клетки E. coli высевали и культивировали при 37 ° C на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл), чтобы получить 500–1000 колоний на чашку.Затем были получены изображения колоний с использованием настраиваемой настройки изображения, описанной ранее (Cheng and Campbell, 2006). Для проверки яркости мутанта FlicR изображения планшетов получали с использованием фильтра возбуждения 560/40 нм и фильтра испускания 630/60 нм. Для каждого раунда случайного мутагенеза отбирали ~ 10 000 колоний (10-20 чашек). Для каждой библиотеки, созданной рандомизацией кодонов, было проверено примерно в три раза больше колоний, чем ожидаемый размер библиотеки рандомизации. Колонии с максимальной яркостью флуоресценции 0,01% отбирали вручную и культивировали в 4 мл среды LB с добавлением ампициллина (100 мкг / мл).Затем плазмиды экстрагировали с использованием набора для плазмид GeneJET miniprep (Thermo Fisher Scientific).
Экспрессия и
in vitro спектроскопическая характеристика FlicR1.Для очистки FlicR1 плазмиду pcDuEx0.5, несущую FlicR1, использовали для трансформации электрокомпетентных клеток E. coli Dh20B (Invitrogen). E. coli выращивали на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл). Колонию использовали для инокуляции 8 мл жидкой среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение ночи при 37 ° C.На следующий день 8 мл бактериальной культуры добавляли к 500 мл среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение 4 часов при 37 ° C, а затем выращивали в течение 48 часов при 25 ° C. Затем осадок клеток собирали центрифугированием и лизировали суспензией в растворе B-PER (Pierce). Нерастворимую фракцию (содержащую мембранные белки) собирали после центрифугирования и ресуспендировали в растворе 2% n -додецил-β-d-мальтопиранозида (Anatrace) в трис-буферном физиологическом растворе. Затем суспензию гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора и центрифугировали при 4 ° C.Солюбилизированный белок FlicR1 в супернатанте использовали для измерения спектра флуоресценции на планшет-ридере Safire2 (Tecan) и спектра поглощения на УФ-видимом спектрофотометре DU-800 (Beckman).
Культура клеток.
Клетки HeLa (CCL-2; ATCC) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (Sigma-Aldrich), 2 мм GlutaMax (Invitrogen) и пенициллин-стрептомицин, и клетки инкубировали в течение 48 часов при 37 ° C и 5% CO 2 . Клетки разделяли и культивировали на покрытых коллагеном чашках со стеклянным дном 35 мм (Matsunami) до ~ 50% конфлюэнтности.Трансфекцию проводили путем инкубации клеток HeLa со смесью 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкл Turbofect (Thermo Fisher Scientific) в течение 2 часов в соответствии с инструкциями производителя. Визуализацию проводили через 24–48 ч после трансфекции.
Клетки 293T (HEK293T) почки человека (CRL-11268; ATCC) культивировали и трансфицировали в соответствии со стандартными протоколами (Kralj et al., 2012). Вкратце, клетки HEK293T выращивали при 37 ° C и 5% CO 2 в среде DMEM с добавлением 10% FBS и пенициллин-стрептомицина.Клетки трансфицировали 400 нг ДНК с использованием Transit 293T (Mirus), следуя инструкциям производителя. Через 24 ч клетки пересаживали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1.5-N; In Vitro Scientific), покрытые матригелем (BD Biosciences) при ~ 10 000 клеток / см 2 . Измерения проводили через 48 ч после трансфекции.
Нейроны гиппокампа крысы.
Глиальные монослои крыс получали аналогично Маккарти и де Веллису (1980). Вкратце, диссоциированные клетки гиппокампа от постнатальных детенышей крыс на 0 день (P0) любого пола (Sprague Dawley; Tocris Bioscience) (Banker and Goslin, 1998) высевали на 10-сантиметровую культуральную чашку в глиальной среде (GM), состоящей из 15% FBS. (Технологии жизни), 0.4% (мас. / Об.) D-глюкозы, 1% глутамакса (Life Technologies) и 1% пенициллина-стрептомицина (Life Technologies) в MEM (Life Technologies). После достижения слияния клетки пересаживали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1,5-N; In Vitro Scientific), покрытые матригелем (BD Biosciences) при плотности 3500 клеток / см 2 . Когда глиальные монослои снова достигли слияния, среду заменили GM на 2 мкм цитарабина (цитозин-β-арабинофуранозид; Sigma-Aldrich). Чашки выдерживали в GM с 2 мкМ цитарабина до использования.
Гиппокампы, выделенные из крысят P0, диссоциировали с использованием папаина и помещали в среду для посева (РМ) при 8000 клеток / см. 2 на предварительно установленные глиальные монослои (Banker and Goslin, 1998). Через 1 день in vitro (DIV) PM заменяли на цитарабин 2 мкм в нейробазальной среде (NBActiv4; Brainbits). Затем нейроны кормили каждые 5 дней, заменяя 1 мл культуральной среды на NBActiv4 без цитарабина. Нейроны были трансфицированы на DIV 9 через фосфат кальция, как описано ранее (Jiang and Chen, 2006).Измерения на нейронах проводились на DIV 14. Для полностью оптических электрофизиологических экспериментов на нейронах клетки котрансфицировали фосфатом кальция с каналом родопсином и ДНК FlicR1 на DIV 9 и измеряли на DIV 12–13.
Для измерения спонтанной активности диссоциированные клетки гиппокампа E18 Sprague Dawley в полной среде гибернации EB были приобретены у BrainBits. Клетки выращивали на чашке со стеклянным дном диаметром 35 мм (In Vitro Scientific), покрытой поли-d-лизином (A-003-E; Millipore), содержащим 2 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G. (25 единиц / мл) и сульфат стрептомицина (25 мкг / мл).Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня. Нейрональные клетки трансфицировали на 8-й день, используя Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя инструкциям производителя. Вкратце, 1-2 мкг плазмидной ДНК и 4 мкл Lipofectamine 2000 (Life Technologies) добавляли к 100 мкл среды NbActive4 для получения среды для трансфекции. Затем эту среду инкубировали при комнатной температуре в течение 10–15 мин. Половину культуральной среды (1 мл) из каждой чашки нейронов извлекали и объединяли с равным объемом свежей среды NbActiv4 (с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G и сульфата стрептомицина) для получения смеси 1: 1. и инкубировали при 37 ° C и 5% CO 2 .Затем в каждую нейронную чашку добавляли 1 мл свежей кондиционированной (при 37 ° C и 5% CO 2 ) среды NbActiv4. Затем добавляли среду для трансфекции и нейронные чашки инкубировали в течение 2–3 ч при 37 ° C в инкубаторе CO 2 . Затем среду заменяли кондиционированной средой 1: 1, приготовленной ранее. Перед визуализацией клетки инкубировали в течение 48–72 ч при 37 ° C в инкубаторе CO 2 .
Экранирование индуцированного трансмембранного напряжения.
Для скрининга индуцированного трансмембранного напряжения (ITV) варианты FlicR были коэкспрессированы в клетках HeLa вместе с внутренним выпрямительным калиевым каналом, Kir2.1 (Addgene # 32641) и ArcLight Q239 (Addgene # 36856) в качестве внутренней ссылки. Экспрессия Kir2.1 в клетках HeLa помогает поддерживать потенциал покоя ~ -60 мВ, что подходит для скрининга индикаторов напряжения нейронов. К культуре клеток прикладывали однородное электрическое поле ~ 50 В / см для создания ITV. Генератор импульсов (PG 58A; Gould Advanced) использовался для подачи прямоугольного импульса длительностью 10 мс с частотой ~ 0,5 Гц. Усилитель (6824A 40V / 25A; Agilent Technologies) использовался для получения амплитуды импульса 25 В.Пара параллельных платиновых электродов (0,5 см друг от друга) использовалась для доставки импульсов в культуру клеток. Флуоресценцию регистрировали одновременно с несколькими импульсами электрического поля для ITV с частотой кадров 100 Гц в течение 10 с.
Визуализация ITV в клетках HeLa.
Визуализацию проводили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с буфером HEPES (25 мм) (HBSS). Инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оснащенный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×, использовали для изображения клеток HeLa.Изображения были получены при 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Набор фильтров FITC / Cy2 (470/40 нм (возбуждение), 525/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 495LP (номер набора 49002; Chroma) использовался для изображения ArcLight Q239. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545 / 30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (номер набора 49005; Chroma) использовали для изображения FlicR1. Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой.Необработанные следы флуоресценции как FlicR, так и ArcLight были извлечены из идентичных интересующих областей в клетках, экспрессирующих обе конструкции, и экспортированы в настраиваемую электронную таблицу Microsoft Excel. Вычитание фона, коррекция фотообесцвечивания, вычисление среднего значения Δ F / F мин и расчет отношения сигнал / шум (SNR) выполнялись автоматически в Excel. Среднее значение Δ F / F мин и SNR сигналов FlicR сравнивали с таковыми для сигналов ArcLight от тех же ячеек, и сообщалось о соотношении Δ F / F мин FlicR по сравнению с ArcLight. .Для каждого варианта анализировали не менее 10 клеток, коэкспрессирующих FlicR и ArcLight. Был определен и секвенирован лучший вариант с максимальным средним соотношением в каждой библиотеке.
Визуализация спонтанной активности в первичной культуре нейронов.
Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Получение изображений в широком поле выполнялось на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E, оснащенном металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen), масляными объективами 60x (числовая апертура, NA = 1,4; Nikon) и 16-битным QuantEM 512SC. ПЗС-камера с электронным умножением (Photometrics).Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения FlicR1. Частота изображения 100 Гц с биннингом 4 × 4. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы на фоновую автофлуоресценцию и фотообесцвечивание. Как видно на рисунке 5 A , FlicR1 показывает некоторые внутриклеточные точки. Все больше свидетельств указывают на то, что эти структуры являются лизосомами, в которых накапливается белок быстрее, чем разлагается (Катаяма и др., 2008).
Одновременная электрофизиология и флуоресценция в клетках HEK и первичной культуре нейронов.
Все измерения изображений и электрофизиологии были выполнены в буфере Тирода, содержащем следующие (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 15 HEPES и 30 глюкозы, pH 7,3. Для измерения клеток НЕК добавляли 2-аминоэтоксидифенилборат (100 мкм; Sigma-Aldrich) для блокирования эндогенных щелевых соединений. Измерения при 34 ° C выполняли перфузией в буфере Тирода со скоростью 1 мл / мин при поддержании повышенной температуры с помощью встроенного нагревателя (Warner Instruments) и нагревателя объектива (Bioptechs).
Стеклянные микропипетки с нитями (WPI) вытягивали до сопротивления кончика 4–8 МОм и заполняли внутренним раствором, содержащим (в мм): глюконат калия 125, 8 NaCl, 0,6 MgCl 2 , 0,1 CaCl 2 , 1 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP и 0,4 Na-GTP, pH 7,3, доведенный до 295 мОсм сахарозой. Пипетки размещали с помощью манипулятора Sutter Instruments MP285. Записи целых клеток, напряжения и токовые клещи были получены с использованием усилителя Axopatch 700B (Molecular Devices), отфильтрованы на 2 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифрованы с помощью платы сбора данных PCIE-6323 National Instruments на 10 кГц.Данные были получены только от ячеек с сопротивлением доступа <25 МОм. Чтобы определить минимальный ввод тока, необходимый для генерации потенциала действия перед визуализацией, вводили прямоугольные волны возрастающей амплитуды с шагом 50–100 пА во время регистрации напряжения. Минимальное значение тока, которое привело к устойчивой генерации AP, использовалось для генерации потенциалов действия для экспериментов по визуализации.
Освещение осуществлялось твердотельным лазером с диодной накачкой 561 нм и 100 мВт (Cobolt Jive 100 561 нм) для визуализации FlicR1 и лазером 488 нм 50 мВт (Omicron PhoxX) для визуализации ArcLight.Луч расширяли и фокусировали на заднюю фокальную плоскость масляно-иммерсионного объектива 60x (Olympus APON 60XOTIRF 1.49 NA). Интенсивность изображения на образце составляла 10 Вт / см 2 . Для полностью оптических электрофизиологических измерений в нейронах луч 488 нм был расширен и модулирован цифровым микрозеркальным устройством (Texas Instruments DLP LightCrafter Evaluation Module), управляемым с помощью встроенного программного обеспечения. Флуоресценцию FlicR1 отделяли от возбуждающего света и фильтровали с использованием дихроичного и эмиссионного фильтров из набора фильтров Cy3-4040C-OMF-ZERO (Semrock).Флуоресценцию ArcLight отделяли дихроиком с длинным проходом (каталог Semrock № FF495-Di03) и фильтровали с помощью полосового фильтра 531/40 нм (каталог Semrock № FF01-531 / 40-25). Образец был отображен на камеру EMCCD (Andor iXon + DU-860) с разрешением 128 × 128 пикселей. Для измерения скорости FlicR1 фильмы были получены с частотой кадров 2 кГц с биннингом 2 × 2. Измерения чувствительности проводились при 10 Гц без объединения. Следы фотообесцвечивания получали при 2 Гц без биннинга. Нейрональные данные были получены при 1 кГц с бинингом 2 × 2 или при 500 Гц с бинингом 1 × 1.
Часть скрининга условий полностью оптической электрофизиологии проводилась на другом специально изготовленном микроскопе, оснащенном камерой с более высоким разрешением. Освещение осуществлялось с помощью 561 нм 100 мВт Cobolt Jive (номер по каталогу 0561-04-01-0100-500), 488 нм 100 мВт Coherent Obis (номер по каталогу 1226419) или 405 нм 30 мВт Dragon Laser (номер по каталогу 11042443). Лазерные линии объединяли с дихроичными зеркалами, а интенсивность модулировали с помощью акустооптических перестраиваемых фильтров (Gooch & Housego, каталог № TF525-250-6-3-Gh28A или № 48058-2.5-.55-5W). Линия лазера 488 нм была расширена для освещения микросхемы цифрового микрозеркального устройства (Texas Instruments DLP LightCrafter с набором микросхем DLP 0.3 WVGA), которое впоследствии было повторно отображено на плоскости образца. Линии 561 и 488 нм были сфокусированы в задней фокальной плоскости объектива APON 60XOTIRF 1.49 NA (Olympus). Коллимированный лазерный свет 405 нм в задней фокальной плоскости объектива был расфокусирован для получения пятна 5 мкм на образце и направлялся в плоскости образца с помощью гальвонометрических зеркал (каталог Thorlabs # GVS202), расположенных в сопряженной плоскости.Флуоресцентный свет отделяли от освещающего света с помощью четырехзонного дихроичного зеркала (каталог Semrock № Di01-R405 / 488/561/635). Свет флуоресценции пропускали через лезвие, разделенное на два канала, с использованием дихроичного зеркала, которые рекомбинировали и повторно отображали на двух половинах чипа научной КМОП-камеры (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0). Расщепление и рекомбинация были выполнены с использованием дихроичных зеркал (Semrock FF662-FDi01). Зеленую и оранжевую флуоресценцию фильтровали с использованием полосового фильтра HQ550 / 50m (Chroma) для возбуждения 488 нм или полосового фильтра ET595 / 50m (Chroma) для освещения 561 нм.Свет с длиной волны 458 нм обеспечивался светодиодом (LED Supply 07040-PR000-B), расположенным над образцом, отфильтрованным фильтром возбуждения D480 / 60x (Chroma) и управляемым четырехканальным светодиодным драйвером (Thorlabs DC4104). Электрофизиологические записи на этом микроскопе выполнялись, как указано выше, но с использованием усилителя Axopatch 200B и головного блока CV203BU (Molecular Devices). Сигналы фильтровались на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифровывались на частоте 10 кГц с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6259.
Измерения кинетики ArcLightQ239 были выполнены с использованием света 488 нм от лазера Coherent Obis 488-50, сфокусированного на заднюю фокальную плоскость водно-иммерсионного объектива 60x (Olympus UIS2 UPlanSApo × 60 / 1,20 Вт, NA 1,20) до плотность энергии 2–4 Вт / см 2 на образце. Флуоресцентный свет отделяли от возбуждающего света с помощью дихроичного Semrock Di01-R405 / 488/594, пропускали через полосовой эмиссионный фильтр 525/30 и отображали на CMOS-камеру для научных исследований (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0). Регистрацию напряжения всей ячейки выполняли с помощью усилителя с фиксатором (A-M Systems Model 2400), фильтровали на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра и оцифровывали с помощью платы сбора данных PCIE-6323 National Instruments на частоте 10 кГц.
Двухфотонная чувствительность FlicR к напряжению была протестирована на самодельном двухфотонном микроскопе со сканирующим лучом и перестраиваемым импульсным лазером 80 МГц, 100 фс (SpectraPhysics Insight DeepSee). Измерения проводились при длине волны возбуждения 1120 нм со средней по времени мощностью возбуждения 60 мВт или 0.8 нДж на импульс в режиме визуализации и ∼6 мВт или 80 пДж на импульс в режиме точечной записи. Импульсы фокусировались в пятно размером ~ 500 нм с помощью водно-иммерсионного объектива 1,2 NA (Olympus UplanSapo). Измерения изображений проводились с линейной скоростью сканирования ∼8 см / с -1 . Свет возбуждения и флуоресценция разделяли с использованием дихроичного зеркала FF775-Di01 и короткопроходного фильтра FF01-790 / SP-25 (оба — Semrock). Флуоресценцию регистрировали с помощью фотоумножителя Hamamatsu R943-02 в режиме счета фотонов, охлажденном до -20 ° C.Сигнал ФЭУ усиливался усилителем SRS PR325 и дискретизировался с помощью счетчика фотонов Hamamatsu C9744. Данные были получены с использованием карты DAQ NI pci-6259. Настройка контролировалась программным обеспечением Labview, написанным собственными силами.
HeLa cell для всей оптической электрофизиологии.
Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оборудованный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×.Изображения были получены при 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Клетки, экспрессирующие только R-GECO1, R-GECO1 и ChIEF-цитрин, только FlicR1 или FlicR1 и ChIEF-цитрин, подвергались полнопольному освещению импульсами синего света (лазер 405 нм, 20 мс, 5 Гц и 10 Гц, 5 мВт / мм 2 ) для стимуляции ЧИЭФ. Клетки одновременно освещали желтым светом для возбуждения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (эмиссия) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1.Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой. Изменения флуоресценции рассчитывали путем усреднения по всей клетке. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы с учетом фоновой автофлуоресценции и фотообесцвечивания.
Были исследованы различные опсины с целью минимизировать оптические перекрестные помехи с FlicR1. Интенсивность желтого света, используемая для изображения FlicR1 в клетках HeLa при скорости сбора данных 100 Гц (60 мВт / см, 2 ), намного ниже, чем интенсивность, необходимая для изображения переходных процессов AP в нейронах (10 Вт / см 2 ).Как упоминалось выше, мы использовали ChIEF в наших экспериментах по проверке концепции, потому что 60 мВт / см 2 желтого света недостаточно, чтобы вызвать активацию ChIEF. Однако нам пришлось переключиться на большее количество опсинов с синим смещением (ЦЧР и ПсЧР), чтобы попытаться избежать оптических перекрестных помех с относительно более высокой интенсивностью освещения, необходимой для изображения FlicR1 в нейронах на частоте 1 кГц (см. Рис. 8).
Приготовление органотипических срезов головного мозга гиппокампа крысы.
Горизонтальные срезы мозга (толщиной 250 мкм) крысы P0 Sprague-Dawley любого пола получали в ледяном HBSS, содержащем 1.3 мм CaCl 2 и 1 мм MgSO 4 с помощью вибрирующего микротома (Leica VT1000S), как описано ранее (Panaitescu et al., 2013). Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Университета Альберты для медицинских наук. Области гиппокампа вырезали из горизонтальных срезов головного мозга и помещали на стерильную вставку для культивирования клеток с мембраной с порами 0,4 мкм (Millipore PICMORG50). Затем вставку и срез помещали в чашку Петри, содержащую 1.5 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 5% FBS, калиевой соли пенициллина-G (50 единиц / мл) и сульфата стрептомицина (50 мкг / мл). Срезы культивировали при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 3-5 дней перед трансфекцией.
Ex vivo электропорация органотипических срезов головного мозга.
Вставку Millipore и культивированный на ней срез помещали между электродом из платиновой чашки Петри (CUY700-P2E; Nepa Gene) и квадратным платиновым электродом (CUY700-P2L; Nepa Gene).Зазор между чашечным электродом и мембраной заполняли буфером для электропорации (HBSS с 1,5 мМ MgCl 2 и 10 мМ глюкозы). Плазмиду pAAV2-hSyn-FlicR1 растворяли в буфере для электропорации при концентрации 1 мкг / мкл и добавляли достаточный объем, чтобы заполнить зазор между срезом и верхним электродом. Пять импульсов 20 В (5 мс каждый, 1 Гц) подавали с помощью функционального генератора (PG 58A; Gould) и усилителя (6824A; Agilent Technologies). Затем направление электрического поля было изменено на противоположное, и был применен второй набор из пяти импульсов с такими же настройками.После трансфекции срезы возвращали в инкубатор при 37 ° C с 5% CO 2 . Обычно требуется 2–3 дня для полной экспрессии FlicR1 в культивируемых срезах мозга с использованием этого метода трансфекции.
Визуализация органотипических срезов гиппокампа крыс.
Для получения изображения органотипических срезов головного мозга использовали вертикальный конфокальный микроскоп FV1000 (Olympus), оснащенный программным обеспечением FluoView1000 (Olympus) и водно-иммерсионным объективом 20 × XLUMPlanF1 (NA 1.00; Olympus). Освещение осуществлялось ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт (Olympus).
Срез мозга на вставке Millipore был помещен в специальную камеру, чтобы удерживать его на месте во время визуализации. Непосредственно перед визуализацией срезы перфузировали суперфузатом искусственного спинномозговой жидкости (ACSF), содержащим следующее (в мм): 120 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2 , 2 MgSO 4 , 26 NaHCO 3 , 1,25 NaH 2 PO 4 и 10 d-глюкоза, pH доведен до 7,4 путем подачи газа 95% O 2 , 5% CO 2 при 5 мл / мин с использованием перистальтического насоса (Watson-Marlow Alitea) и температура буфера поддерживалась на уровне 34 ° C.Визуализация была начата в течение 10 минут после активации перфузионной системы.
Чтобы получить изображение FlicR1, срез гиппокампа возбуждали ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт с использованием фильтрующего куба с фильтром возбуждения 565/30 нм, эмиссионным фильтром 620/50 нм и дихроичным светом 585 нм (Semrock). Изображения получали с частотой 100 Гц при биннинге 2 × 2 (см. Рис. 6 B , спонтанная активность) и 50 Гц (см. Рис. 6 E , стимулированная активность) с помощью цифровой камеры sCMOS (Hamamatsu Orca-Flash3.8). ; Hamamatsu Photonics).Для стимуляции теофиллином, примерно через 30 с после начала эксперимента, суперфузат был изменен с контрольного ACSF на ACSF, содержащий 10 мМ теофиллина (Sigma-Aldrich, непосредственно растворенный в ACSF). Приблизительно через 10 минут суперфузат был снова заменен на контрольный ACSF. Были получены изображения четырех органотипических срезов мозга, трансфицированных FlicR1, и они показали аналогичные ответы. На рис. 6 показаны репрезентативные следы флуоресценции нейронов в органотипических срезах.
Анализ данных.
Для измерения скорости и чувствительности в клетках HEK следы флуоресценции были извлечены с использованием алгоритма взвешивания пикселей максимального правдоподобия, описанного ранее (Kralj et al., 2012). Вкратце, флуоресценция каждого пикселя коррелировала со средней флуоресценцией всего поля. Пиксели с более сильной корреляцией со средним значением предпочтительно взвешивались при измерении флуоресценции, выделяя пиксели, содержащие больше всего информации. 5% пикселей с наивысшей корреляцией со средним значением были использованы для характеристики скорости и чувствительности белка. Флуоресцентные ответы на ступенчатые функции были усреднены по 100 испытаниям и сопоставлены с двойной экспоненциальной функцией для получения постоянных времени флуоресцентного ответа FlicR1.Чувствительность определялась как максимальное процентное изменение флуоресценции при изменении напряжения на 150 мВ.
Следы фотообесцвечивания были получены путем вычитания средней флуоресценции области заданной пользователем области фона из средней флуоресценции заданной пользователем области клетки. Затем полученные следы были подогнаны к одной экспоненте со смещением базовой линии, чтобы получить постоянную времени фотообесцвечивания. FlicR1 показал кратковременную фотоактивацию в первые 100 с, которую не принимали во внимание при расчетах фотообесцвечивания.
Для измерения нейронов тело клетки и дендриты были выбраны вручную, и средняя интенсивность всех включенных пикселей была усреднена. Интенсивность фона заданной пользователем области фона была вычтена из необработанного сигнала. Базовая линия фотообесцвечивания была построена из интенсивности всего поля с помощью скользящего минимального фильтра, за которым следовал скользящий средний фильтр. Затем каждый кадр фильма корректировался путем деления на эту базовую линию. SNR рассчитывали как максимальный отклик флуоресценции на потенциал действия (как определено записью патч-кламп), деленный на стандартное отклонение базовой флуоресценции.
Данные были проанализированы с использованием пользовательских кодов MATLAB и Microsoft Excel. График Q – Q использовался для проверки нормальности сравниваемых наборов данных. Оба набора данных были определены как имеющие одинаковую дисперсию с использованием теста F (α = 0,05). Если не указано иное, указанные значения являются средними ± SEM. Статистический метод не использовался для обоснования размеров выборки, но размеры выборки аналогичны тем, которые используются другими в этой области. Критерии отбора данных для экспериментов указаны в разделе «Материалы и методы» для каждого эксперимента и аналогичны критериям, используемым другими в этой области.
Общий подход к разработке положительных индикаторов напряжения eFRET
Молекулярная биология
Гены Ace2 и HaloTag были амплифицированы из плазмиды Voltron 14 . Гены Ace1, MacQ, QuasAr3, mNeonGreen и mRuby3 были синтезированы (Integrated DNA Technologies) с оптимизацией кодонов млекопитающих 10,11,12,13,22 . Гены родопсина и репортера флуоресценции объединяли с помощью перекрывающейся ПЦР. Клонирование выполняли путем расщепления остова плазмиды рестрикционными ферментами, амплификации вставленных генов с помощью ПЦР, изотермической сборки с последующим секвенированием по Сэнгеру для проверки последовательностей ДНК.Тег локализации сомы 23,24 (ST) был добавлен с использованием перекрывающейся ПЦР для создания версий индикаторов, нацеленных на сому (например, Positron-ST). Для экспрессии в первичных культурах нейронов сенсоры клонировали в плазмиду pcDNA3.1-CAG (Invitrogen). Для экспрессии у рыбок данио Positron-ST клонировали в вектор pTol2-HuC (для паннейрональной экспрессии) и в вектор pT2-Tbait-UAS (для Gal4-зависимой экспрессии). ДНК и аминокислотные последовательности позитрона, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag, QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag, Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag, Ace2_D92N_E199V-mNe.2 и 11–15. Плазмиды и карты доступны в Addgene.
Культура клеток HEK 293
Пиковые клетки HEK 293 25 , которые стабильно экспрессируют NaV1.3 и Kir2.1, использовали для тестирования флуоресцентного ответа некоторых позитронных мутантов с использованием полевой стимуляции. Клетки выращивали при 37 ° C, 5% CO 2 , в среде Игла, модифицированной Дульбекко с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, Генетицина (Invitrogen, 10131-027), пенициллина / стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и пуромицина. (Invitrogen, A11138-03).Все трансфекции и анализы проводили в клетках между 5 и 15 пассажами. Плазмиды трансфицировали с использованием фосфата кальция. После трансфекции клетки HEK высевали на 24-луночные планшеты со стеклянным дном (MaTeK) и культивировали в течение 24 часов перед визуализацией. Для мечения конструкций, содержащих HaloTag, клетки инкубировали с лигандом HaloTag, содержащим 100 нМ красителя JF, в течение 30 мин.
Первичная культура нейронных клеток
Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Исследовательского городка Джанелия Медицинского института Говарда Хьюза и Комитетом по институциональной биобезопасности.Нейроны гиппокампа, выделенные от P0 до 1 крысят Sprague-Dawley, трансфицировали плазмидами pcDNA3.1-CAG с различными индикаторами путем электропорации (Lonza, P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit) в соответствии с инструкциями производителя. После трансфекции нейроны гиппокампа высевали на 24-луночные планшеты со стеклянным дном (MaTek) или 35 мм чашки со стеклянным дном (MaTek), покрытые поли-d-лизином (Sigma). Нейроны культивировали в течение 8–12 дней в среде NbActiv4 (BrainBits). Чтобы маркировать нейроны, экспрессирующие Positron, Voltron, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag, QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag и Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag, культуры инкубировали с 20-30 мкл HaloTag по 100 нМ JF.
Микроскопия
Культуры клеток освещали световым механизмом SPECTRA X (Lumencore) и наблюдали через масляный объектив × 40 (NA = 1,3, Nikon) на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti2. Свет возбуждения и испускания пропускали через набор фильтров FITC (475/50 нм (возбуждение), 540/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 506LP (FITC-5050A-000; Semrock)) для изображения Ace2_D92N_E199V-mNeonGreen, a настраиваемый набор фильтров (510/25 нм (возбуждение), 545/40 нм (эмиссия) и дихроичное зеркало 525LP (Chroma)) для изображения Voltron, Positron, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag и Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag 9025 с маркировкой 5 и четырехканальный полосовой фильтр (номер набора: 89000, Chroma) с соответствующей цветовой полосой от источника света SPECTRA X для изображения QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag, маркированного JF 549 , Positron, маркированного JF 585 , и Ace2_Eub3V92N.Флуоресценцию собирали на камеру CMOS для научных исследований (ORCA-Flash 4.0, Hamamatsu) и получали с помощью HCImage Live (Hamamatsu). Для покадровой съемки изображения получали при 400–3200 Гц в зависимости от эксперимента. Буфер для визуализации (содержащий следующее (в мМ): 145 NaCl, 2,5 KCl, 10 глюкозы, 10 HEPES pH 7,4, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 ) использовали во всех экспериментах с культурами клеток.
Для обработки флуоресцентных изображений область интереса (ROI) была вручную нарисована вокруг тела клетки нейрона в изображении J, и флуоресценция была измерена путем усреднения всех пикселей в теле клетки.Необработанная кривая флуоресценции (F) — это средняя интенсивность по ROI во времени. F затем аппроксимируют экспоненциальной кривой для учета обесцвечивания. Мы рассчитали Δ F / F как F — F 0 / F 0 , где F 0 — базовый уровень флуоресценции, усредненный за одну секунду до стимуляции.
Чтобы сравнить яркость позитрона и вольтрона при мембранном потенциале покоя, мы слили mTagBFP2 26 с С-концом позитрона и вольтрона, чтобы получить плазмиды pCAG-Positron-mTagBFP2 и pCAG-Voltron-mTagBFP2.Флуоресцентные изображения получали из десяти различных лунок при трех независимых трансфекциях для каждой конструкции в первичных нейронах гиппокампа. Для маркировки нейронов, экспрессирующих Voltron-mTagBFP2 и Positron-mTagBFP2, культуры инкубировали со 100 нМ лигандом JF 525 HaloTag в течение 25 минут, затем дважды промывали буфером для визуализации, инкубируя клетки в течение 5 минут во время второй промывки. Набор фильтров EBFP2 (405/20 нм (возбуждение), 460/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 425LP (49021; Chroma)) использовался для изображения канала TagBFP2, а настраиваемый набор фильтров (510/25 нм) (возбуждение), 545/40 нм (излучение) и дихроичное зеркало 525LP (Chroma)) использовали для изображения канала JF 525 в конструкциях Voltron-mTagBFP2 и Positron-mTagBF2.Соотношение канала TagBFP2 и канала JF 525 было рассчитано с использованием программного обеспечения ImageJ.
Чтобы сравнить фотостабильность позитрона и вольтрона при мембранном потенциале покоя, мы использовали локализованные версии сомы, помеченные лигандом JF 525 HaloTag. Флуоресцентные изображения (экспозиция 100 мс) получали с использованием объектива × 40 каждую секунду в течение 5 мин культур нейронов, подвергнутых непрерывному 18 мВт мм -2 свету от светоизлучающего диода (LED) (Spectra X, Lumencore).После вычитания фона рассчитывалась средняя интенсивность на кадр и наносилась на график зависимости от времени.
Стимуляция поля при добавлении клеток HEK или культуре нейронов
Изолятор стимула (A385, World Precision Instruments) с платиновыми проволоками использовался для доставки полевых стимулов (50 В, 1 мс), чтобы вызвать выброс клеток HEK или потенциалы действия в культивируемых нейронах 27 . Стимуляцию контролировали с помощью Wavesurfer, а время синхронизировали с получением флуоресценции с помощью Wavesurfer и платы National Instruments PCIe-6353.
Чтобы измерить изменение отклика флюоресценции позитронов и вольтронов на потенциалы действия с течением времени, мы пометили нейроны, экспрессирующие эти индикаторы, и пометили лигандом JF 525 HaloTag и получили изображение с объективом × 40 при 400 Гц при 60 мВт мм — 2 . Мы применяли стимуляцию полевым электродом, чтобы вызвать единичный потенциал действия каждые 3 с. Отдельные нейроны были вручную сегментированы путем рисования областей интереса вокруг тела клетки. Изменение флуоресценции рассчитывали для каждого потенциала действия следа, как описано выше.
Электрофизиология в культуре первичных нейронов
В культивируемых нейронах проводились одновременные записи патч-кламп целых клеток вместе с флуоресцентной визуализацией. Записи токового зажима выполняли в буфере для визуализации: 145 NaCl, 2,5 KCl, 10 глюкозы, 10 HEPES pH 7,4, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , доведенный до 310 мОсм сахарозой при комнатной температуре. Для записи с фиксацией напряжения в буфер для визуализации добавляли 500 нМ ТТХ для блокирования натриевых каналов и добавляли синаптические блокаторы (10 мкМ CNQX, 10 мкМ CPP, 10 мкМ ГАБАЗИН и 1 мМ MCPG) для блокирования ионотропного глутамата, ГАМК, и метаботропные рецепторы глутамата 27 .
Пипетки-патчи были изготовлены с использованием съемника P-97 (Sutter Instruments) с сопротивлением кончика 4–6 МОм. Для записи с токовыми клещами пипетки были заполнены следующим (в мМ): 130 метансульфонат калия, 10 HEPES, 5 NaCl, 1 MgCl 2 , 1 Mg-ATP, 0,4 Na-GTP, 14 Трис-фосфокреатин, с поправкой на pH 7,3 с помощью КОН и доводили до 300 мОсм сахарозой. Для записи с фиксацией напряжения использовался внутренний раствор на основе цезия ((в мМ): 115 метансульфонат цезия, 10 HEPES, 5 NaF, 10 EGTA, 15 CsCl, 3.5 Mg-ATP, 3 QX-314, доведенный до pH 7,3 с помощью CsOH и доведенный до 300 мОсм с помощью сахарозы).
Записи всех клеток были сделаны с использованием усилителя EPC800 (HEKA), отфильтрованы на частоте 10 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифрованы с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6353. Пипетки размещали с помощью манипулятора MPC200 (Sutter Instruments). Программное обеспечение Wavesurfer использовалось для генерации сигналов инжекции тока, записи кривых напряжения и тока, а также для управления камерой и источником света.Нейроны с сопротивлением доступа> 25 МОм отбрасывались. Для записи с токовыми клещами для генерации потенциалов действия подавалось 20–200 пА в течение 1–2 с и контролировалось напряжение.
Для экспериментов с фиксацией напряжения, используемых для создания кривых флуоресценции-напряжения, ступеньки напряжения (от -110 мВ до +50 мВ с шагом 20 мВ в течение 1 с) применялись к клеткам, выдерживаемым при -70 мВ. Флуоресцентные изображения получали при 400 Гц с использованием того же микроскопа, который описан в разделе «Микроскопия» выше. Для определения скорости реакции индикаторов изображения флуоресценции получали при 3200 Гц в ответ на скачок потенциала 100 мВ, подаваемый на нейроны с ограниченным напряжением (от -70 мВ до +30 мВ).Следы были подогнаны к двойной экспоненциальной функции с использованием MATLAB. Все записи производились при комнатной температуре.
Измерения фототока
Фототоки регистрировались при комнатной температуре в режиме фиксации напряжения с удерживающим потенциалом -70 мВ в ответ на световые импульсы длительностью 1 с. Фототоки регистрировались с помощью усилителя EPC800 (HEKA), фильтровались на частоте 10 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифровывались с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6353 на частоте 20 кГц, управляемой с помощью WaveSurfer.Свет доставлялся к зажатым нейронам с использованием того же микроскопа, который описан выше. Энергия излучения в плоскости формирования изображения была установлена на 70 мВт · мм -2 , определенная с помощью датчика мощности на предметном стекле микроскопа (S170C, Thorlabs).
Визуализация у рыбок данио
Была выполнена визуализация напряжения широкого поля in vivo у рыбок данио. Вкратце, индикатор Positron-ST временно экспрессировался инъекцией pT2-Tbait-UAS-Positron-ST (25 нг мкл -1 ДНК с 25 нг мкл -1 мРНК транспозазы Tol2 в среде E3) в Tg ( elavl3: Gal4-VP16) на 1-2 клеточной стадии.JF 525 загружали инъецированным рыбам через три дня после оплодотворения (dpf) путем инкубации в 3 мкМ системном водном растворе JF 525 в течение 2 часов. Рыб с редко меченными нейронами переднего мозга парализовали α-бунгаротоксином (1 мг / мл -1 ) и помещали в агарозу с низкой температурой плавления. Спонтанную активность нейронов переднего мозга регистрировали с помощью специального широкоугольного микроскопа, оснащенного водно-иммерсионным объективом × 60 1.0 NA (MRD07620, Nikon), светодиодным источником света (CBT-90-W, Luminous) и набором фильтров TRITC ( TRITC-B-000, Semrock).Изображения получали с помощью камеры sCMOS (pco.edge 4.2, PCO) при 400 Гц в течение 1-2 мин. Энергия излучения в плоскости изображения составляла 28 мВт · мм -2 (S170C, Thorlabs).
Чтобы сравнить эффективность индикатора Positron-ST и индикатора Voltron-ST для обнаружения пиковой активности, мы сосредоточились на OSN, которые показали тоническую спонтанную пиковую активность, аналогичную той, о которой сообщалось у других видов 28,29 . JF 552 Лиганд HaloTag 30 загружали с использованием того же протокола, описанного выше, и для визуализации отбирали рыб с редко меченными OSN, чтобы минимизировать загрязнение сигналов от ближайших клеток.Используя тот же протокол визуализации, описанный выше, флуоресцентный сигнал регистрировали в течение 5 минут. Необработанный график флуоресценции отдельных OSN сначала был извлечен из вручную нарисованной области интереса, а затем была рассчитана постоянная времени обесцвечивания красителя для каждого индикатора путем подгонки экспоненциальной функции затухания к необработанному временному графику. Чтобы изучить процентное изменение сигнала переходного спайкоподобного сигнала, базовый сигнал флуоресценции, соответствующий мембранному потенциалу покоя, был оценен с помощью нижнего 10-го процентиля временного окна перемещения 1 с (или верхнего 10-го процентиля сигнала в случае Voltron-ST). и используется для расчета процентного изменения сигнала для пикообразного сигнала (Δ F / F 0 ).Затем спайкообразные события были идентифицированы с помощью следующей процедуры. Сначала Δ F / F 0 было преобразовано z , а затем было выполнено дискретное вейвлет-преобразование с максимальным перекрытием с использованием вейвлета sym4 до шестого уровня. Затем была реконструирована локализованная по частоте версия сигнала с использованием вейвлет-коэффициентов от уровня 3 до 6, чтобы максимизировать энергию пиково-подобного сигнала, а затем была применена его мощность к пороговому значению для обнаружения спайкоподобного события.Эта процедура позволила нам обнаружить отчетливый пиковый сигнал независимо от его процентного изменения сигнала для обоих индикаторов с точно такой же процедурой и порогом. Мы ограничили наш анализ клетками, которые показали тоническое возбуждение в течение 5-минутного сеанса визуализации, и исследовали амплитуду (Δ F / F 0 ) и SNR ( z -балл).
Моделирование положительных и отрицательных GEVI
Для моделирования работы положительных и отрицательных индикаторов мы начали с реальной записи из поверхностной коры головного мозга мыши и добавили моделируемые нейроны, как в нашей предыдущей работе 14 .В этих симуляциях мы использовали реальную запись (40 000 кадров), содержащую один нейрон, меченный вольтроном, в качестве положительного контроля. Мы синтезировали пространственные следы для каждого нейрона. Затем мы смоделировали «следы напряжения» для каждого нейрона (дополнительный рисунок 10b), содержащие в среднем 100 импульсов на запись, и преобразовали их в положительные и отрицательные индикаторные следы в диапазоне от F мин до F макс . Для положительных следов F мин соответствует флуоресценции при мембранном потенциале покоя, а F макс — средней высоте шипа.Для отрицательно идущих следов, F min соответствует средней высоте шипа, а F max соответствует флуоресценции при мембранном потенциале покоя.
Индикаторные следы были умножены на эмпирическую кривую обесцвечивания, рассчитанную по нейрону на видео, и масштабированы до сопоставимой яркости. Записи этих модельных нейронов суммировались по нейронам, и к каждому пикселю добавлялся гауссов шум, пропорциональный сигналу. Затем эта выборочная смоделированная запись была добавлена к реальной записи для создания экземпляра моделирования для анализа.
Мы моделировали визуализацию разного количества нейронов с разной индикаторной чувствительностью. Для каждого смоделированного нейрона, для которого мы оценили выбросы, мы включили 5 дополнительных нейронов «не в фокусе» с размытыми пространственными следами и временно перетасованными выбросами, предназначенными для моделирования фоновых источников в реальных записях. Для различной чувствительности индикатора (Δ F / F мин ) мы держали F макс фиксированными (для имитации фиксированной максимальной яркости лиганда красителя) и варьировали F мин для получения соответствующей Δ F / F мин .Пики были восстановлены с использованием алгоритма Spike Pursuit 14 . Мы наносим на график частоту ошибок вывода пиков, рассчитанную как 1-IoU, где IoU — это пересечение, разделенное на объединение двоичных меток пиков для наземной истины и предполагаемых пиков при смоделированной частоте визуализации 400 Гц без биннинга. Код, используемый в симуляциях, доступен на github.com/KasparP/Positron.
Сводка отчетов
Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.
индикатор напряжения мин 1 — индикатор напряжения мин 1 พร้อม การ จัด ส่ง ฟรี ที่ Версия AliExpress
โปรโมชัน ยอด นิยม индикатор напряжения мин. 1: ข้อ เสนอ และ ส่วนลด ออนไลน์ ที่ ดี ที่สุด พร้อม บท วิจารณ์ ของ ที่ แท้จริง
ข่าวดี! คุณ อยู่ ใน สถาน ที่ ที่ เหมาะสม мин. 1 индикатор напряжения ตอน นี้ คุณ รู้ อยู่ แล้ว ว่า สิ่ง ที่ คุณ หา อยู่ คุณ แน่ใจ ได้ ว่า จะ พบ กล่าว ใน AliExpress แท้จริง เรา มี ผลิตภัณฑ์ เยี่ยม หลาย พัน รายการ ทุก หมู่ ผลิตภัณฑ์ ไม่ ว่า คุณ จะ กำลัง มอง หา ป้าย ชื่อ เอน ด์ หรือ การ ซื้อ สินค้า เป็น มาก ก็ตาม เรา รับประกัน ได้ ว่า จะ มี ร้าน AliExpress อยู่ ที่ นี่ คุณ จะ พบ ร้าน ค้า เป็น ทางการ พร้อม กับ ลด ราย เล็ก ๆ ทุก คน มี การ จัด ส่ง รวดเร็ว และ เชื่อถือ ได้ วิธี การ ชำระ เงิน ที่ สะดวก ปลอดภัย ไม่ คุณ จะ ใช้ จ่าย เท่าไร
AliExpress จะ ไม่ ถูก เลือก ด้าน คุณภาพ และ ราคา ทุกๆ พบ ข้อ เสนอ พิเศษ แบบ ออนไลน์ ใน การ จัด เก็บ และ โอกาส ใน การ จ่าย มาก ยิ่ง ขึ้น การ แต่ คุณ รวดเร็ว индикатор мин 1 ชุด นี้ กลาย เป็น หนึ่ง ใน ผู้ ที่ ได้ ความ สนใจ มาก ที่สุด ใน เวลา อัน ว่า อิจฉา คุณ เป็น เพื่อน จะ เป็น อย่างไร เมื่อ คุณ บอก ได้ индикатор напряжения мин 1 กับ AliExpress ด้วย indicator ที่ ต่ำ สุด ทาง ออนไลน์ อัตรา ค่า จัด ส่ง ราคา ถูก และ เลือก การ เก็บ ใน ท้องถิ่น คุณ สามารถ ได้ มาก ยิ่ง ขึ้น
AliExpress จะ ไม่ ถูก เลือก ด้าน คุณภาพ และ ราคา ทุกๆ พบ ข้อ เสนอ พิเศษ แบบ ออนไลน์ ใน การ จัด เก็บ และ โอกาส ใน การ จ่าย มาก ยิ่ง ขึ้น การ แต่ คุณ รวดเร็ว индикатор мин 1 ชุด นี้ กลาย เป็น หนึ่ง ใน ผู้ ที่ ได้ ความ สนใจ มาก ที่สุด ใน เวลา อัน ว่า อิจฉา คุณ เป็น เพื่อน จะ เป็น อย่างไร เมื่อ คุณ บอก ได้ индикатор напряжения мин 1 กับ AliExpress ด้วย indicator ที่ ต่ำ สุด ทาง ออนไลน์ อัตรา ค่า จัด ส่ง ราคา ถูก และ เลือก การ จัด เก็บ ใน ท้องถิ่น คุณ สามารถ ประหยัด ได้ มาก ยิ่ง ขึ้น
หาก คุณ ยัง คง มี ความ คิด индикатор напряжения мин. 1 และ กำลัง คิด หา ผลิตภัณฑ์ ที่ คล้าย AliExpress เป็น สถาน ที่ ยอด เยี่ยม ใน การ เปรียบเทียบ ราคา ราคา ผู้ ขาย เรา จะ ให้ ควร จะ จ่าย เงิน เพิ่ม สำหรับ รุ่น ไฮ เอน ด์ หรือ ไม่ ว่า จะ ได้ รับ พิเศษ ด้วย การ ซื้อ สินค้า ที่ ถูก ไม่ และ ถ้า คุณ เพียง ต้องการ ที่ จะ และ สาด ออก ใน AliExpress มัก จะ คุณ รับ ราคา ที่ ดี ที่สุด สำหรับ เงิน ของ คุณ แม้ แจ้ง ทราบ เมื่อ คุณ จะ ดี กว่า รอ ส่งเสริม การ เพื่อ เริ่ม ต้น เงิน ออม ที่ คุณ คาด หวัง ได้
AliExpress มี ความ ภาค ภูมิใจ ใน การ การ ตรวจ สอบ ให้ เลือก ที่ ทราบ เมื่อ ร้าน ค้า และ ผู้ ขาย กว่า ร้อย แพลตฟอร์ม เรา ทุก ร้าน ค้า ผู้ รับ การ จัด อันดับ และ คุณภาพ โดย ลูกค้า ที่ แท้จริง นอกจาก นี้ คุณ ยัง จัด เก็บ หรือ การ ให้ คะแนน ผู้ ราย รวม ทั้ง เปรียบเทียบ ราคา การ จัด ส่ง สำหรับ ผลิตภัณฑ์ เดียวกัน โดย การ อ่าน ความ ที่ ผู้ การ ครั้ง จะ ได้ รับ การ จัด อันดับ โดย ดาว และ มัก คิดเห็น จาก ลูกค้า ราย เดิม ที่ อธิบาย ใน การ ทำ ธุรกรรม เพื่อ ให้ คุณ สามารถ ด้วย ความ ทุก ครั้ง ใน ระยะ สั้น ใช้ คำ ของ เรา แค่ ฟัง ล้าน ของ ลูกค้า มี ความ สุข
และ ถ้า คุณ ยัง ใหม่ กับ AliExpress เรา จะ แจ้ง โดย ละเอียด ก่อน ที่ คุณ จะ เดี๋ยวนี้ ใน ขั้น ตอน การ ทำ ธุรกรรม โปรด รอ ครู่ เพื่อ ตรวจ สอบ คูปอง คุณ มาก ยิ่ง ขึ้น คุณ คูปอง คูปอง AliExpress หรือ คุณ สามารถ เก็บ คูปอง ทุก วัน โดย การ แอ ป AliExpress และ เนื่องจาก ผู้ ใหญ่ ของ เรา นำ เสนอ การ จัด ส่ง — เรา คิด ว่า คุณ จะ ยอมรับ ว่า индикатор напряжения мин. 1 รายการ นี้ ที่ ราคา ที่ ดี ที่สุด ทาง ออนไลน์
Генетические индикаторы напряжения | BMC Biology
Подобно тому, как Лейбниц входит в свою мельницу разума, представьте себе, как в реальном времени наблюдает за работой нервной системы с нейронами, получающими возбуждающий и тормозной постсинаптические потенциалы (EPSP и IPSP соответственно), объединяя их в общую электрическую систему. ответ и генерирование потенциалов действия (AP), которые передаются другим нейронам.Такой эксперимент во сне, являющийся своего рода «святым Граалем» нейробиологии, можно было провести с помощью визуализации мембранного потенциала. Аромат этого уже можно оценить по визуализации кальция [1,2,3], где, используя либо органические, либо генетически закодированные индикаторы кальция, можно отслеживать активность популяций нейронов у бодрствующих животных, хотя и с медленным разрешением по времени и без способность наблюдать отдельные спайки во время высокочастотных последовательностей спайков или измерять синаптические потенциалы [4,5,6].
Визуализация напряжения нейронов затруднена по многим причинам. Хотя мембранный потенциал весьма значителен по амплитуде (до десятых долей вольта), он существует в ограниченном пространстве, тонкой плазматической мембране и связанной с ней дебаевской длине, толщиной всего несколько нанометров. Из-за этого, чтобы измерить электрическое поле, датчики должны быть нацелены с нанометровой точностью, с небольшой вероятностью ошибки. Более того, сенсоры должны быть специально нацелены на плазматическую мембрану, поскольку подавляющее большинство клеточных мембран являются внутриклеточными, которые, будучи помечены датчиками напряжения, вносят только фоновый вклад в сигнал.Помимо этой задачи нацеливания, абсолютная тонкость мембраны означает, что там можно разместить только несколько сенсорных молекул, поэтому об изменениях напряжения можно сообщить только с использованием очень небольшого количества фотонов, требующих эффективных хромофоров, сильных источников света и временного или пространственного усреднения. Тем не менее, сигналы напряжения мембраны являются миллисекундными, а нейроны имеют богатую дендритную или аксональную морфологию, где сигналы напряжения необходимо измерять, что затрудняет пространственное или временное усреднение. Еще больше усложняет ситуацию то, что даже если нацеливание было эффективным и метило все клетки и процессы, клубок нейропиля млекопитающих остается оптически неразрешимым для традиционной микроскопии.Кроме того, мембранные потенциалы градуированы по амплитуде, поэтому измерения должны иметь значительный динамический диапазон с, в идеале, линейными передаточными функциями в физиологическом диапазоне от — 100 до 100 мВ. Последняя трудность возникает, поскольку плазматическая мембрана — это не просто еще один клеточный компартмент, а именно тот, который защищает нейрон извне и целостность которого имеет первостепенное значение. Это делает его чрезвычайно чувствительным к любым возмущениям, от добавления дополнительных молекул или зарядов, которые могут повлиять на его биохимические или электрические свойства, до фотоповреждений от образования свободных радикалов кислорода из-за фотовозбуждения индикаторов напряжения или эндогенных хромофоров.
Этот запретительный набор трудностей не остановил исследователей от работы с изображениями напряжения [7,8,9], что привело к появлению множества различных методологических подходов, демонстрирующих большую изобретательность [10]. Действительно, в методах оптического измерения мембранного потенциала используются самые разные стратегии, такие как (i) повторное разделение, когда хромофоры перемещаются в мембрану и выходят из нее с изменениями напряжения; (ii) переориентация, при которой электрическое поле изменяет относительное выравнивание хромофора относительно мембраны; (iii) электрохромизм, когда мембранный потенциал модулирует основное и возбужденное состояния хромофора, изменяя длину волны возбуждения или излучения; (iv) резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), когда вызванные напряжением конформационные или спектральные изменения изменяют эффективность передачи энергии хромофоров; (v) тушение, когда мембранный потенциал влияет на молекулярные взаимодействия, которые уменьшают интенсивность флуоресценции; (vi) индуцированная напряжением димеризация / агрегация хромофоров, изменяющая их спектры; (vii) электрооптическая модуляция генерации второй гармоники (ГВГ) хромофоров; (viii) плазмонный эффект наночастиц по усилению сигналов от соседних хромофоров; и (ix) отображение показателя преломления или других внутренних оптических изменений клетки из-за ее электрической активности.
Используя некоторые из этих механизмов, за последние четыре десятилетия исследователи синтезировали органические потенциалочувствительные красители для измерения мембранного потенциала in vitro и in vivo [7,8,9, 11,12,13,14]. Эти красители были особенно эффективны в препаратах беспозвоночных с большими и прочными нейронами и с небольшим нейропилем [15,16,17], а также в некоторых препаратах млекопитающих, либо in vitro [18, 19], либо путем инъекции красителей в отдельные клетки [ 20, 21] или использовать их для измерения объема ткани in vitro [22, 23] или in vivo, но без разделения отдельных клеток [8].Несмотря на эту новаторскую работу, вольтажная визуализация препаратов млекопитающих in vivo с разрешением отдельных клеток остается проблемой, а визуализация активности нейронных цепей in vivo вместо этого обычно выполняется с помощью кальциевых индикаторов в сочетании с двухфотонным возбуждением для оптического проникновения и секционирование [4, 24, 25].
Недавняя разработка генетически кодируемых индикаторов напряжения (GEVI) представляет собой новую стратегию, которая с помощью белковой инженерии может преодолеть некоторые ограничения органических красителей, чувствительных к напряжению (рис.1). Основываясь на успешной разработке генетически кодируемых индикаторов кальция [26], открытие чувствительного к напряжению домена (VSD) из фосфатазы [27, 28] позволило создать семейство GEVI, связав его с флуоресцентными белками в различных конфигурациях ( Рис.1, слева). Кроме того, было разработано второе семейство GEVI на основе микробных родопсинов, которые демонстрируют слабую, но чувствительную к напряжению флуоресценцию [29]. Наконец, третья категория генетических датчиков напряжения использует гибридный подход с взаимодействием органических и белковых компонентов [30], используя совместные преимущества химического и генетического дизайна.В следующих разделах мы даем краткий обзор этих трех семейств генетических индикаторов напряжения и даем сравнение их производительности в таблице 1. Учитывая, насколько быстро эта область развивается, наш обзор является всего лишь моментальным снимком во времени, и мы поощряем читателя. чтобы быть в курсе новых показателей напряжения по мере их публикации.
Рис. 1Исторический обзор генетических индикаторов напряжения. Датчики делятся на три различных семейства на основе доменов измерения напряжения (VSD; слева, ), микробных родопсинов (, средний ) или хемогенетических зондов ( справа, ) и расположены в хронологическом порядке в соответствии с годом первого отчета.Цвет рамки относится к длине волны активации, указанной в документе или полученной из спектра флуоресцентного белка. Черные звезды обозначают полученные результаты двухфотонных измерений. Обратите внимание, что HAPI-Nile Red и Voltron также основаны на родопсине. См. Текст для ссылок
Таблица 1 Сравнительная характеристика генетически ориентированных индикаторов напряжения. Значения взяты из литературы. NR не сообщается, RT комнатная температураЧувствительные к напряжению GEVI на основе домена
Индикаторы напряжения на основе VSD состоят из VSD и флуоресцентного белка (рис.2а). Первый индикатор напряжения на основе VSD, FlaSh, использовал VSD из потенциалзависимого калиевого канала [31], но имел ограниченное применение в препаратах для млекопитающих. Совсем недавно VSD фосфатазы из Ciona Кишечник [27] систематически использовался для создания GEVI с улучшенным переносом через мембрану и повышенной производительностью [32, 33]. Скрининг флуоресцентных белков, слитых с этим VSD, привел к созданию ArcLight, состоящему из VSD и мутантного суперэклиптического pHluorin [34]. Хотя ArcLight обладает хорошей чувствительностью к напряжению, его медленная кинетика флуоресценции приводит к низкой амплитуде сигнала и ограниченному временному разрешению для обнаружения пиков.Для ускорения кинетики в VSD Ciona были внесены мутации, что дало улучшенные варианты ArcLight [35,36,37]. В качестве альтернативы VSD Ciona , VSD другой потенциалочувствительной фосфатазы из Gallus gallus был использован для вставки GFP суперпапки с круговой перестановкой во внеклеточную петлю VSD, между третьей и четвертой трансмембранными спиралями, для более быстрого получения индикаторы напряжения, получившие название ускоренного датчика потенциалов действия (ASAP) [38,39,40,41].В последнее время были предприняты попытки изменить полярность оптических сигналов; в отличие от некоторых из более ранних индикаторов, эти новые индикаторы напряжения (Marina, FlicR1 и FlicR2) увеличивают яркость, когда мембрана деполяризована, и демонстрируют более низкую флуоресценцию при потенциалах покоя мембраны (рис. 2b, c) [42, 43]. Кроме того, недавно были разработаны GEVI на основе VSD (рис. 2b) [42, 44, 45].
Рис. 2Последние GEVI на основе VSD. a Схематическое изображение двух конфигураций GEVI на основе VSD. Слева : слияние VSD с внутриклеточным флуоресцентным белком (FP). Справа : Вставка ДМЖП с внеклеточной циркулярной перестановкой FP. b Слева : Экспрессия FlicR1, индикатора с красным смещением и обратной полярностью, в диссоциированном нейроне гиппокампа. Справа : оптический ( красный, ) и электрический ( черный, ) отклики на потенциалы действия с частотой 5 Гц, зарегистрированные с помощью однофотонной визуализации. Изменено с разрешения [43]. c Слева : Экспрессия Марины, зеленого индикатора с обратной полярностью в культивируемых нейронах гиппокампа. Справа : спонтанная импульсная активность в корковом нейроне острого среза головного мозга, записанная с помощью однофотонной визуализации. Изменено из [44] с разрешения
GEVI на основе VSD успешно использовались для измерения как одиночных нейронов, так и нейронных цепей, что позволяет регистрировать динамику мембранного потенциала в небольших нейронных компартментах, труднодоступных с помощью обычных электрофизиологических методов. Например, измерения мембранного потенциала в дендритных шипах in vitro были выполнены с помощью ArcLight, сочетая однофотонную визуализацию напряжения с двухфотонным снятием каркаса глутамата [46].Кроме того, потенциалы действия в дендритах, распространяющиеся в обратном направлении, регистрировались с помощью ASAP2s с двухфотонной микроскопией [40]. GEVI на основе VSD также использовались in vivo. С помощью одно- или двухфотонной визуализации напряжения в широком поле можно отобразить сенсорно-вызванные или спонтанные потенциалы с больших территорий, хотя и без разрешения отдельных клеток [47,48,49]. Мониторинг подпороговой динамики мембранного потенциала и потенциалов действия с клеточным разрешением был достигнут in vivo с использованием VSD на основе GEVI у Drosophila [39, 50].Но визуализация напряжения с разрешением отдельных клеток in vivo была сложной задачей для препаратов млекопитающих из-за рассеяния света и плохого отношения сигнал / шум (SNR). Недавно и ArcLight-MT, и недавно разработанный ASAP3 были использованы для регистрации подпороговых потенциалов и потенциалов спонтанного действия у бодрствующих или анестезированных мышей in vivo при двухфотонном возбуждении с разрешением одной клетки [49]. Кроме того, визуализация вольтамперометра и визуализация кальция также недавно были объединены у плодовых мух in vivo [39].
Хотя производительность GEVI на основе VSD улучшилась, создание изображений напряжения с их помощью все еще остается сложной задачей. Необходимы дальнейшие успехи, особенно в области визуализации in vivo. В частности, были бы желательны лучшие характеристики при двухфотонном возбуждении и разработка индикаторов с красным смещением для многоцветной визуализации и комбинации с оптогенетикой. Также представляется важным разработать более яркие GEVI на основе VSD, чтобы получить более высокие отношения сигнал / шум, сравнимые с визуализацией кальция. Наконец, как и в случае с другими индикаторами напряжения, быстрое фотообесцвечивание GEVI на основе VSD может помешать долгосрочному мониторингу динамики мембранного потенциала.Чтобы преодолеть фотообесцвечивание, улучшение GEVI типа Marina и FlicR кажется особенно многообещающим, поскольку они показывают низкую флуоресценцию в состоянии покоя и становятся ярче при деполяризации мембранного потенциала.
GEVI на основе родопсина
GEVI на основе микробных родопсинов делятся на два различных класса. Один использует родопсин как датчик напряжения и как флуоресцентный репортер, в то время как другой использует чувствительный к напряжению родопсин, связанный с флуоресцентной меткой (рис. 3a). Первым микробным датчиком напряжения на основе родопсина был PROPS (оптический датчик протонов протеородопсина) [51].Авторы обнаружили, что в протеородопсине, поглощающем зеленый цвет, состояние протонирования основания Шиффа сетчатки (RSB), которое ковалентно прикрепляет хромофор к апопротеину, в значительной степени определяет цвет и флуоресценцию родопсина. Они пришли к выводу, что изменение мембранного напряжения должно влиять на локальный электрохимический потенциал вокруг RSB и тем самым изменять флуоресценцию белка [51]. Посредством мутагенеза естественная светоактивированная ионная транспортная активность микробного родопсина была отменена, и RSB pk a был сдвинут, чтобы воспринимать мембранные потенциалы в физиологическом диапазоне.Использование PROPS было ограничено Escherichia coli , но, используя аналогичный механизм восприятия, Archaerhodopsin 3 haloarchaea Halorubrum sodomense , известный как Arch, был впоследствии разработан для визуализации напряжения нейронов млекопитающих [29]. В последние годы усовершенствования сенсоров на основе родопсина в основном связаны с мутациями в Arch [52, 53], что привело к улучшенным индикаторам, таким как QuasAr 1-3 [54, 55], NovArch [56] и, недавно, Archon 1 и 2. [57] (рис. 1). И QuasAr3, и Archon1 использовались для успешной регистрации поездов потенциала действия in vitro с хорошим SNR [55, 57] (Таблица 1) и использовались in vivo, хотя и с однофотонным возбуждением [55, 57].
Рис. 3Недавние ГЭВИ на основе родопсина. a Представление двух типов GEVI на основе родопсина с GEVI типа PROPS ( слева, ) и GEVI на основе eFRET ( справа, ). b Слева : конфокальные изображения экспрессии QuasAr3 в срезах мозга; стержень 50 мкм. Средний : записи патч-зажим ( черный, ) с соответствующими следами флуоресценции ( красный, ) в острых срезах головного мозга. Справа : наложение электрического и оптического сигнала для одной точки доступа.Изменено с разрешения [55]. c Слева : экспрессия Archon1 в острых срезах головного мозга; стержень 25 мкм. Середина : флуоресценция Archon1 ( розовый, ; одно испытание) и соответствующие электрические следы ( черный, ) в культивируемых клетках с наложением обоих сигналов для AP, указанных стрелкой. Справа : Изменения флуоресценции (однократное испытание) Archon 1 после изменения напряжения, подобного потенциалу действия ( черный, ) на 200 Гц в нейроне с ограниченным напряжением в культуре.Изменено с разрешения [57]. d Слева : конфокальное изображение экспрессии VARNAM в пирамидных нейронах в фиксированных постнатальных срезах головного мозга. Средний : Параллельные оптические ( красный, ) и электрические записи (, черный, ), вызванные подачей тока 10 Гц ( слева, ) и 50 Гц ( справа, ) с наложением обоих сигналов для указанной точки доступа. Справа : Изменения мембранного потенциала, вызванные активацией канала родопсина Cheriff ( синий, ), отслеживаются электрически ( черный, ) и оптически ( красный, ).Изменено с разрешения [44]
Комбинация сенсора и репортера в одном маленьком белке в микробных родопсинах кажется элегантной и обеспечивает время отклика в субмиллисекундном диапазоне [29, 51, 54, 58] и, кроме того, большую чувствительность ( как ΔF / F на 100 мВ) от 30 до 90% [53,54,55,56,57] делают их очень многообещающими. Тем не менее, как индикаторы напряжения, микробные родопсины страдают недостатками, которые не смогли преодолеть даже самые последние варианты. Поскольку белки оптимизированы для переноса ионов, а не флуоресценции, их квантовый выход обычно на порядки ниже, чем у флуоресцентных белков, таких как GFP [29], что создает низкую яркость и требует высокой интенсивности освещения в диапазоне от нескольких десятков до сотен Вт / см. 2 , даже для последних вариантов [55, 57].Для повышения яркости микробные родопсины были объединены с флуоресцентными белками, в результате чего получилась вторая подгруппа сенсоров на основе родопсина: электрохромные FRET (eFRET) GEVI (рис. 3a), где родопсин, по сути, служит VSD. Здесь флуоресцентный белок слит на С-конце с седьмой трансмембранной спиралью, обеспечивая чувствительное к напряжению безызлучательное тушение флуорофора с помощью родопсина, механизм, уже исследованный ранее с органическими красителями [59]. Первоначальные подходы объединили макродопсин, световой протонный насос из L.maculans (пик поглощения 550 нм) до mCitrine или mOrange2 [60]. Хотя MacQ-mCitrine и mOrange2 немного медленнее, чем сенсоры чистого родопсина, они все же генерируют полный амплитудный ответ в течение 5 мс и достоверно сообщают о потенциалах действия в культивируемых нейронах с 5-7% ΔF / F на спайк [60]. Следуя тому же подходу, QuasAr2 был слит с несколькими флуоресцентными белками (eGFP, Citrine, mOrange2, mRuby2), что дало сенсоры со сходной кинетикой и чувствительностью [61]. Используя более быстрый родопсин Acetabularia (Ace) в качестве тушителя для mNeonGreen, время отклика может быть значительно ускорено без потери чувствительности [62].Последним дополнением к GEVI eFRET является недавно опубликованный VARNAM, который также использует Ace, связанный с флуоресцентным белком mRuby3. VARNAM требует низкой интенсивности света (1,5 Вт / см2), сохраняет быструю кинетику Ace-mNeonGreen и демонстрирует высокую фотостабильность [44], в то время как его активация с красным смещением делает его легко комбинируемым с оптогенетическими приводами, активируемыми синим светом. Однако даже VARNAM не смог преодолеть недостаток GEVI на основе родопсина: слабую производительность при двухфотонном освещении [44].
Хемогенетические индикаторы
Хотя GEVI имеют то преимущество, что они могут быть генетически нацелены на плазматические мембраны и клеточные популяции, они могут иметь недостатки из-за низкой яркости, плохой фотостабильности и медленной кинетики. Но, как уже упоминалось, оптические измерения потенциала клеточной мембраны выполнялись на протяжении десятилетий с небольшими органическими синтетическими молекулами [12, 13, 15]. Эти красители чувствительны к напряжению, часто из-за электрохромизма, и могут иметь большие частичные изменения флуоресценции и отличные кинетические характеристики и фотофизические свойства [8, 11, 63].В то же время эти маленькие липофильные молекулы вызывают неспецифическое окрашивание ткани, серьезно нарушая SNR и разграничение клеток. Чтобы обойти эти проблемы, появилась гибридная стратегия, использующая вместе химические и генетические индикаторы: сочетание оптических свойств низкомолекулярных флуорофоров с генетическим нацеливанием (рис. 1) [30, 64, 65, 66]. Термин «хемогенетика», обычно используемый для небольшой молекулы, которая активирует генно-инженерные белки, был применен к этим гибридным индикаторам напряжения [67].Мы рассматриваем три общих класса индикаторов хемогенетики в соответствии с молекулярным механизмом сенсорного домена и флуоресцентного репортера.
Хемогенетические датчики на основе FRET
В одном из первых хемогенетических датчиков, названном гибридным датчиком напряжения (hVOS), использовалась экзогенно добавленная липофильная молекула, которая в зависимости от напряжения подавляла флуоресцентные белки, рекрутированные на мембрану. hVOS использовала двухкомпонентную стратегию на основе FRET, изначально разработанную без генетических компонентов [68], но адаптированную для генетического нацеливания (рис.4а) [69,70,71,72,73]. Первый компонент состоит из флуоресцентного белка с присоединенными фарнезилированными и пальмитоилированными мотивами, которые прикрепляют его к плазматической мембране [70, 72]. Второй компонент — нефлуоресцентное синтетическое соединение дипикриламин (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET (тушителя). Поскольку DPA является липофильным, но отрицательно заряженным, он распределяется в мембране в зависимости от напряжения, перемещаясь во внутренний слой во время деполяризации, что гасит флуоресценцию белка.Но поскольку DPA увеличивает емкость мембраны, следует использовать низкую концентрацию, чтобы не нарушать естественные физиологические реакции [73]. Недавнее использование этого сенсора показывает большую универсальность для представления активности нейральной популяции с использованием клеточно-специфического генетического нацеливания у трансгенных мышей (рис. 4b).
Рис. 4Индикаторы хемогенетического напряжения. a Схематическое изображение hVOS, состоящего из флуоресцентного белка, прикрепленного к плазматической мембране, в сочетании с нефлуоресцентным синтетическим соединением дипикриламином (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET. b Сотовая визуализация напряжения с разрешением hVOS. Срезы гиппокампа мышей hVOS :: Fos, экспрессирующие зонд hVOS в гранулярных клетках Cre-Fos-зависимым образом. Слева : флуоресценция в срезах мозга после скрещивания Ai35-hVOS с мышами Cre-Fos, демонстрирующая нейроны, экспрессирующие hVOS, в слое гранулярных клеток гиппокампа. Справа : Ответ четырех нейронов в срезе гиппокампа от мыши hVOS :: Fos на электрическую стимуляцию. c Схематическое изображение VoltageSpy, состоящего из экспрессии SpyCatcher на клеточной поверхности и последующего внеклеточного взаимодействия с красителем VF. d Визуализация субклеточного напряжения с помощью VoltageSpy. Культивированные нейроны гиппокампа, коэкспрессирующие SpyCatcher и ядерный mCherry и меченные с помощью VoltageSpy, были захвачены при 500 Гц под широкопольным флуоресцентным микроскопом. Слева : VoltageSpy показано зеленым и окрашиванием ядер красным . Средний : большее увеличение выбранных дендритных областей. Шкала 20 мкм. Справа : отображение напряжения в дендритах, показывающее вызванные потенциалы действия в выбранных областях интереса, закодированные цветами, указанными на панели.Изображения и следы изменены с разрешения [69] ( b ) и [82] ( d )
Второй тип хемогенетических сенсоров на основе FRET использует микробные родопсины в качестве сенсоров [61, 62]. Как уже упоминалось, колебания мембранного напряжения вызывают изменение абсорбции родопсинов, которое можно считывать с помощью сайт-специфически лигированного органического флуорофора. Электрохромный FRET родопсина с помощью лигирования флуорофора (FlareFRET) действует как флуорофор, селективно присоединенный к неприродной аминокислоте, кодируемой внутри родопсина [74].Этот датчик обладает широкой универсальностью, позволяя добавлять цветовую палитру и достигать 35,9% ΔF / F на 100 мВ и отклик в миллисекундах.
Наконец, недавняя разработка новых родаминовых красителей с высокой фотостабильностью и яркостью, таких как серия Janelia Fluor (JF), привела к разработке Voltron [42]. JFs совместимы с белковыми метками и пересекают гематоэнцефалический барьер в экспериментах на млекопитающих in vivo. Voltron сочетает в себе чувствительный к напряжению микробный родопсин с самомеченным белковым доменом, который ковалентно связывает синтетический флуорофор JF [75, 76].Зависимые от напряжения изменения в спектре поглощения родопсина обратимо модулируют степень тушения флуоресценции красителя посредством FRET. С помощью Voltron можно измерять импульсные нейронные импульсы и подпороговые напряжения в личиночных рыбках данио, плодовых мушках и мозге мышей [42].
Хемогенетические сенсоры на основе ферментов
Эта конструкция основана на генетически закодированном ферменте на поверхности клетки, который активирует предшественник органического индикатора напряжения. Например, водорастворимый краситель-предшественник гидролизуется щелочной фосфатазой, которая отщепляет полярную группу, усиливая ее липофильный характер [30].Это значительно улучшает нацеливание и накопление модифицированного электрохромного красителя в мембране клетки, экспрессирующей фосфатазу. Хромофор аминостирилпиридиния (ASP) является примером предшественника чувствительного к напряжению красителя с фосфатной группой, присоединенной к его головной группе [30, 65]. Первое поколение красителей на основе ASP приводило к окрашиванию внутренних органелл за секунды. Используя ту же стратегию, второе поколение сенсоров с использованием ANNINE-6, одного из наиболее чувствительных к напряжению красителей, показало изменение интенсивности ΔF / F на 50% на 100 мВ и могло быть использовано для нацеливания in vivo [66].Одним из основных преимуществ этих методов является то, что мембраны можно маркировать большим количеством молекул.
Новое поколение сенсоров на основе ферментов (VF-EX) представляет собой хемогенетический зонд, в котором генетически кодируемая эстераза выводит из клетки краситель VF в определенных нейронах [77]. Затем VF использует фотоиндуцированный перенос электронов (PeT) в качестве триггера интенсивности флуоресценции, зависящего от мембранного потенциала [78,79,80]. VF обладает скоростью, яркостью и чувствительностью, чтобы сообщать о потенциалах действия в нейронах в единичных испытаниях.Кроме того, VF химически модифицирован, чтобы он был минимально флуоресцентным в качестве предшественника и активируется при ферментативной активности. Нацеленная эстераза печени свиньи (PLE) на мембране расщепляет VF на поверхности клетки [81]. Используя этот подход, можно измерить потенциалы действия в культивируемых нейронах [77]. Кроме того, по сравнению с некоторыми GEVI [70], VF-EX показывает улучшенное соотношение сигнал / шум и изменение флуоресценции, маркируя дендриты и дендритные шипы [77].
Хемогенетические датчики с привязкой к метке
Последняя категория хемогенетических зондов улавливает химические флуорофоры в плазматической мембране с помощью белкового каркаса.В системе VoltageSpy используется сконструированная молекула клеточной адгезии, взаимодействующая с красителем VF, содержащим саркозин (рис. 4a). Это взаимодействие стало возможным благодаря линкеру полиэтиленгликоля (ПЭГ) между небольшим пептидом из 13 остатков и красителем VF [82]. Локализация VoltageSpy определяется экспрессией белка SpyCatcher на клеточной поверхности. Об улучшении обнаружения напряжения по сравнению с обычно используемыми генетическими индикаторами напряжения в культуральных клетках сообщалось для VoltageSpy [82].Используя этот датчик, можно измерять напряжения в терминалах аксонов, дендритах и шипах (рис. 4d). Наконец, гибридный сенсор, прикрепленный к белковой метке, HAPI-Nile, основанный на индикаторе напряжения Nile Red, демонстрирует флуоресцентные изменения в физиологическом диапазоне мембранного потенциала [83]. С помощью этого зонда можно обнаруживать запускаемые потенциалы действия и над / подпороговую активность в культивируемых нейронах.
Селективная локализация синтетического индикатора напряжения в интересующих клетках с использованием генетически закодированных белковых тегов кажется многообещающей.
