Тра 1. Алмазные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2: характеристики, применение и особенности — Производство и поставка электростанций, Бензиновые и дизельные генераторы от 1 до 100 кВт. Мини ТЭЦ на базе двигателя Стирлинга.

Какие основные характеристики имеют алмазные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2. Для чего они предназначены. Каковы их преимущества перед другими типами терморезисторов. Как правильно использовать ТРА-1 и ТРА-2 в различных приложениях.

Содержание

Общие сведения об алмазных терморезисторах ТРА-1 и ТРА-2

Алмазные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2 представляют собой изолированные герметизированные приборы с отрицательным температурным коэффициентом сопротивления. Они разработаны для применения в электрических цепях постоянного и переменного тока.

Основные области применения этих терморезисторов включают:

Измерение температуры
Определение скорости потоков жидкости и газа
Измерение степени разрежения
Температурная компенсация характеристик элементов электрических цепей

Уникальные особенности конструкции ТРА-1 и ТРА-2

Ключевой особенностью данных терморезисторов является использование монокристалла синтетического алмаза в качестве термочувствительного элемента. Алмаз легирован акцепторными примесями в ТРА-1 (p-проводимость) и донорными примесями в ТРА-2 (n-проводимость).

Такая конструкция обеспечивает ряд важных преимуществ:

Долговременная стабильность основных параметров
Уникально малая тепловая инерционность
Способность работать в агрессивных средах
Устойчивость к повышенной радиации

Технические характеристики алмазных терморезисторов

Рассмотрим основные технические параметры ТРА-1 и ТРА-2:

Диапазон сопротивлений: от 0,05 до 100 000 кОм при 25°C
Допустимое отклонение сопротивления: ±5%, ±10%, ±20%
Температурный коэффициент сопротивления при 25°C:
- ТРА-1: от -0,2 до -2,3 %/К
- ТРА-2: от -0,55 до -6 %/К
Коэффициент температурной чувствительности в диапазоне 80-600 К:
- ТРА-1: 300-2500 К
- ТРА-2: 600-6000 К
Максимальная рассеиваемая мощность: 500 мВт

Постоянная времени: менее 1 секунды

Особенности эксплуатации ТРА-1 и ТРА-2

При использовании алмазных терморезисторов ТРА-1 и ТРА-2 следует учитывать следующие аспекты:

Рабочий диапазон температур: от -200°C до +330°C
Максимальное атмосферное давление: 297 200 Па
Допустимая относительная влажность: до 98% при 35°C
Наработка на отказ: не менее 20 000 часов
Срок сохраняемости: 20 лет

Терморезисторы выпускаются в миниатюрном стеклянном корпусе с гибкими лужеными выводами, что облегчает их монтаж и интеграцию в различные устройства.

Математическое описание характеристик терморезисторов

Для точного расчета параметров терморезисторов ТРА-1 и ТРА-2 используются следующие формулы:

Температурная зависимость сопротивления: R_T = R₂₅ * exp(B * (1/T — 1/T₀)) где: R_T — сопротивление при температуре T R₂₅ — сопротивление при 25°C (298 К) B — коэффициент температурной чувствительности T — температура в Кельвинах T₀ = 298 К
Связь температурного коэффициента сопротивления α с коэффициентом B: B = -α * T² где α задается в 1/К. Если α задан в %/К, результат нужно умножить на 10^-2.

Применение ТРА-1 и ТРА-2 в различных областях

Благодаря своим уникальным характеристикам, алмазные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2 находят применение в различных отраслях:

Аэрокосмическая промышленность: измерение температуры и скорости потоков в условиях экстремальных температур и радиации
Медицинское оборудование: высокоточные измерения температуры тела
Автомобильная электроника: компенсация температурной зависимости электронных компонентов
Научные исследования: прецизионные измерения в широком диапазоне температур
Промышленная автоматизация: контроль технологических процессов в агрессивных средах

Сравнение ТРА-1 и ТРА-2 с другими типами терморезисторов

Алмазные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2 имеют ряд преимуществ по сравнению с терморезисторами на основе других материалов:

Более широкий рабочий диапазон температур
Высокая стабильность характеристик во времени

Устойчивость к радиации и агрессивным средам
Малая тепловая инерционность
Высокая точность измерений

Однако стоит отметить, что алмазные терморезисторы могут иметь более высокую стоимость по сравнению с традиционными типами. Выбор конкретного типа терморезистора должен основываться на требованиях конкретного применения и экономической целесообразности.

Алмазные терморезисторы ТРА-1, ТРА-2, характеристики и описание

Изолированные герметизированные терморезисторы ТРА-1 и ТРА-2 (технические условия ДИЛС434121 001 ТУ) с отрицательным температурным коэффициентом сопротивления предназначены для работы в электрических цепях постоянного и переменного тока для измерения температуры, скорости потоков жидкости и газа, степени разрежения и для температурной компенсации характеристик элементов электрических цепей.

Рис. 1. Внешний вид и размеры алмазных терморезисторов ТРА-1, ТРА-2.

В качестве термочувствительного элемента в приборе использован монокристалл синтетического алмаза, легированного акцепторными (для ТРА-1) или донорными (для ТРА-2) примесями и имеющего р- или п-проводимость соответственно. Тип и степень легирования определяют характеристики терморезистора. Алмазные терморезисторы отличаются долговременной стабильностью основных параметров и уникально малой тепловой инерционностью, способны работать в агрессивных средах и при повышенной радиации.

Терморезисторы выпускают в миниатюрном стеклянном корпусе с гибкими лужеными выводами (рис. 1). Тип приборов и их основные характеристики указывают на групповой таре — бумажной ленте, на которой их закрепляют.

Основные технические характеристики

Предельные значения сопротивления выпускаемых терморезисторов, кОм, при температуре окружающей среды 25 °С = 0,05-100 000
Допускаемое отклонение сопротивления от номинального*, % — ±5; ±10; ±20

Температурный коэффициент сопротивления, %/К, при температуре окружающей среды 25 °С для ТРА-1 = 0,2 .-2.3, ТРА-2 = 0,55…-6
Коэффициент температурной чувствительности, К, при температуре окружающей среды в пределах 80…600 К для ТРА-1 = 300…2500, ТРА-2 = 600…6000
Максимальная рассеиваемая мощность, мВт — 500
Постоянная времени установления сопротивления, с — <1
Рабочий интервал температуры окружающей среды, °С = -200…+330, тоже в К = 73. -2 = 1500, то же в значениях g = 150
Наибольшее атмосферное давление, Па — 297 200, тожев кГс*см — 3
Наибольшая относительная влажность. %, при температуре окружающей среды 35 °С = 98
Наработка на отказ, ч, не менее = 20000
Срок сохраняемости, лет — 20

Номиналы соответствуют рядам Е24, Е12. Е6 согласно ГОСТ282-67. Приборы выдерживают атмосферные осадки в виде инея и росы. Группа по специальным воздействиям — 4У. Сравнительные характеристики терморезисторов ТРА-1 и ТРА-2 представлены в таблице

Температурную зависимость сопротивления терморезисторов вблизи рабочей точки описывает выражение (формула):

(1)

где R25 — сопротивление прибора при температуре 25 °С (298 К), Ом; В — коэффициент температурной чувствительности, К; Тo = 298 К; Т — температура в К, для которой рассчитывают RT.

В паспорте на полупроводниковый терморезистор часто указывают значение температурного коэффициента сопротивления а, который связан с В зависимостью (формула):

(2)

если а задан в 1/К, а если а задан в %/К, то полученный результат необходимо умножить на 1СГ2. Для вычисления В в формулу подставляют модуль а.

На рис. 2 показана кривая, построенная по формуле (1) для терморезистора ТРА-1 сопротивлением 260 Ом при температуре 25 иС с ТКС=0,78 %/К для температурного интервала 22… 137 °С (295…410 К).

Рис. 2. График 1.

Рис. 3. График 2.

Рис. 4. График 3.

На рис. 3-6 показаны типовые зависимости сопротивления терморезисторов различных номиналов от температуры для группы ТРА-1, а на рис. 7 — для одного из группы ТРА-2.

Терморезисторы предназначены для навесного и объемного монтажа методом пайки или сварки. Изгибание выводов допускается на расстоянии не менее 1,5 мм от корпуса прибора. Радиус изгиба — не менее 1,5 мм.

Рис. 5

Рис. 6. График 4.

Рис. 7. График 5.

Температура жала паяльника не должна быть более 350 °С; время пайки — не более 3 с. Соединение сваркой допускается на расстоянии не менее 3 мм от корпуса.

А. Сорокин.

Преобразователь DC-DC модульный TRACO POWER TRA 1-0511

Линейка

TRA

Основные характеристики

Тип

Преобразователь DC/DC

Принцип действия

Импульсный

Несущая частота ШИМ

100 кГц

Диапазон несущей частоты ШИМ

50 — 120 кГц

Тип стабилизатора напряжения

Электронный

Полная выходная мощность

1 ВА

Тип выходного тока

Постоянный

Входные характеристики

Количество фаз

Номинальное входное напряжение постоянного тока

5 В

Диапазон входного напряжения при работе от сети постоянного тока

4,5 — 5,5 В

Номинальный входной ток (при максимальной нагрузке)

0,24 А

Энергопотребление в режиме простоя, не более

0.15 Вт

Выходные характеристики

Количество выходных каналов

Номинальное выходное напряжение

5 В

Максимальный ток нагрузки, не более

0.2 А

Полярность напряжения

Положительная

КПД при полной нагрузке

84 %

Уровень переменной составляющей на выходе, не более

60 mV p-p

Погрешность стабилизации выходного напряжения

1 %

Максимально допустимая электрическая емкость нагрузки

220 µF

Входные разъемы

Тип входного разъема

Ламели

Выходные разъемы

Тип выходного разъема

Ламели

Защита и фильтрация

Среднее наработки на отказ MTBF

2000 тыс. часов

Класс защиты

Изоляция 1000 В DC

Сопротивление изоляции, не менее

1000 МОм

Защита от короткого замыкания

Есть

Защита от высоковольтных импульсов

Есть

Фильтрация помех

Есть

Защита от перегрузки

Есть

Защита от перегрева

Есть

Защита от понижения напряжения

Есть

Защита от повышения напряжения

Есть

Защита цепи нагрузки

Есть

Защита входной цепи

Есть

Параметры окружающей среды

Рабочий диапазон температуры

от –40°C до +85°C

Рабочий диапазон относительной влажности

от 5% до 95%

Температура хранения

от –50°C до +125°C

Относительная влажность хранения

от 5% до 95%

Физические характеристики

Форм-фактор

Встраиваемый

Способ монтажа

На плату, Пайка

Материал корпуса

Пластик

Охлаждение

Воздушное

Прочие характеристики

Цвет

Черный

Габариты

19.5 x 10.2 x 6.1 мм

Вес нетто

0.0022 кг

Ссылки

Ссылка на описание на сайте производителя

Техническо-распорядительный акт (ТРА) станции — orgperevozok.ru

Техническо-распорядительный акт (ТРА) — это нормативный документ, который устанавливает порядок использования технических средств станции и регламентирует безопасный и беспрепятственный прием, отправление и проследование поездов по станции, безопасность внутристанционной маневровой работы.

ТРА станции разрабатываются по следующим образцам:

Образец 1 приложения № 10 к ПТЭ (далее — Образец 1) — для сортировочных, пассажирских, пассажирских технических, грузовых и участковых железнодорожных станций;

Образец 2 приложения № 10 к ПТЭ (далее — Образец 2) — для промежуточных железнодорожных станций, разъездов, обгонных пунктов и путевых постов.

Для отдельных промежуточных железнодорожных станций в зависимости от характера выполняемых операций и технической оснащенности железнодорожных станций по решению владельца инфраструктуры, владельца железнодорожного пути необщего пользования допускается составление ТРА станции по Образцу 1.

ТРА разрабатывается и подписывается начальником станции. Разработанный ТРА проверяется ревизором движения хозяйства перевозок (далее — Ревизор движения), после чего согласовывается:

Для станций, разработанных по Образцу 1 — начальником Центра организации работы железнодорожных станций (далее — Центра), руководителями причастных структурных подразделений региональных дирекций функциональных филиалов ОАО «РЖД» (например: начальниками эксплуатационных локомотивных депо, начальниками вагонных эксплуатационных депо, начальниками дистанции пути (дистанции инфраструктуры), начальниками региональных участков дирекций пассажирских обустройств и др.

Для станций, разработанных по Образцу 2 — руководителями причастных структурных подразделений региональных дирекций функциональных филиалов ОАО «РЖД» (например: начальниками дистанции пути (дистанции инфраструктуры), начальниками регионального центра связи и др.).

ТРА утверждается:

а) для станций, разработанных по Образцу 1 — начальником дирекции управления движением;

б) для станций, разработанных по Образцу 2 — начальником Центра.

ТРА станции состоит из 3-х разделов:

1 раздел — общие сведения о станции

1.1 Характер работы станции

1.2. Прилегающие к станции перегоны, основные средства сигнализации и связи при движении поездов и порядок их использования для организации движения (перегоны в четном и нечетном направлениях; внутриузловые соединения)

1.3 Перечень ж.д. путей необщего пользования и места их примыкания к путям станции

1.4 Места примыкания путей, переданных в ведение других служб и организаций ж.д. ОАО «РЖД» с указанием границ между ними и путями станции

1.5 Ведомость парков и путей, имеющихся на станции

1.6 Пути, (из числа перечисленных в предыдущем пункте), выделенные для приема, отправления и пропуска поездов с «ВМ», негабаритными грузами и для стоянки вагонов с грузами «ВМ» (в этом пункте указывается порядок действий при обслуживании таких поездов, закрепления их на путях станции, положение стрелок, ограждающих пути, где находятся поезда с опасными грузами, даны места, куда следует отправлять такие поезда при возникновении аварийных ситуаций, описаны пути, на которые разрешен прием таких поездов)

1.7. Стрелочное хозяйство станции (централизированные и нецентрализированные стрелочные переводы, нормальное положение стрелок, система их запирания, освещение стрелок, у кого хранятся ключи от них, порядок перевода стрелок при приеме-отправлении поездов и маневровой работе, и стрелочные переводы, не обслуживаемые дежурным стрелочного поста)

1.8. Места хранения инвентаря, применяемого при нарушении нормальной работы устройств СЦБ

1.9 Наличие на станционных путях специальных устройств для закрепления вагонов

1.10 Районы работы операторов постов централизации, сигналистов и дежурных стрелочных постов (а также в чьем оперативном подчинении находится работник, и основные обязанности, возложенные на работника)

1.11. Пассажирские и грузовые устройства, имеющиеся на станции

1.12. Освещение станционных путей

1.13. Связь распорядительных пунктов по приему и отправлению поездов и производству маневров

1.14. Места нахождения восстановительных и пожарных поездов, аварийноспасательных команд, летучек связи и бригад контактной сети, медицинских и ветеринарных пунктов, полиции

2 раздел — прием и отправление поездов

2.1 Разграничение районов управления и обязанностей каждого дежурного по станции, посту или парку, основные обязанности операторов при ДСП и ДСПП

2.2 Наличие переездов на станции и прилегающих перегонах и порядок действий при неисправности переездной сигнализации (наименование переездов, тип переездной сигнализации, порядок действий ДСП при неисправности переездной сигнализации)

2.3 Порядок прекращения маневров перед приемом или отправлением поезда

2.4 Порядок проверки свободности путей (при наличии и нормальном действии электрической изоляции путей и при ее отсутствии или при нарушении нормального действия этих устройств

2.5 Время, необходимое для приготовления маршрута приема (отправления) поездов при нарушении нормального действия устройств СЦБ

2.6 Как убеждается ДСП в правильности приготовления маршрутов приема, отправления поездов при нормальном и при нарушении нормального действия устройств СЦБ

2.7 Нецентрализованные стрелки, положение и исправность которых разрешается проверять не для каждого поезда (например, при вступлении на смену)

2.8 Порядок пропуска поездов и маневровых составов по путям, расположенным между пассажирским зданием и стоящим на станции пассажирским поездом, если нет переходного моста или тоннеля

2.9 Порядок встречи прибывающих на станцию поездов ДСП или дежурным стрелочных постов и операторами постов централизации

2.10 Порядок убеждения ДСП в прибытии поезда в полном составе

2.11 Порядок приема на станцию поездов при запрещающем показании входного (маршрутного) светофора и по неправильному пути (при отсутствии на этом пути входного светофора)

2.12 Дополнительные меры по обеспечению безопасности стоянки пассажирских, поездов

2.13 Условия приема поездов на станции с перегона, имеющего затяжной спуск (подъем)

2.14 Поезда, провожаемые дежурными стрелочных постов, сигналистами, операторами постов ЭЦ

2.15 Порядок отправления со станции поездов при запрещающем показании выходных светофоров и с путей, где нет выходных светофоров

2.16 Порядок выдачи предупреждений об особых условиях следования отдельных поездов

2.17 Дополнительные указания по приему и отправлению поездов

3 раздел — организация маневровой работы

3.1 Кто распоряжается маневровой работой на станции

3.2 Специализация районов маневровой работы

3.3. Использование при маневрах устройств радиосвязи и парковой связи (вид связи и работники, которым предоставляется право пользоваться устройствами и характер передаваемых ими указаний и сообщений) при нормальной работе связи и при отказе средств связи руководителя маневров с машинистом локомотива

3.4 Основные особенности производства маневров в каждом районе

3.5. Меры безопасности при работе в одном маневровом районе двух и более маневровых локомотивов

3.6. Меры безопасности по предупреждению случаев выхода подвижного состава за границу полезной длины в противоположном конце путей, ухода вагонов на маршруты следования поездов и в другие районы, столкновений маневрового состава в стрелочной горловине

3.7. Порядок перестановки маневровых составов из парка в парк.

Приложения к ТРА станции:

1. Масштабный план железнодорожной станции.

2. Схематический план железнодорожной станции.

3. Продольные профили железнодорожных путей железнодорожной станции.

4. Инструкция о порядке пользования устройствами СЦБ (при их наличии).

5. Выкопировка из схемы питания и секционирования контактной сети (для железнодорожных станций, расположенных на электрифицированных участках). При отсутствии контактной сети прилагается схема продольного энергоснабжения устройств СЦБ.

6. Ведомость железнодорожных путей необщего пользования.

7. Инструкция о порядке работы с вагонами, загруженными опасными грузами класса 1 (взрывчатыми материалами).

8. Инструкция по работе сортировочной горки (при ее наличии).

9. Ведомость занятия железнодорожных приемо-отправочных железнодорожных путей пассажирскими, почтово-багажными и грузопассажирскими поездами. Составляется ведомость пассажирских, сортировочных, грузовых и участковых железнодорожных станций (кроме тех, где пассажирские поезда следуют по соответствующим главным железнодорожным путям без захода на другие приемоотправочные железнодорожные пути), железнодорожных станций оборота пассажирских, пригородных составов и моторвагонных поездов, а также для тех промежуточных железнодорожных станций, где графиком движения предусматривается обгон или скрещение пассажирских, почтово-багажных и грузопассажирских поездов с другими поездами тех же категорий.

10. Регламент переговоров по радиосвязи при маневровой работе.

TRA-1 | SFERE | UNIS Group

Поле Установки Cookie

Параметры конфиденциальности

Определите, какие файлы cookie вы хотели бы разрешить. Эти параметры можно изменить в любое время. Важные и функциональные файлы cookie не собирают персональные данные и помогают улучшить веб-сайт. При отказе от файлов cookie некоторые функции могут оказаться недоступными. Для удаления файлов cookie обратитесь к справочному разделу в своем браузере. Укажите ниже, какие файлы cookie вы хотели бы разрешить или отключить:

Этот веб-сайт будет

Основной: Запомните настройки для разрешения использовать файлы coоkies
Основной: Разрешить все сессионные coоkies
Основной: Соберите информацию, которую вы вводите в контактную форму для рассылки и другие формы на всех страницах
Основной: Следите за тем, что вы помещаете в корзину
Основной: Подтверждайте, что именно вы вошли в учетную запись Пользователя
Основной: Запомните какой язык вы выбрали

Этот сайт не будет

Помните Ваш логин и пароль
Функционал: Запомните настройки для социальных сетей
Функционал: Запомните выбранный регион и страну
Аналитика: Следите за тем, какие страницы вы посетили и в каких взаимодействиях участвовали
Аналитика: Следите за своим местонахождением и регионом на основе Вашего IP-номера
Аналитика: Следите за тем, сколько времени вы проводите на каждой странице
Аналитика: Улучшайте качество данных о статистических функциях
Реклама: Адаптируйте информацию и рекламу в соответствии с вашими интересами, например, на основе rонтента, который Вы посетили раньше. (В настоящее время мы не используем тагетирование или целевые файлы cookie)
Реклама: Собирайте личную информацию такую как имя и местонахождение

Этот веб-сайт будет

Основной: Запомните настройки для разрешения использовать файлы coоkies
Основной: Разрешить все сессионные coоkies
Основной: Соберите информацию, которую вы вводите в контактную форму для рассылки и другие формы на всех страницах
Основной: Следите за тем, что вы помещаете в корзину
Основной: Подтверждайте, что именно вы вошли в учетную запись Пользователя
Основной: Запомните какой язык вы выбрали
Функционал: Запомните настройки для социальных сетей
Функционал: Запомните выбранный регион и страну

Этот сайт не будет

Аналитика: Следите за тем, какие страницы вы посетили и в каких взаимодействиях участвовали
Аналитика: Следите за своим местонахождением и регионом на основе Вашего IP-номера
Аналитика: Следите за тем, сколько времени вы проводите на каждой странице
Аналитика: Улучшайте качество данных о статистических функциях
Реклама: Адаптируйте информацию и рекламу в соответствии с вашими интересами, например, на основе rонтента, который Вы посетили раньше. (В настоящее время мы не используем тагетирование или целевые файлы cookie)
Реклама: Собирайте личную информацию такую как имя и местонахождение

Этот веб-сайт будет

Основной: Запомните настройки для разрешения использовать файлы coоkies
Основной: Разрешить все сессионные coоkies
Основной: Соберите информацию, которую вы вводите в контактную форму для рассылки и другие формы на всех страницах
Основной: Следите за тем, что вы помещаете в корзину
Основной: Подтверждайте, что именно вы вошли в учетную запись Пользователя
Основной: Запомните какой язык вы выбрали
Функционал: Запомните настройки для социальных сетей
Функционал: Запомните выбранный регион и страну
Аналитика: Следите за тем, какие страницы вы посетили и в каких взаимодействиях участвовали
Аналитика: Следите за своим местонахождением и регионом на основе Вашего IP-номера
Аналитика: Следите за тем, сколько времени вы проводите на каждой странице
Аналитика: Улучшайте качество данных о статистических функциях

Этот сайт не будет

Реклама: Адаптируйте информацию и рекламу в соответствии с вашими интересами, например, на основе rонтента, который Вы посетили раньше. (В настоящее время мы не используем тагетирование или целевые файлы cookie)
Реклама: Собирайте личную информацию такую как имя и местонахождение

Этот веб-сайт будет

Функционал: Запомните настройки для социальных сетей
Функционал: Запомните выбранный регион и страну
Аналитика: Следите за тем, какие страницы вы посетили и в каких взаимодействиях участвовали
Аналитика: Следите за своим местонахождением и регионом на основе Вашего IP-номера
Аналитика: Следите за тем, сколько времени вы проводите на каждой странице
Аналитика: Улучшайте качество данных о статистических функциях
Реклама: Адаптируйте информацию и рекламу в соответствии с вашими интересами, например, на основе rонтента, который Вы посетили раньше. (В настоящее время мы не используем тагетирование или целевые файлы cookie)
Реклама: Собирайте личную информацию такую как имя и местонахождение

Этот сайт не будет

Помните Ваш логин и пароль

FESTOOL 203813 — MINI-Systainer T-LOC SYS-MINI 1 TL TRA

https://www.misterworker.com/ru/festool/mini-systainer-t-loc-sys-mini-1-tl-tra/46675.html



Сохранить 9%

Mister Worker™ Price

₽ 1,561 НДС Не включен?

List Price

₽ 1,717 Сохранить 9%

Mister Worker™ Price

₽ 1,561 НДС Не включен? Сохранить 9%

Mister Worker™ Price

₽ 1,561 НДС Не включен?

List Price

₽ 1,717 Сохранить 9%

Mister Worker™ Price

₽ 1,561 НДС Не включен?

EAN: 4014549319970

Organisation with transparency. Main areas of use * Neat and secure storage of small parts and hand-held tools * Permanent organisation, clear overview, flexible modules * Saves significant time,…

Читать большеarrow_downward

Имейте в виду что товары Festool не могут быть отправлены в США

Organisation with transparency.

Main areas of use
* Neat and secure storage of small parts and hand-held tools
* Permanent organisation, clear overview, flexible modules
* Saves significant time, effort, movement, expense
* Simple, compact transport
* Provides a professional appearance to customers
* for clear and structured arrangement of small parts and hand-held tools
* can be combined with SYS-MINI 1 and 3 TL
* cannot be connected to Systainer³, Systainer T-LOC or Systainer classic
Items included: transparent cover

Dimensions (L x W x H): 265 x 171 x 71 mm
Internal dimensions (L x W x H): 255 x 155 x 53 mm
Weight: 0.4 kg

Organisation with transparency.

Рецензии MINI-Systainer T-LOC SYS-MINI 1 TL TRA

В настоящее время нет рецензий о продукте MINI-Systainer T-LOC SYS-MINI 1 TL TRA

Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R

Мышиные моноклональные IgM-антитела против TRA-1-60 человека, резуса, кролика (подокаликсин)

Обзор

Антитело TRA-1-60R реагирует с TRA-1-60 (подокаликсин), специфическим для плюрипотентных стволовых клеток белком> 200 кДа, экспрессируемым на поверхности недифференцированных эмбриональных стволовых (ES) человека и индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, эмбриональных клетки карциномы (EC) и клетки эмбрионального зародыша (EG), а также линии ES-клеток макака-резуса.Растворимая форма TRA-1-60 была обнаружена в сыворотке крови пациентов с эмбриональной карциномой. Эпитоп, который теряется при дифференцировке клеток, содержит сиаловую кислоту и связан с трансмембранным белком с большой молекулярной массой, называемым подокаликсином. Несмотря на то, что эпитоп, распознаваемый антителом TRA-1-60R, сиалилирован, он устойчив к лечению нейраминидазой.

Этот клон антитела был проверен для мечения человеческих ES- и iPS-клеток, выращенных в TeSR ™ -E8 ™ (Каталожный № 05940), mTeSR ™ 1 (Каталожный № 85850) и TeSR ™ 2 (Каталожный № 05860), а также для оценки чистоты. клеток, выделенных с помощью наборов EasySep ™, включая набор для положительной селекции EasySep ™ Human ES / iPS Cell TRA-1-60 (№ по каталогу 18166; может наблюдаться частичное блокирование) и набор для позитивной селекции EasySep ™ hESC / hiPSC SSEA-4 (№ по каталогу 18165).

Alexa Fluor 488, биотин, ПЭ, неконъюгированный

Человек, примат, не являющийся человеком, прочее

Выделение клеток, проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммунофлуоресценция, иммунопреципитация, вестерн-блоттинг

Научные ресурсы

Документация по продукту

Тип документа	Название продукта	Каталожный №	№ лота	Язык
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R	Каталожный номер 60064	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, Alexa Fluor® 488	Каталожный номер 60064AD, 60064AD.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, биотин	Каталожный номер 60064BT	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, PE	Каталожный номер 60064PE, 60064PE.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R	Каталожный номер 60064	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, Alexa Fluor® 488	Каталожный номер 60064AD, 60064AD.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, биотин	Каталожный номер 60064BT	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, PE	Каталожный номер 60064PE, 60064PE.1	Лот № . Все	Язык Английский

Учебные материалы (3)

Брошюра

Стандартизированные растворы для плюрипотентных стволовых клеток мышей

Брошюра

Надежные антитела для ваших исследований

Брошюра

Продукты для плюрипотентных стволовых клеток человека

Приложения для продуктов

Этот продукт разработан для использования в следующих областях исследований как часть выделенного этапа (этапов) рабочего процесса.Изучите эти рабочие процессы, чтобы узнать больше о других продуктах, которые мы предлагаем для поддержки каждой области исследований.

Область исследования

Этапы рабочего процесса

Данные и публикации

Данные

Рисунок 1. Данные для Alexa Fluor® 488-Conjugated

(A) Анализ проточной цитометрии ES-клеток человека (закрашенная гистограмма) или клеток фибросаркомы HT1080 (отрицательный контроль, гистограмма пунктирной линии), меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, Alexa Fluor® 488 Показано мечение человеческих ES-клеток мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, Alexa Fluor® 488 (каталожный № 60069AD, гистограмма сплошной линией).
(B) ES-клетки человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах с покрытием BD Matrigel ™, затем фиксировали и окрашивали антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, Alexa Fluor® 488.На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, Alexa Fluor® 488.
(C) Анализ проточной цитометрии человеческих iPS-клеток, меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1 -60R, Alexa Fluor® 488 (закрашенная гистограмма) или мышиный IgM, контрольное антитело изотипа каппа, клон MM-30, Alexa Fluor® 488 (открытая гистограмма).
(D) Клетки iPS человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах с покрытием BD Matrigel ™, затем фиксировали и окрашивали антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, Alexa Fluor® 488.На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, Alexa Fluor® 488.

Рис. 2. Данные для биотин-конъюгированного

Анализ проточной цитометрии ES-клеток человека (закрашенная гистограмма) или клеток фибросаркомы HT1080 (отрицательный контроль, гистограмма пунктирной линии), меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, биотином с последующим добавлением стрептавидина (SAV) APC (заполненная гистограмма). Мечение человеческих ES-клеток мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа-биотина с последующим введением SAV APC показано (гистограмма сплошной линией).

Рисунок 3. Данные для PE-конъюгированного

(A) Анализ проточной цитометрии эмбриональных стволовых клеток человека (ES) (закрашенная гистограмма) или клеток фибросаркомы HT1080 (отрицательный контроль, гистограмма пунктирной линии), меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, ЧП. Показано мечение человеческих ES-клеток мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE (каталожный № 60069PE, гистограмма сплошной линией).
(B) ES-клетки человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах, покрытых BD Matrigel ™, затем фиксировали и окрашивали антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, PE.На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE.
(C) Анализ проточной цитометрии iPS-клеток человека, меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, PE (закрашенная гистограмма) или мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE (открытая гистограмма).
(D) Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток, выделенных с помощью набора для положительной селекции EasySep ™ Human ES / iPS Cell TRA-1-60 из смешанной популяции ES-клеток и клеток фибросаркомы HT1080 и меченных антителом против человеческого TRA-1- 60 Антитело, клон TRA-1-60R, PE.Гистограммы показывают маркировку исходной популяции, содержащей ~ 5% ES-клеток (Start), и изолированных клеток (изолированные). Мечение мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE показано на нижней панели (открытая гистограмма).

Рисунок 4. Данные для несопряженного

(A) Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток (закрашенная гистограмма) или клеток фибросаркомы HT1080 (отрицательный контроль, гистограмма пунктирной линии), меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, а затем козьим антигеном. -мышь IgG, FITC.Мечение человеческих ES-клеток мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30 (№ по каталогу 60069) с последующим введением козьего антимышиного IgG, FITC показано (гистограмма сплошной линией).
(B) ES-клетки человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах с покрытием BD Matrigel ™, затем фиксировали и окрашивали антителом против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R, а затем козьими антимышиными антителами. IgG, FITC. На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клон MM-30, за которым следует козий антимышиный IgG, FITC.
(C) Анализ проточной цитометрии iPS-клеток человека, меченных антителом против человеческого TRA-1-60, клоном TRA-1-60R, за которым следует козий антимышиный IgG, FITC (закрашенная гистограмма) или мышиный IgM, контроль изотипа каппа Антитело, клон MM-30, за которым следует козий антимышиный IgG, FITC (открытая гистограмма).
(D) Вестерн-блот-анализ денатурированных / восстановленных клеточных лизатов ES-клеток человека (дорожка 1) или клеток фибросаркомы HT1080 (отрицательный контроль, дорожка 2) с использованием антител против TRA-1-60 человека, клона TRA-1-60R.

Публикации (1)

Смерть клеток и болезни 2013 Ингибирование CaMKII исправляет аритмический фенотип в индивидуальной для пациента модели катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии.Di Pasquale E et al.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) предлагают уникальную возможность для исследований развития, моделирования заболеваний и подходов к регенеративной медицине у людей.Целью нашего исследования было создание in vitro «индивидуальной для пациента клеточной системы», которая могла бы облегчить скрининг новых терапевтических молекул для лечения катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии (CPVT), наследственной формы фатальной аритмии. Здесь мы сообщаем о разработке сердечной модели CPVT посредством генерации iPSC от пациента CPVT, несущего гетерозиготную мутацию в гене сердечного рианодинового рецептора (RyR2), и их последующей дифференцировки в кардиомиоциты (CMs).Цельноклеточные патч-зажим и внутриклеточные электрические записи спонтанно бьющихся клеток выявили наличие отложенных постдеполяризаций (DAD) в CPVT-CM как в условиях покоя, так и после -адренергической стимуляции, что напоминает сердечный фенотип пациентов. . Кроме того, лечение KN-93 (2- [N- (2-гидроксиэтил)] — N- (4-метоксибензолсульфонил)] амино-N- (4-хлорциннамил) -N-метилбензиламин), антиаритмическим препаратом, который ингибирует Ca (2+ ) / кальмодулин-зависимая серин-треониновая протеинкиназа II (CaMKII), резко снизила присутствие DAD в CVPT-CMs, спасая аритмический фенотип, вызванный катехоламинергическим стрессом.Кроме того, измерения внутриклеточных переходных процессов кальция на трехмерных пульсирующих кластерах с помощью оптического картирования с высоким разрешением показали, что в кластерах CPVT развиваются множественные переходные процессы кальция, тогда как в кластерах дикого типа были обнаружены только одиночные инициирования. Такая нестабильность усиливается в присутствии изопротеренола и ослабляется KN-93. Как видно на примере мышей CPVT с RyR2, антиаритмический эффект KN-93 подтвержден в этих сердечных клетках, полученных из ИПСК человека, что подтверждает роль этой системы in vitro для скрининга лекарств и оптимизации стратегий клинического лечения.

Просмотреть все публикации

Юридическое заявление:

Alexa Fluor является зарегистрированным товарным знаком Life Technologies Corporation. Антитела, конъюгированные с Alexa Fluor®, лицензированы только для внутреннего исследовательского использования, и продажа прямо обусловлена тем, что покупатель не использует антитела для производства, выполнения услуг или медицинских тестов или иного получения дохода.По вопросам, не связанным с исследованиями, обращайтесь в Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA USA, или по адресу [email protected].

Заявление о качестве:

ПРОДУКТЫ ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ТОЛЬКО ДЛЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЮДЕЙ ИЛИ ЖИВОТНЫХ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЙ, ЕСЛИ НЕ УКАЗАНО ИНОЕ. ДЛЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ О КАЧЕСТВЕ В STEMCELL, ОБРАТИТЕСЬ К WWW.STEMCELL.COM/COMPLIANCE.

Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81

Мышиные моноклональные IgM-антитела против человека, крысы, резуса TRA181

Обзор

Антитело TRA-1-81 реагирует с углеводным эпитопом на TRA-1-81, высокомолекулярном (> 200 кДа) гликопротеине, экспрессирующемся на поверхности эмбриональной карциномы человека (ЭК), эмбрионального зародыша (EG), эмбрионального стволовые (ES) и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, а также линии ES-клеток макака-резуса и крысы.Никакой иммунореактивности не наблюдается с мышиными клетками EC, EG, ES или iPS. Эпитоп антитела TRA-1-81 связан с кератансульфатированным трансмембранным белком, идентифицированным как подокаликсин, и устойчив к лечению нейраминидазой.

Alexa Fluor 488, APC, PE, несопряженный

Человек, крыса, примат, не являющийся человеком

ELISA, проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, иммунопреципитация, вестерн-блоттинг

Научные ресурсы

Документация по продукту

Тип документа	Название продукта	Каталожный №	№ лота	Язык
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81	Каталожный номер 60065	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, Alexa Fluor® 488	Каталожный номер 60065AD, 60065AD.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, APC	Каталожный номер 60065АЗ, 60065АЗ.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Информационный лист продукта	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, PE	Каталожный номер 60065PE, 60065PE.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81	Каталожный номер 60065	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, Alexa Fluor® 488	Каталожный номер 60065AD, 60065AD.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, APC	Каталожный номер 60065АЗ, 60065АЗ.1	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности 1	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, PE	Каталожный номер 60065PE	Лот № . Все	Язык Английский
Тип документа Паспорт безопасности 2	Название продукта Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, PE	Каталожный номер 60065PE, 60065PE.1	Лот № . Все	Язык Английский

Учебные материалы (3)

Брошюра

Надежные антитела для ваших исследований

Брошюра

Продукты для плюрипотентных стволовых клеток человека

Брошюра

Стандартизированные растворы для плюрипотентных стволовых клеток мышей

Приложения для продуктов

Область исследования

Этапы рабочего процесса

Данные и публикации

Данные

Рисунок 1. Данные для Alexa Fluor® 488-Conjugated

Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клоном TRA-1-81, Alexa Fluor® 488 (закрашенная гистограмма) или мышиным IgM, антителом для контроля изотипа каппа, клоном MM-30, Alexa Fluor® 488 (Каталожный № 60069AD) (сплошная гистограмма).

Рисунок 2. Данные для APC-конъюгированного

Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клоном TRA-1-81, APC (закрашенная гистограмма) или мышиным IgM, контрольным антителом изотипа APC каппа (сплошная гистограмма).

Рисунок 3. Данные для PE-конъюгированного

(A) Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клоном TRA-1-81, PE (закрашенная гистограмма) или мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE (Каталожный № 60069PE) (гистограмма сплошной линией). (B) ES-клетки человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах, покрытых Corning® Matrigel®, затем фиксировали и метили антителом против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, PE. На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE.(C) Анализ проточной цитометрии iPS-клеток человека, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клоном TRA-1-81, PE (закрашенная гистограмма) или мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клоном MM-30, PE ( гистограмма сплошной линией).

Рисунок 4. Данные для несопряженного

(A) Анализ проточной цитометрии человеческих ES-клеток, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клоном TRA-1-81, за которым следует козий антимышиный IgM, FITC (закрашенная гистограмма) или мышиный IgM, изотип каппа Контрольное антитело, клон MM-30 (№ по каталогу 60069), за которым следует козий антимышиный IgM, FITC (сплошная гистограмма).(B) ES-клетки человека культивировали в mTeSR ™ 1 на предметных стеклах, покрытых Corning® Matrigel®, затем фиксировали и метили анти-человеческим TRA-1-81, клоном TRA-1-81, а затем козьим антимышиным IgG. , FITC. На вставке показаны клетки, меченные мышиным IgM, контрольным антителом изотипа каппа, клон MM-30, за которым следует козий антимышиный IgG, FITC. (C) Анализ проточной цитометрии iPS-клеток человека, меченных антителом против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81, с последующим козьим антителом против мышиного IgG (H + L), поликлональным, FITC (Каталожный № 60138FI ) (заполненная гистограмма) или мышиный IgM, контрольное антитело изотипа каппа, клон MM-30, за которым следует козье антитело против мышиного IgG (H + L), поликлональное, FITC (сплошная гистограмма).(D) Вестерн-блот-анализ денатурированных / восстановленных клеточных лизатов ES-клеток человека (дорожка 1) или клеток фибросаркомы HT1080 (дорожка 2) с использованием антител против TRA181 человека, клона TRA-1-81.

Юридическое заявление:

Заявление о качестве:

специфичность связывания маркерных антител Tra-1-60 и Tra-1-81 выявляет новый ассоциированный с плюрипотентностью лактозаминный эпитоп типа 1 | Гликобиология

Аннотация

Экспрессия эпитопов, распознаваемых моноклональными антителами Tra-1-60 и Tra-1-81, обычно используется для оценки статуса плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS).Хотя известно, что эпитопы, распознаваемые Tra-1-60 и Tra-1-81, являются углеводами, точная молекулярная идентичность этих эпитопов неясна. Анализ гликанового массива с более чем 500 олигосахаридными структурами выявил специфическое связывание Tra-1-60 и Tra-1-81 с двумя молекулами, содержащими терминальный лактозамин 1-го типа: Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc и Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3GlcNAcβ1-3) Galβ1-4Glc. Дисахарида типа 1 самого по себе было недостаточно для связывания, что указывает на то, что полный эпитоп требует расширенной структуры тетрасахарида, где дисахарид типа 1 является β1,3-связанным с лактозамином типа 2.Наш масс-спектрометрический анализ, дополненный перевариванием гликозидазой hESC O -гликанов, показал присутствие удлиненного тетрасахаридного эпитопа на O -гликане с вероятной структурой Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6 (Galcβ1-3) Galc. Таким образом, настоящие данные показывают, что антитела к маркеру плюрипотентности Tra-1-60 и Tra-1-81 распознают минимальный эпитоп Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, который присутствует в hESC как часть муцинового типа O . -гликановая структура.Точная молекулярная идентичность Tra-1-60 и Tra-1-81 важна для разработки улучшенных инструментов для характеристики плюрипотентного фенотипа.

Введение

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) из внутренней клеточной массы бластоцисты и недавно описанные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS), полученные из соматических клеток, перепрограммированные из соматических клеток, обладают общим свойством способности неограниченно расти при сохранении плюрипотентности ( Thomson et al.1998; Takahashi et al. 2007). На этих типах клеток проводятся обширные исследования для разработки моделей заболеваний, методов скрининга лекарств и, в конечном итоге, регенеративных методов лечения. Эмбриональные стволовые клетки экспрессируют определенные поверхностные маркеры, которые, как считается, связаны с плюрипотентностью и широко используются для характеристики клеток. Эти маркеры включают белковые антигены CD9, Thy1 (CD90), тканеспецифическую щелочную фосфатазу (Tra-2-49 и Tra-2-54), лейкоцитарный антиген человека класса 1 и подокаликсин (GCTM2), стадию гликосфинголипидных антигенов глобосерии. -специфический эмбриональный антиген (SSEA) -3 и SSEA-4, а также углеводные эпитопы, распознаваемые моноклональными антителами Tra-1-60 и Tra-1-81 (International Stem Cell Initiative 2007; Wright and Andrews 2009).Многие из маркерных антител были первоначально получены против клеток эмбриональной карциномы, которые использовались в качестве модели для плюрипотентных клеток человека до того, как были введены чЭСК (Wright and Andrews 2009). Клетки iPS экспрессируют многие из одних и тех же антигенов, по крайней мере SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 и тканеспецифическую щелочную фосфатазу (Yamanaka 2009).

Многие антитела к маркерам стволовых клеток, такие как SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81, распознают углеводные эпитопы (Lanctot et al.2007; Райт и Эндрюс 2009). Мы и другие показали, что эмбриональные стволовые клетки обнаруживают характерный профиль гликозилирования, который отличает их от дифференцированных типов клеток (Draper et al. 2002; Venable et al. 2005; Wearne et al. 2006, 2008; Satomaa et al. 2009). Примеры типичных особенностей гликозилирования hESCs, выявленных структурным анализом, включают эпитопы Lewis x и H типа 2 на N -гликанах (Satomaa et al. 2009). Было высказано предположение, что антитела к маркерам плюрипотентности Tra-1-60 и Tra-1-81 распознают эпитопы кератансульфата на подокаликсине (Badcock et al.1999; Schopperle and DeWolf 2007).

В настоящем исследовании мы провели масс-спектрометрический анализ hESC O -гликанов, дополненных специфическим расщеплением экзогликозидазой. Чтобы получить больше информации о гликозилировании, связанном с плюрипотентностью, специфичность антител Tra-1-60 и Tra-1-81 была охарактеризована на большом массиве гликанов, разработанном Консорциумом по функциональной гликомике. Наши данные показывают, что антитела к маркерам эмбриональных стволовых клеток Tra-1-60 и Tra-1-81 распознают специфический эпитоп лактозамина 1-го типа, который присутствует в hESC как часть структуры гликана O -муцина типа.

Результаты

Моноклональные антитела Tra-1-60 и Tra-1-81 окрашивают недифференцированные hESC чувствительным к β1,3-галактозидазе способом

hESC FES29 обрабатывали β1,3-галактозидазой ( Streptococcus pneumoniae ), β1,4-галактозидазой ( Xanthomonas manihotis ) или только буфером, окрашивали антителами Tra-1-60 и Tra-1-81 и анализировали. методом проточной цитометрии (рис. 1). β1,4-галактозидаза не влияла на связывание антител, тогда как обработка β1,3-галактозидазой резко снижала связывание как Tra-1-60, так и Tra-1-81, предполагая, что терминальная β1,3-связанная галактоза является существенная часть эпитопа.Активность гликозидазы контролировали с использованием соответствующих олигосахаридов в качестве субстратов, как описано в дополнительных данных.

Рис. 1.

Недифференцированные hESC окрашиваются Tra-1-60 и Tra-1-81 чувствительным к β1,3-галактозидазе способом. hESC обрабатывали β1,3-галактозидазой ( B и E ), β1,4-галактозидазой ( C и F ) или только буфером ( A и D ), окрашивая Tra- 1-60 (A – C) и Tra-1-81 (D – F) и проанализированы методом проточной цитометрии.Закрашенные красные гистограммы представляют положительно окрашенные клетки. Закрашенные серые гистограммы представляют клетки, окрашенные только вторичным антителом.

Рис. 1.

Моноклональные антитела Tra-1-60 и Tra-1-81 специфически связываются с эпитопом лактозамина 1 типа

Специфичность связывания гликанов Tra-1-60 и Tra-1-81 была протестирована в сравнении с версией 4.2 гликанового массива Консорциума по функциональным гликомикам. Среди более чем 500 олигосахаридных лигандов, ковалентно иммобилизованных на стекле, Tra-1-60 и Tra-1-81 специфически связываются с Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc и Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3GlcNAβ) -4Glc (рисунок 2, таблица I).Средние значения RFU и стандартные отклонения 6 напечатанных пятен показаны в таблице I. Нерелевантный мышиный иммуноглобулин M (IgM) использовали в качестве контроля, чтобы показать, что вторичное антитело само по себе не связывает матрицу. Полные результаты массива представлены в дополнительных данных. Массив анализировали при 25 и 100 мкг / мл антител; 25 мкг / мл было достаточно для насыщения связывания. Несвязывающие структуры, относящиеся к связывающим структурам, включают Galβ1-3GlcNAc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAc, Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, Fuu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, Fucalβ1-4GlcNAc, Fucalβ1-4GlcNAc, Fucα1-4GlcNAc, Fu 4GlcNAc и Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc (Таблица I).Можно сделать вывод, что минимальным связывающим эпитопом для моноклональных антител Tra-1-60 и Tra-1-81 является Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, где требуется β1,3-связь между невосстанавливающим концом галактозы и N -ацетилглюкозамин и β1,4-связь необходима между восстанавливающим концом галактозы и N -ацетилглюкозамином. N -ацетильная группа восстанавливающего конца N -ацетилглюкозамин является необходимой, поскольку идентичная структура с восстанавливающим концом глюкоза не связывалась.α2,3-Сиалирование или α1,4-фукозилирование структуры аннулировали связывание. Оба антитела продемонстрировали сильное связывание с одними и теми же двумя гликанами с минимальным фоновым связыванием, что указывает на то, что связывание является специфическим для эпитопа лактозамина типа 1 с расширенным типом.

Таблица I. Связывание

Tra-1-60 и Tra-1-81 (25 мкг / мл) с выбранными гликановыми структурами в Консорциуме по функциональному гликановому массиву гликанов

Структура .	РФУ Тра-1-60 (СД) .	РФУ Тра-1-81 (СД) .	RFU контроль Ab (SD) .
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	15 009 (1258)	21016 (2430)	3 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAβ1-6 (Galβ1-4GlcNAβ1-6 ) Galβ1-4Glc	39371 (8151)	44399 (9962)	3 (3)
Galβ1-3GlcNAc	12 (10)	6 (12)	4 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc	6 (9)	2 (2)	4 (5)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	7 (9)	5 (3)	5 (8)
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	4 (3)	0 (7)	5 (10)
Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAc	6 (10)	51 (144)	1 (5)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc	5 (5) 90 039	3 (11)	4 (5)

Структура .	РФУ Тра-1-60 (СД) .	РФУ Тра-1-81 (СД) .	RFU контроль Ab (SD) .
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	15 009 (1258)	21016 (2430)	3 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAβ1-6 (Galβ1-4GlcNAβ1-6 ) Galβ1-4Glc	39371 (8151)	44399 (9962)	3 (3)
Galβ1-3GlcNAc	12 (10)	6 (12)	4 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc	6 (9)	2 (2)	4 (5)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	7 (9)	5 (3)	5 (8)
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	4 (3)	0 (7)	5 (10)
Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAc	6 (10)	51 (144)	1 (5)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc	5 (5) 90 039	3 (11)	4 (5)

Таблица I.

Связывание Tra-1-60 и Tra-1-81 (25 мкг / мл) с выбранными гликановыми структурами в Консорциуме по функциональному гликановому массиву гликанов

Структура .	РФУ Тра-1-60 (СД) .	РФУ Тра-1-81 (СД) .	RFU контроль Ab (SD) .
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	15 009 (1258)	21016 (2430)	3 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAβ1-6 (Galβ1-4GlcNAβ1-6 ) Galβ1-4Glc	39371 (8151)	44399 (9962)	3 (3)
Galβ1-3GlcNAc	12 (10)	6 (12)	4 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc	6 (9)	2 (2)	4 (5)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	7 (9)	5 (3)	5 (8)
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	4 (3)	0 (7)	5 (10)
Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAc	6 (10)	51 (144)	1 (5)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc	5 (5) 90 039	3 (11)	4 (5)

Структура .	РФУ Тра-1-60 (СД) .	РФУ Тра-1-81 (СД) .	RFU контроль Ab (SD) .
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	15 009 (1258)	21016 (2430)	3 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAβ1-6 (Galβ1-4GlcNAβ1-6 ) Galβ1-4Glc	39371 (8151)	44399 (9962)	3 (3)
Galβ1-3GlcNAc	12 (10)	6 (12)	4 (4)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc	6 (9)	2 (2)	4 (5)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	7 (9)	5 (3)	5 (8)
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc	4 (3)	0 (7)	5 (10)
Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAc	6 (10)	51 (144)	1 (5)
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc	5 (5) 90 039	3 (11)	4 (5)

Рис.2.

Зондирование гликанового массива моноклональными антителами Tra-1-60 ( A ) и Tra-1-81 ( B ). Массив анализировали при концентрации антител 25 мкг / мл. Структуры лигандов, которые дают наиболее сильные сигналы, указаны с использованием номенклатуры символов. Полный список всех гликанов в массиве и результаты связывания Tra-1-60 и Tra-1-81 представлены в дополнительных данных.

Рис. 2.

Зондирование гликанового массива с помощью моноклональных антител Tra-1-60 ( A ) и Tra-1-81 ( B ).Массив анализировали при концентрации антител 25 мкг / мл. Структуры лигандов, которые дают наиболее сильные сигналы, указаны с использованием номенклатуры символов. Полный список всех гликанов в массиве и результаты связывания Tra-1-60 и Tra-1-81 представлены в дополнительных данных.

hESC

O -гликаны несут гликановый эпитоп, определенный для Tra-1-60- и Tra-1-81

Изолированные нейтральные восстанавливающие O -гликаны из hESC были проанализированы с помощью масс-спектрометрии (МС) с лазерной десорбцией-ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF).Частичный масс-спектр показан на рисунке 3А. Когда препарат O -гликана был расщеплен Escherichia freundii endo -β-галактозидазой, одним из основных сигналов гликана, который уменьшился, был пик, наблюдаемый на м / z 1136,32 (Hex ₃ HexNAc ₃; рис. 3В). Интенсивность сигнала сравнивали с интенсивностями сигналов на м / z 1079,30 и 1095,30, которые возникают в результате загрязнения структур N -гликана, не перевариваемых ферментом. Endo -β-галактозидаза специфически расщепляет неразветвленные последовательности полилактозамина. Сигнал на m / z 1136.32 был также чувствителен к расщеплению экзогликозидазой β1,3-галактозидазы (рис. 3D), но не к перевариванию β1,4-галактозидазой (рис. 3C), и поэтому было определено, что он содержит невосстанавливающий конец последовательности Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ (цепь полилактозамина, оканчивающаяся эпитопом лактозамина 1 типа). Активность гликозидазы контролировали с использованием соответствующих олигосахаридов в качестве субстратов, как описано в дополнительных данных.В настоящих экспериментах мы не характеризовали химически восстанавливающий концевой дисахарид, но кандидатом является структура ядра гликана O -гликана муцинового типа Galβ1-3GalNAcα, которая была описана в hESC (Wearne et al. 2008). В заключение, сигнал O -гликана на m / z 1136.32 возникает из структуры гликана Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1- (Hex ₁ HexNAc ₁), скорее всего, GalNAc1-3Galβ1-3Galβ1-3Galβ1-3 -4GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3) GalNAc, который содержит минимальный эпитоп, распознаваемый антителами Tra-1-60 и Tra-1-81.

Рис. 3.

Анализ гликозилирования hESC O с помощью МС. ( A ) Частичный масс-спектр MALDI-TOF для O -гликанов, высвобожденных из hESC. ( B ) Масс-спектр после переваривания эндо -β-галактозидазой O -гликанов, ( C ) после переваривания β1,4-галактозидазой и ( D ) после переваривания β1,3-галактозидазы . Интенсивность сигнала m / z 1136 сравнивается с интенсивностью сигнала m / z 1079 и 1095, которые возникают в результате загрязнения N -гликанов, не перевариваемых endo -β-галактозидазой, β1, 4-галактозидаза или β1,3-галактозидаза.Номенклатура символов: зеленый кружок, манноза; красный треугольник, фукоза; синий квадрат, N -ацетилглюкозамин; желтый кружок, галактоза; желтый квадрат, N -ацетилгалактозамин.

Рис. 3.

Анализ гликозилирования hESC O с помощью МС. ( A ) Частичный масс-спектр MALDI-TOF для O -гликанов, высвобожденных из hESC. ( B ) Масс-спектр после переваривания эндо -β-галактозидазой O -гликанов, ( C ) после переваривания β1,4-галактозидазой и ( D ) после переваривания β1,3-галактозидазы .Интенсивность сигнала m / z 1136 сравнивается с интенсивностью сигнала m / z 1079 и 1095, которые возникают в результате загрязнения N -гликанов, не перевариваемых endo -β-галактозидазой, β1, 4-галактозидаза или β1,3-галактозидаза. Номенклатура символов: зеленый кружок, манноза; красный треугольник, фукоза; синий квадрат, N -ацетилглюкозамин; желтый кружок, галактоза; желтый квадрат, N -ацетилгалактозамин.

Обсуждение

Маркеры Tra-1-60 и Tra-1-81 широко используются в исследованиях стволовых клеток человека в качестве положительных индикаторов истинных плюрипотентных стволовых клеток человека (International Stem Cell Initiative 2007).Настоящее исследование переопределяет молекулярную идентичность эпитопов, распознаваемых антителами Tra-1-60 и Tra-1-81. Было обнаружено, что окрашивание hESC Tra-1-60 и Tra-1-81 чувствительно к обработке клеток β1,3-галактозидазой, что указывает на то, что терминальная β1,3-галактоза является важной частью эпитопа. На гликановом массиве из 511 олигосахаридов антитела Tra-1-80 и Tra-1-61 специфически связываются с двумя олигосахаридными структурами, содержащими дисахарид лактозамина 1-го типа, β1,3-связанный с лактозамином 2-го типа: Galβ1-3GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAc и Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3GlcNAcβ1-3) Galβ1-4Glc.Гликан O , содержащий тот же эпитоп Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, был обнаружен как один из основных O -гликанов hESC с помощью масс-спектрометрического и ферментативного анализов.

Настоящие результаты несколько противоречат ранее опубликованным данным, указывающим на то, что антитела Tra-1-81 и Tra-1-60 распознают эпитопы кератансульфата (Badcock et al. 1999). Примечательно, что Glycan Array не содержит полимерных эпитопов кератансульфата. Следовательно, без прямого сравнения с кератансульфатом нельзя исключить возможность того, что эпитопы лактозамина 1 типа представляют собой перекрестно реагирующие структуры.Однако Tra-1-60 и Tra-1-81 не связывает повторяющиеся структурные единицы кератансульфата, [6OSO ₃] Galβ1-4 [6OSO ₃] GlcNAc или Galβ1-4 [6OSO ₃] GlcNAc на массиве. Эти антитела также не связывали какие-либо полилактозамины 2 типа, несульфатированную форму кератансульфата, которые в большом количестве представлены на матрице. Возможно, что фермент кератаназа, использованный Badcock et al. для демонстрации ассоциации эпитопов с кератансульфатом содержались примеси, такие как β-галактозидаза, которая реагировала с Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc.Другое возможное объяснение противоречивых данных состоит в том, что эпитоп типа 1, подобный тому, который был обнаружен в структурном анализе O -гликанов, присутствует в hESC как терминальная модификация кератансульфата. Насколько нам известно, о модификациях типа 1 кератансульфат гликанов не сообщалось, но они являются биосинтетически возможными. Badcock et al. (1999) также продемонстрировали, что эпитоп Tra-1-60 разрушается сиалидазой, тогда как структура, указанная в настоящем исследовании как эпитоп для Tra-1-60, не сиалилирована.Фактически, тот же эпитоп в его сиалированной форме не связывал Tra-1-60. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы разрешить эти противоречия и установить, являются ли эпитопы лактозамина типа 1, распознаваемые Tra-1-81 и Tra-1-60 на hESC, модификациями кератансульфата или муцинового типа O -гликанов.

Моноклональные антитела Tra-1-60, Tra-1-81, K4, K21 и GCTM2 первоначально были получены против клеток эмбриональной карциномы человека (Andrews et al. 1984; Rettig et al. 1985; Pera et al.1988 г.). Tra-1-60, Tra-1-81 и GCTM2 используются в качестве антигенов-маркеров при характеристике hESC (International Stem Cell Initiative 2007). Tra-1-60, Tra-1-81, K4, K21 и GCTM2 — все распознают один и тот же высокомолекулярный гликопротеин, который предположительно является подокаликсином, но еще не был определенно охарактеризован (Badcock et al. 1999; Schopperle et al. al.2003; Schopperle and DeWolf 2007). GCTM2 распознает основной белок (Pera et al. 1988), тогда как другие антитела распознают гликановые эпитопы (Rettig et al.1985; Badcock et al. 1999). Было показано, что K21 связывается с лакто- N -тетраозой (LNT; Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-Cer), тогда как K4 связывается с сиалозил-LNT (Neu5Acα2-3LNT; Neu5Acα2-3Galcα1-3Glc Cer) в иммуно-ТСХ-анализе изолированных гликосфинголипидов (Fukuda et al. 1986). В свете настоящих результатов кажется, что Tra-1-60, Tra-1-81 и K21 распознают близкородственные эпитопы, а K4 распознает аналогичный эпитоп в сиалилированной форме. Однако новая специфичность антител Tra-1-60 и Tra-1-81 направлена на более длинный эпитоп полилактозамина, который может быть более специфичным для плюрипотентных клеток.

Результаты, представленные здесь вместе с более ранней литературой, подтверждают идею о том, что различные структуры лактозамина типа 1 являются типичными характеристиками O -гликанов и гликосфинголипидов плюрипотентных клеток человека. Напротив, N -гликаны hESCs несут исключительно лактозаминные эпитопы типа 2 (Satomaa et al. 2009). Клетки эмбриональной карциномы человека экспрессируют LNT-подобный эпитоп типа 1, распознаваемый моноклональным антителом K21 (Rettig et al. 1985; Fukuda et al. 1986; Garin-Chesa and Rettig 1989; Andrews et al.1996), сиалированный эпитоп лактозамина типа 1 Neu5Acα2-3LNT, распознаваемый моноклональными антителами K4 и DUPAN-2 (Rettig et al. 1985; Fukuda et al. 1986; Andrews et al. 1996; Kamoshida et al. 2002; Fujita et al. al. 2006) и фукозилированный эпитоп типа 1 сиалил-Льюис a [Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc; CA19-9; Цурута и др. 1997; Fujita et al. 2006]. Гликосфинголипиды лакто-ряда LNT и Neu5Acα2-3LNT были обнаружены в клетках эмбриональной карциномы человека с помощью комбинации MS, анализа метилирования и переваривания гликозидазой (Fukuda et al.1986). Мы недавно продемонстрировали присутствие гликосфинголипидов лакто-ряда в hESCs с помощью структурного анализа с использованием тандемного MS и гликозидазного переваривания, а также наличие различных эпитопов лактозамина типа 1 с помощью иммунохимических методов (M. Mikkola et al., В стадии подготовки). Таким образом, различные антигены типа 1 могут быть обнаружены в гликосфинголипидах и O -гликозилированных белках плюрипотентных клеток человека как с помощью иммунохимических методов, так и структурного анализа. iPS-клетки экспрессируют эпитопы Tra-1-60 и Tra-1-81, но гликозилирование iPS-клеток еще не изучено.Будет интересно посмотреть, является ли экспрессия различных антигенов типа 1 на гликосфинголипидах и O -гликанах также характерной особенностью iPS-клеток.

Молекулярная идентичность мишеней для широко используемых антител к маркерам плюрипотентности Tra-1-60 и Tra-1-81 открывает новые горизонты в гликобиологии плюрипотентных клеток. Экспрессия и биологическая функция Tra-1-60, Tra-1-81 и родственных эпитопов лактозамина типа 1 в различных типах плюрипотентных и дифференцированных клеток требует дальнейшего изучения.Остается выяснить, связаны ли лактозаминные антигены 1 типа функционально с плюрипотентностью или их экспрессия является вторичным явлением. В целом, эпитопам лактозамина 1-го типа приписывается мало биологических функций, возможно, из-за их меньшей численности по сравнению с эпитопами 2-го типа в широко изученных системах, таких как иммунные клетки. Биосинтетическое переключение с лактозаминов 1-го типа на лактозамины 2-го типа на гликолипидах и муциновых O -гликанах может играть роль в распознавании и передаче сигналов, происходящих в процессе дифференцировки плюрипотентных клеток.

Структурная информация о гликозилировании эмбриональных стволовых клеток и об эпитопах, распознаваемых маркерными антителами, будет полезна при разработке новых маркеров плюрипотентности. Особенно в связи с быстрорастущими исследованиями в области индуцированной плюрипотентности, существует потребность в тщательном понимании фенотипа действительно плюрипотентной клетки. В настоящее время для характеристики эмбриональных стволовых клеток и iPS-клеток используется ряд маркеров. Однако накапливаются данные о том, что эти клетки неоднородны по морфологии, фенотипу и функциям и поэтому должны быть классифицированы на субпопуляции, характеризующиеся множеством наборов биомаркеров (Enver et al.2009 г.). Открытие биомаркеров, а также сбор структурной и функциональной информации о молекулах биомаркеров важны для биологии стволовых клеток, чтобы найти инструменты для классификации и выделения плюрипотентных клеток и для мониторинга их состояния дифференцировки с помощью методов на основе антител, а также для выяснения молекулярных механизмы плюрипотентности и дифференциации.

Материалы и методы

Клеточные линии и культура клеток

Финская линия чЭСК FES 29 культивировали, как описано ранее (Mikkola et al.2006 г.). Клетки культивировали на питающих клетках эмбриональных фибробластов мыши (mEF) в бессывороточной среде, дополненной заменителем сыворотки Knockout (Invitrogen, Carlsbad, CA) для анализа O -гликана, и на Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ ) со средой, кондиционированной mEF, для лечения гликозидазой и проточной цитометрии. Чистота образца чЭСК после сбора из слоя питающих клеток составляла по крайней мере более 90% на основании как анализа проточной цитометрии с использованием антител к маркерам стволовых клеток, так и масс-спектрометрического анализа профиля N -гликана (Satomaa et al.2009 г.). В настоящих анализах O -гликана сиаловые кислоты Neu5Gc, полученные от мыши, не были обнаружены, что позволяет предположить, что не произошло серьезного загрязнения, специфичного для O -гликопротеина.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела Tra-1-81 и Tra-1-60 были приобретены у Millipore (Billerica, MA).

Обработка клеток гликозидазой

чЭСК культивировали на матригеле, трипсинизировали и фиксировали 0,5% параформальдегидом.Клетки инкубировали при 2,1 × 10 ⁵ клеток / 140 мкл Na-ацетатного буфера (pH 5,5) при + 37 ° C в течение ночи с 10,5 мЕ (1 ед. = 1 мкмоль / мин) β1,4-галактозидазы ( S . pneumoniae , рекомбинантный в E. coli ; Calbiochem / Merck, Дармштадт, Германия) или 140 ед. (1 ед. = 1 нмоль / ч) β1,3-галактозидазы ( X. manihotis , рекомбинантный в E. coli , Calbiochem / Merck) или только с буфером. Активность гликозидазы контролировали с использованием соответствующих олигосахаридов в качестве субстратов, как описано в дополнительных данных.

Проточная цитометрия

Клетки, обработанные гликозидазой, окрашивали 25 мкг / мл антител Tra-1-60 и Tra-1-81, а затем 15 мкг / мл конъюгированного с FITC кроличьего антимышиного IgM (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA ). Клетки анализировали с помощью программного обеспечения FACSAria и FACSDiva ™ версии 5.0.2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Набор гликанов

Антитела были протестированы против версии 4.2 гликанового массива Консорциума функциональной гликомики (www.functionglycomics.org) по стандартному протоколу. Антитела тестировали при 25 и 100 мкг / мл и детектировали с помощью меченного Alexa488 антимышиного IgM.

O -Гликановый анализ

Несколько миллионов чЭСК FES29 выращивали на слоях эмбриональных питающих клеток мыши и подвергали расщеплению N -гликозидазой F, осаждению ацетоном и экстракции метанолом для удаления большей части N -гликанов, как описано ранее (Satomaa et al. 2009). O -Гликаны выделяли с помощью невосстанавливающего β-элиминирования путем инкубации в карбонате аммония в концентрированном аммиаке при + 60 ° C в течение 2 дней, как описано (Huang et al. 2001). Полученные гликаны очищали методами твердофазной экстракции (Hemmoranta et al. 2007). МС и анализ данных выполняли, как описано ранее (Hemmoranta et al. 2007; Heiskanen et al. 2009; Satomaa et al. 2009). Присутствие остаточных N -гликанов во фракции O -гликанов указывает на то, что де-N-гликозилирование не было полным.

Эндо -β-галактозидаза (0,25 мЕ / мкл; 1 ед. = 1 мкмоль / мин, E. freundii , Seikagaku Corporation, Токио, Япония), β1,4-галактозидаза (0,09 мЕ / мкл; 1 U = 1 мкмоль / мин, S. pneumoniae , Calbiochem / Merck) и β1,3-галактозидаза (2,7 мЕ / мкл; 1 U = нмоль / ч, X. manihotis , Calbiochem / Merck). в 50 мМ Na-ацетатном буфере pH 5,5 при + 37 ° C в течение 20 часов. После инкубации реакционные смеси кипятили 3 мин для остановки реакции.Гликаны субстрата очищали с помощью хроматографических методов и анализировали с помощью MALDI-TOF MS (Heiskanen et al. 2009). Активность гликозидазы контролировали с использованием соответствующих олигосахаридов в качестве субстратов, как описано в дополнительных данных.

Финансирование

Эта работа частично финансировалась NIGMS — Консорциумом функциональных гликомик GM62116; и Финским агентством финансирования технологий и инноваций (TEKES).

Конфликт интересов

Авторы декларируют потенциально конкурирующие интересы: Т.С. и Дж. являются акционерами Glykos Finland Ltd.

Сокращения

Fuc, l-фукоза; Gal, d-галактоза; GalNAc, N -ацетил-d-галактозамин; Glc, d-глюкоза; GlcNAc, N -ацетил-d-глюкозамин; hESC, эмбриональные стволовые клетки человека; Hex, гексоза; HexNAc, N -ацетилгексозамин; iPS, индуцированная плюрипотентная ножка; LNT, лакто- N -тетраоза; MALDI-TOF, времяпролетная лазерная десорбция-ионизация с использованием матрицы; mEF, фидерная клетка эмбриональных фибробластов мыши; МС, масс-спектрометрия; Neu5Ac, N -ацетилнейраминовая кислота; SSEA, стадийно-специфический эмбриональный антиген.

Благодарности

Мы благодарим Дэвида Смита, Департамент биохимии, Медицинский факультет Университета Эмори, за выполнение анализа массива гликанов.

Список литературы

,,,,.

Три моноклональных антитела, определяющих различные антигены дифференцировки, связанные с различными высокомолекулярными полипептидами на поверхности клеток эмбриональной карциномы человека.

Гибридома.

1984

, т.

(стр.

347

—

361

),,,,,,,,, и др.

Сравнительный анализ антигенов клеточной поверхности, экспрессируемых клеточными линиями, полученными из опухолей половых клеток человека

Int J Cancer.

1996

, т.

(стр.

806

—

816

),,,.

Маркерный антиген эмбриональной карциномы человека TRA-1-60 представляет собой сиалированный кератансульфат протеогликан

Cancer Res.

1999

, т.

(стр.

4715

—

4719

),,,.

Поверхностные антигены эмбриональных стволовых клеток человека: изменения при дифференцировке в культуре

J Anat.

2002

, т.

200

(стр.

249

—

258

),,,.

Состояния стволовых клеток, судьбы и правила притяжения

Стволовые клетки клеток.

2009

, т.

(стр.

387

—

397

),,,,.

Эмбриональная карцинома, продуцирующая DU-PAN-2 с феноменом выгорания яичка

Int J Urol.

2006

, т.

(стр.

473

—

475

),,,,,.

Структуры гликосфинголипидов, выделенных из клеток эмбриональной карциномы человека. Наличие моно- и дисиалозилгликолипидов с последовательностью 1-го типа группы крови

J Biol Chem.

1986

, т.

261

(стр.

5145

—

5153

),.

Иммуногистохимический анализ углеводных антигенов LNT, NeuAc2-3LNT и Lex в опухолях и нормальных тканях человека

Am J Pathol.

1989

, т.

134

(стр.

1315

—

1327

),,,,,,,,, и др.

Гликомики мезенхимальных стволовых клеток костного мозга могут быть использованы для оценки стадии их клеточной дифференцировки

Glycoconj J.

2009

, vol.

(стр.

367

—

384

),,,,,,,,,.

Структуры N-гликанов и связанная с ними экспрессия генов отражают характерный образец N-гликозилирования гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников человека

Exp Hematol.

2007

, т.

(стр.

1279

—

1292

),,.

Невосстановительное высвобождение О-связанных гликанов в микромасштабе для последующего анализа с помощью масс-спектрометрии MALDI и капиллярного электрофореза

Anal Chem.

2001

, т.

(стр.

6063

—

6069

),,,,,,,,, и др.

Международная инициатива по стволовым клеткам

Характеристика линий эмбриональных стволовых клеток человека в рамках Международной инициативы по стволовым клеткам

Nat Biotechnol.

2007

, т.

(стр.

803

—

816

),,,,,.

Иммуногистохимическая неоднородность экспрессии антигенов группы крови 1 типа в опухолях семенных клеток яичка

Oncol Rep.

2002

, vol.

(стр.

845

—

851

),,.

Гликаны стволовых клеток

Curr Opin Chem Biol

2007

, vol.

(стр.

373

—

380

),,,,,,,,,.

Отличительные характеристики дифференцировки отдельных линий эмбриональных стволовых клеток человека

BMC Dev Biol.

2006

, т.

стр.

,,,,,.

Анализ линии дифференцировки клеток в тератомах человека с использованием новых моноклональных антител к цитоструктурным антигенам клеток эмбриональной карциномы

Дифференциация.

1988

, т.

(стр.

139

—

149

),,,,,.

Высокомолекулярные гликопротеины тератокарциномы человека, определяемые моноклональными антителами к углеводным детерминантам

Cancer Res.

1985

, т.

(стр.

815

—

821

),,,,,,,,, и др.

N-гликом эмбриональных стволовых клеток человека

BMC Cell Biol.

2009

, т.

стр.

Маркеры плюрипотентных стволовых клеток человека TRA-1-60 и TRA-1-81 экспрессируются на подокаликсине в эмбриональной карциноме

стволовых клетках.

2007

, т.

(стр.

723

—

730

),,.

Опухолевый антиген эмбриональной карциномы человека, Gp200 / GCTM-2, представляет собой подокаликсин

Biochem Biophys Res Commun.

2003

, т.

300

(стр.

285

—

290

),,,,,,.

Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами

Cell.

2007

, т.

131

(стр.

861

—

872

),,,,,,.

Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека

Science.

1998

, т.

282

(стр.

1145

—

1147

),,,.

CA19-9: возможный сывороточный маркер эмбриональной карциномы

Urol Int.

1997

, т.

(стр.

—

),,,,,,.

Профили связывания лектина на поверхностях плюрипотентных человеческих стволовых клеток, обогащенных SSEA-4

BMC Dev Biol.

2005

, т.

стр.

,,.

Временные изменения углеводов, экспрессируемых на эмбриональных стволовых клетках человека BG01 во время дифференцировки в виде эмбриоидных тел

Glycoconj J.

2008

, vol.

(стр.

121

—

136

),,,.

Использование лектинов для исследования дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека на содержание углеводов

Гликобиология.

2006

, т.

(стр.

981

—

990

),.

Поверхностные маркерные антигены в характеристике эмбриональных стволовых клеток человека

Stem Cell Res.

2009

, т.

(стр.

—

Свежий взгляд на ячейки iPS

Cell.

2009

, т.

137

(стр.

—

)

TRA-1 ChIP-seq выявляет регуляторы половой дифференциации и многоуровневую обратную связь в определении пола нематод.

Значимость

Гены, определяющие пол, были идентифицированы у многих животных, но то, как они влияют на половую специфичность развития, плохо изучено. Мы спрашиваем, как трансформер 1 фактора транскрипции, определяющего пол нематод (TRA-1), регулирует пол, определяя, где в геноме связывается TRA-1 и на какие близлежащие гены может влиять это связывание.Мы обнаружили, что TRA-1 способствует развитию женщин, прежде всего, предотвращая экспрессию генов, участвующих в развитии мужчин. Среди генов, репрессированных TRA-1, есть несколько генов, которые контролируют время онтогенетических событий, а также несколько, которые функционируют выше TRA-1 в глобальном пути определения пола. Набор целей TRA-1, представленный здесь, предоставляет ресурс для дальнейшего раскрытия основ развития с учетом пола.

Abstract

То, как сексуальные регуляторы переводят глобальную сексуальную судьбу в соответствующие события локальной половой дифференциации, является, пожалуй, наименее понятным аспектом полового развития.Здесь мы использовали ChIP с последующим глубоким секвенированием (ChIP-seq), чтобы идентифицировать прямые мишени глобального полового регулятора нематод Transformer 1 (TRA-1), фактора транскрипции, действующего на стыке между общими организменными и клеточно-специфическими сексуальными регуляторами. контролировать все события соматической дифференциации по полу. Мы идентифицировали 184 сайта связывания TRA-1 у Caenorhabditis elegans , многие из которых связаны с временной и / или тканеспецифической ассоциацией TRA-1. Мы также идентифицировали 78 сайтов связывания TRA-1 у родственной нематоды Caenorhabditis briggsae , 19 из которых консервативны у двух видов.Некоторые сегменты ДНК, содержащие сайты связывания TRA-1, управляют специфическими для мужчин паттернами экспрессии, а истощение RNAi некоторых генов, прилегающих к сайтам связывания TRA-1, приводит к дефектам полового развития мужчин. TRA-1 связывается с сайтами, смежными с рядом гетерохронных регуляторных генов, некоторые из которых управляют мужской специфической экспрессией, что позволяет предположить, что TRA-1 накладывает половую специфичность на время развития. Мы также нашли доказательства регуляции TRA-1 по обратной связи глобального пути определения пола: TRA-1 связывает свой собственный локус и локусы нескольких вышележащих генов маскулинизации, и большинство этих ассоциаций законсервированы у C.briggsae . Таким образом, TRA-1 координирует половое развитие, усиливая решение об определении пола и направляя последующие события половой дифференциации.

Половое развитие требует первоначального решения об определении пола, за которым следуют события дифференциации по признаку пола, которые устанавливают анатомические, физиологические и поведенческие различия между полами. Хотя переключение определения пола хорошо изучено у многих животных, молекулярные и генетические механизмы, с помощью которых впоследствии проявляется сексуальная судьба, представляют собой серьезный пробел в нашем понимании полового развития.Здесь мы обращаемся к этому вопросу у нематоды Caenorhabditis elegans .

Пол определяется генетически в C. elegans : Эмбрионы с двумя Х-хромосомами (ХХ) развиваются как самоплодотворяющие гермафродиты — самки, которые временно производят сперму, — тогда как эмбрионы с одной Х-хромосомой (ХО) развиваются как самцы (1). Комплект половых хромосом определяет активность Трансформера 1 (TRA-1), фактора транскрипции, который управляет половым дифференцированием у всего животного (рис. 1) (2).Высокая активность TRA-1 у животных ХХ способствует дифференцировке самок, тогда как низкая активность TRA-1 у животных ХО позволяет дифференцироваться по самцам (3). Половой диморфизм обширен, примерно треть взрослых соматических клеток демонстрируют очевидные половые различия (4) и зависит от активности tra-1 . Нулевые мутации в tra-1 вызывают развитие XX животных как фертильные псевдомалы, в то время как мутации увеличения функции tra-1 вызывают развитие XO животных как фертильных самок (3). Действительно, были сконструированы стабильные штаммы, в которых генотип в локусе tra-1 определяет пол независимо от половых хромосом (5).Генетический мозаичный анализ показал, что tra-1 определяет пол автономно в большинстве клеток (6), хотя передача сигналов клеток действительно играет роль в координации решения об определении пола между клетками (7) и в локальной индукции судеб половых клеток (8).

Рис. 1. Модель

для генетического контроля C. elegans соматического определения пола. Незначительные генетические взаимодействия и компоненты опущены для простоты.

tra-1 выполняет несколько различных функций в половом развитии.Во-первых, он управляет соматическим развитием самок посредством репрессии транскрипции генов, которые способствуют дифференцировке самцов. Примеры включают мужской аномальный 3 ( mab-3 ) (9) и семейство доменов DM 3 ( dmd-3 ) (10), которые совместно контролируют определенные аспекты развития мужского хвоста, и C. elegans homeobox 30 ( ceh-30 ) (11) и дефект яйцекладки 1 ( egl-1 ) (12), которые регулируют гибель клеток в нервной системе в зависимости от пола. Во-вторых, tra-1 регулирует определение пола зародышевой линии путем подавления феминизации зародышевой линии 1 ( fog-1 ) и fog-3 , чтобы способствовать оогенезу (13, 14).Кроме того, tra-1 необходим для правильной организации клеток в ранней мужской соматической гонаде (3) и модулирует синтез мембран в женской зародышевой линии для облегчения оогенеза (15), хотя мишени TRA-1, функционирующие в этих процессах, остаются неизвестными. . Идентификация набора генов-мишеней TRA-1 и определение того, как они коллективно управляют половой дифференциацией C. elegans , предоставит парадигму для понимания того, как сексуальные регуляторы переводят глобальные сексуальные судьбы в специфические события дифференциации.

Результаты

Ассоциация хроматина TRA-1 демонстрирует временную и тканевую специфичность.

Чтобы идентифицировать сайты связывания TRA-1 по всему геному, мы выполнили ChIP-seq с использованием антитела, которое выявляет как основные изоформы TRA-1, так и связывает ДНК-связанный TRA-1 (рис. S1) (15). Мы выполнили ChIP-seq у личинок L2, личинок L3 и у молодых особей с дефектным сперматогенезом 11 ( spe-11 ), которые не могут производить эмбрионы из-за нефункциональной спермы (16). Мы выбрали эти временные точки, в течение которых происходят многие TRA-1-зависимые события дифференцировки по полу, чтобы идентифицировать как можно больше TRA-1-связывающих сайтов.Мы также проанализировали аномальную пролиферацию зародышевой линии 4 ( glp-4 ) молодых людей с дефицитом половых клеток (17), чтобы изучить тканеспецифичность связывания TRA-1. Затем мы проанализировали tra-1 (e1834) — нулевые мутантные псевдомалы молодых взрослых (3, 18), чтобы идентифицировать сайты, обогащенные независимо от TRA-1, которые были исключены из дальнейшего анализа. Мы идентифицировали в общей сложности 184 сайта, которые были специфически связаны с TRA-1 в обеих биологических репликациях по крайней мере одного состояния развития ( SI Materials and Methods и Dataset S1).

Идентифицированных 184 TRA-1-связывающих сайтов меньше, чем типично для сайт-специфических факторов транскрипции. Однако они, вероятно, включают около половины сайтов связывания TRA-1 в C. elegans, , потому что сайты связывания были идентифицированы около пяти из восьми ранее описанных мишеней TRA-1, dmd-3 , mab-3 , XO lethal 1 ( xol-1 ), fog-1 и fog-3 . Связывание не наблюдалось вблизи ранее описанных TRA-1-мишеней , egl-1 , ceh-30 или аномальной клеточной линии 39 ( lin-39 ).Пять ранее описанных мишеней, которые были связаны, необходимы для полоспецифичного развития в большем количестве клеток, чем три несвязанные мишени, что позволяет предположить, что связывание может быть специфичным для типа клеток и что ChIP-seq всего животного может не идентифицировать только связанные мишени. в небольшом количестве ячеек. В качестве альтернативы, некоторые цели могут быть привязаны к временным точкам развития, которые мы не исследовали.

TRA-1 связывается in vitro с неамерным мотивом ДНК, очень похожим на тот, который распознается его гомологом GLI у млекопитающих (рис.2 А ) (19). Наиболее значительно обогащенный мотив в сайтах связывания TRA-1 почти точно соответствовал этому мотиву, определенному in vitro (рис. 2 A ), обнаруженному в 169 из 184 (92%) сайтов связывания TRA-1, что указывает на что большинство, но не все сайты связаны этим мотивом. TRA-1 может связываться с другими сайтами посредством более дивергентных мотивов или косвенного привлечения других факторов. Хотя большинство сайтов связывания TRA-1 имели этот мотив, только около 4% наилучших совпадений с этим мотивом в геноме C. elegans были связаны с TRA-1 (рис.2 В ). В целом, обогащение TRA-1 ChIP было сильнее для сайтов с более близкими совпадениями с консенсусным мотивом, но многие идеальные совпадения не были детектируемым связыванием TRA-1, и многие связанные сайты имели несовершенные совпадения (фиг. 2 B ). Таким образом, как и многие факторы транскрипции (20), TRA-1 связывает ДНК в большинстве своих сайтов посредством согласованной связывающей последовательности, но дополнительные факторы помогают определить, связывает ли TRA-1 этот мотив.

Рис. 2.

Анализ сайтов связывания TRA-1 в C.elegans геном. ( A ) Сравнение TRA-1-связывающих мотивов, полученных in vitro и in vivo. ( B ) Анализ занятости TRA-1 в 2713 наиболее близких совпадениях с мотивом TRA-1, обнаруженным в геноме C. elegans . Мотивы упорядочены по уровню обогащения TRA-1 ChIP на стадии L3. ( Left ) Нормализованное считывание чипа TRA-1 в пределах окна размером 4 т.п.н., центрированного на каждом мотиве TRA-1. ( Right ) Сила совпадения с сайтом связывания TRA-1 для мотивов TRA-1. Каждая полоса представляет собой средний балл (−log ₁₀ из значения P ) для 20 мотивов, сдвигающийся через каждые 10 мотивов.( C ) Анализ стадийной и тканеспецифической занятости TRA-1 в 184 in vivo сайтах связывания TRA-1. Зеленые прямоугольники указывают на то, что сайт был значительно связан ( P <10 ^-5; кратное обогащение> 4) по меньшей мере в одном из двух повторов, выполненных для данного состояния развития.

Чтобы изучить, как изменяется занятость ДНК TRA-1 во время развития, мы оценили обогащение ChIP на каждом из 184 сайтов связывания TRA-1 в каждом из тестируемых условий развития, считая значительное обогащение в любом из двух повторов как показатель TRA. -1 привязка (рис.2 С ). По этому критерию 32 из 184 сайтов были связаны с TRA-1 в L2, 105 в L3 и 164 в spe-11 молодых людей, указывая на увеличение количества сайтов, занятых TRA-1, по мере прогрессирования развития. Таким образом, предыдущее предположение о том, что TRA-1 может связываться со своими целевыми сайтами в любое время и во всех тканях, вызывая специфичную для пола экспрессию только в клетках, в которых активны близлежащие регуляторные элементы (21), кажется маловероятным, по крайней мере, для многих из них. сайты, указанные здесь. Чтобы спросить, связывает ли TRA-1 ткань специфически со своими сайтами связывания, мы сравнили связывание TRA-1 у молодых взрослых людей glp-4 (сильно уменьшенная зародышевая линия) и spe-11 (нормальная зародышевая линия, но не оплодотворенные эмбрионы).Из 164 сайтов со значительным обогащением spe-11 животных 45 не были связаны в glp-4 ( SI Materials and Methods и Dataset S1), что позволяет предположить, что TRA-1 связывается с этими сайтами в основном в зародыше. линия. Эти специфичные для зародышевой линии мишени TRA-1 являются кандидатами для будущих исследований того, как TRA-1 регулирует организацию оогенных мембран (15).

Гены-мишени TRA-1 участвуют в специфическом половом развитии мужчин.

Мы провели пилотный скрининг, чтобы оценить, можно ли использовать наш список из 184 сайтов связывания TRA-1 для идентификации половых регуляторов.Мы использовали репортерный анализ для идентификации связанных с TRA-1 сегментов ДНК, способных управлять экспрессией, специфичной для пола (рис. 3 A ), и РНКи для идентификации генов, прилегающих к сайтам связывания TRA-1, которые необходимы для половой дифференциации (рис. 3 B ). Мы выбрали 35 сайтов для исследования с помощью репортерного анализа (набор данных S1) на основе силы обогащения TRA-1 ChIP, обогащения в несколько стадий и наличия сильных мотивов TRA-1. Шесть сегментов, связанных с TRA-1, вызывали очевидную мужскую экспрессию при слиянии с минимальным промотором и GFP (рис.3 A и 4 A ). Один был смежным с фактором транскрипции цинкового пальца ztf-6 и управлял экспрессией в специфичных для самцов клонах хвоста. Другой был рядом с ptr-5 , который кодирует белок, удаленно паралогичный Drosophila PATCHED. Репортер ptr-5 специфически экспрессировался в стенках тела и устьично-кишечных мышцах, а также в половых мышцах и некоторых нейронах обоих полов (фиг. 3 A ). Устранение TRA-1-связывающего мотива в этом репортере активировало экспрессию в стенке тела гермафродита и в мышечных клетках стомато-кишечного тракта (рис.3 А ). Другой сайт находился рядом с mab-23 , который кодирует фактор транскрипции DM-домена, регулирующий половую дифференциацию самцов (22). Короткая область, содержащая этот сайт, управляла мужской репортерной экспрессией в хвосте (фиг. 3 A ). Удаление мотива TRA-1 в этом репортере вызывало эктопическую экспрессию в хвосте гермафродита, но экспрессия была слабой и вариабельной, что позволяет предположить, что TRA-1 может действовать избыточно, подавляя mab-23 , или что гермафродиты не имеют активатора, необходимого для устойчивого выражение. mab-23 представляет собой один из трех факторов транскрипции DM-домена (наряду с mab-3 и dmd-3 ), участвующих в мужской половой дифференцировке и непосредственно регулируемых TRA-1. Т.о., регуляция транскрипции этого семейства белков, члены которого также регулируют пол у Drosophila и у позвоночных (23), является основным механизмом, с помощью которого TRA-1 регулирует соматическую половую дифференциацию.

Рис. 3.

Недавно идентифицированные гены-мишени TRA-1 демонстрируют специфические для мужчин паттерны экспрессии и фенотипы снижения функции.( A ) Геномные интервалы, содержащие сайты связывания TRA-1, управляют экспрессией специфичного для мужчин репортерного гена. ( Left ) ztf-6 :: gfp экспрессируется самцом специфически в развивающемся хвосте. ( Center ) ptr-5 :: gfp экспрессируется самцами специфически в стенке тела (стрелки) и устьично-кишечной мышце. Половая специфичность этого выражения зависит от присутствия мотива TRA-1. ( Right ) mab-23 :: gfp экспрессируется самцами специфически в хвосте, и половая специфичность этой экспрессии зависит от присутствия мотива TRA-1.( B ) RNAi ztf-6 приводит к дефектам в развитии мужского хвоста, включая слитные лучи и уменьшенный веер.

Рис. 4.

TRA-1-связывающих сайтов около четырех гетерохронных регуляторных генов управляют мужской специфической экспрессией. ( A ) TRA-1 ассоциирует с хроматином около lin-42 , kin-20 , lin-4 и lin-28 . TRA-1-ChIP (красный) и входные треки ДНК (черный) показаны в одном масштабе. Близкие совпадения с консенсусным связывающим мотивом TRA-1 обозначены вертикальными черными полосами над кривой ChIP.( B ) Области, окружающие сайты связывания TRA-1 рядом с lin-42 , kin-20 и lin-4 , управляют экспрессией репортерного гена в клонах мужских специфических клеток в хвосте, включая P10. линия p (полоса) и линия B (скобка). ( C ) Область, окружающая сайт связывания TRA-1 рядом с lin-28 , управляет мужской специфической экспрессией в мышцах стенки тела (стрелки), и половая специфичность этой экспрессии зависит от присутствия TRA- 1 мотив.Стрелки указывают положение вульвы гермафродита (ву).

Поскольку ранее описанные сайты связывания TRA-1 обычно лежат внутри или рядом с регулируемым геном, мы предполагаем, что большинство из 184 сайтов связывания TRA-1 будут регулировать перекрывающийся ген или один из двух непосредственно соседних неперекрывающихся гены. Мы определили 444 гена, содержащих или соседних с сайтом связывания TRA-1, и выбрали 34 гена для исследования с помощью РНКи (набор данных S1) на основании их близости к сильным сайтам связывания TRA-1 и предсказали молекулярные функции, соответствующие роли в половой жизни. дифференциация.Истощение РНКи одного из этих генов, ztf-6, вызывает дефекты мужского хвоста (Fig. 3 B ), включая слитые лучи и уменьшенный веер. Таким образом, ztf-6 , ptr-5 и mab-23 , вероятно, являются прямыми генами-мишенями TRA-1, играющими роль в мужской половой дифференциации. Поскольку в ходе этого пилотного скрининга были изучены паттерны экспрессии только для 20% из 184 сайтов связывания TRA-1 и фенотипы РНКи только для 8% из 444 генов рядом с этими сайтами, весьма вероятно, что данные ChIP, представленные выше, могут быть использованы для поиска дополнительные регуляторы мужской дифференциации.

TRA-1 связывает и регулирует экспрессию генов, контролирующих время развития.

Время развития у C. elegans контролируется сложной сетью гетерохронных регуляторных генов (24). Гетерохронные мутации вызывают дефекты во многих аспектах полового развития мужчин, вероятно, из-за нарушения сроков критических делений клеток (25). Поразительно, что среди примерно двух десятков гетерохронных генов TRA-1 связывается рядом с шестью, аномальным образованием дауэра 12 ( daf-12 ), протеинкиназой 20 ( kin-20 ), lin-4 , lin- 14 , lin-28 и lin-42 (рис.4 A и набор данных S1). Сегменты ДНК, содержащие три из этих сайтов, соседние с lin-42 , kin-20 и lin-4 , вызывают сильную экспрессию в клонах, которые подвергаются специфическим для мужчин программам развития, особенно P10.p и B линии развивающегося хвоста (рис. 4 B ). Репортер lin-28 показал специфичную для мужчин экспрессию в мышцах стенки тела, специализированный по половому признаку тип клеток, обнаруженный у обоих полов (рис. 4 C ), и устранение TRA-1-связывающего мотива активировало экспрессию в стенке тела гермафродита. мышца (рис.4 С ). Эти результаты в совокупности указывают на то, что TRA-1 непосредственно репрессирует транскрипцию гетерохронных генов у гермафродитов.

TRA-1 возвращается на путь определения пола на нескольких уровнях.

Мы также идентифицировали сайты связывания TRA-1, представляющие две формы регуляции обратной связи на пути определения пола. Во-первых, локус tra-1 содержал три сайта связывания TRA-1 (рис. 5 A ). Генетические данные подтверждают ауторегуляцию tra-1 : феминизирующий эффект доминантных аллелей усиления функции tra-1 может быть уменьшен путем добавления копий гена дикого типа (18) и многих рецессивных гипоморфных tra-1. Аллели демонстрируют эквивалентную маскулинизацию, когда они гомозиготны или гемизиготны (26).Во-вторых, мы наблюдали очевидную обратную связь по вышестоящим генам детерминации пола. TRA-1 может связываться с сайтом в промоторе xol-1 in vitro и через этот сайт регулирует репортерные трансгены xol-1 (27). ChIP-seq подтвердил in vivo связывание TRA-1 с этим сайтом (фиг. 5 A ), а также идентифицировал TRA-1-связывающие сайты, смежные с феминизацией 3 ( fem-3 ) и супрессором 26 ( sup-26 ). ) (28), предполагая более обширную обратную связь вверх по течению (рис.5 и набор данных S1; также см. Рис.7). Сайт около гермафродизации 1 ( her-1 ) также показал связывание TRA-1, но ниже применяемого порогового значения. Все эти вышестоящие мишени обычно способствуют развитию самцов, подтверждая, что репрессия транскрипции TRA-1 обеспечивает многоуровневое усиление феминизирующего режима переключения определения пола.

Рис. 5.

TRA-1 получает обратную связь по пути определения пола на нескольких уровнях. ( A ) C. elegans TRA-1 связывается рядом с локусами tra-1 , xol-1 , sup-26 и fem-3 .( B ) C. briggsae TRA-1 связывается рядом с локусами Cbr-tra-1 , Cbr-xol-1 и Cbr-fem-3 . Участок около Cbr-sup-26 показал занятость CBR-TRA-1, но ниже порогового значения, которое мы применили. ( C ) Совмещения мотивов TRA-1 (подчеркнуты), идентифицированные рядом с локусами xol-1 и fem-3 в C. elegans , C. briggsae , C. brenneri и С. remanei .

Для дальнейшего изучения регулирования обратной связи мы остановились на fem-3 .Регуляция fem-3 в зародышевой линии XX включает посттранскрипционную репрессию (29), но экспрессия FEM-3 в соматических тканях не описана. Репортер фосмиды FEM-3 :: GFP экспрессируется в области семявыносящего протока мужской соматической гонады, но не обнаруживается в гонаде гермафродита (фиг. 6 A ). Устранение мотива TRA-1 активировало экспрессию в соматических гонадах гермафродита с устойчивой экспрессией, ограниченной сперматекой (Fig. 6 A ), хотя эта эктопическая экспрессия FEM-3 не приводила к каким-либо очевидным дефектам развития.Мы также исследовали эндогенную экспрессию FEM-3 с помощью иммунофлуоресценции, которая подтвердила более сильную экспрессию у самцов сомы, чем у гермафродитов (фиг. 6 B ). Мы пришли к выводу, что соматическая экспрессия fem-3 включает регуляцию транскрипционной обратной связи с помощью TRA-1, которая потенциально функционирует, чтобы усилить глобальное решение по определению пола.

Рис. 6.

TRA-1 регулирует экспрессию fem-3 . ( A ) Репортер FEM-3 :: GFP экспрессируется в семявыносящем протоке (vd) (стрелка) мужской соматической гонады, но не проявляет экспрессии в соматической гонаде гермафродита.FEM-3 :: GFP ΔTRA-1 экспрессируется в сперматеке (sp) (наконечники стрелок) соматических гонад гермафродита. ( B ) Окрашивание антителом FEM-3 показывает, что соматическая экспрессия FEM-3 обычно ограничивается самцами.

Мишени TRA-1 сохранены эволюционно.

Гомологи TRA-1 определяют пол у других видов нематод, включая Pristionchus pacificus (30) и Caenorhabditis briggsae , которые отличаются от C. elegans примерно на 200 миллионов лет и 100 миллионов лет соответственно.Несмотря на эволюционную стабильность функции определения пола TRA-1, неизвестно, регулируются ли какие-либо гены, регулируемые TRA-1 в C. elegans , и у других видов, хотя анализ последовательности показал, что TRA-1-связывающие мотивы присутствуют около ортологов C. briggsae некоторых идентифицированных целей C. elegans TRA-1, включая mab-3 и fog-3 (9, 31). Антитело TRA-1 распознает C. briggsae TRA-1 (15), поэтому мы выполнили ChIP-seq в C.briggsae L3 и идентифицировали 78 сайтов связывания CBR-TRA-1 (набор данных S1). Сайты связывания CBR-TRA-1 были высоко обогащены мотивом TRA-1, который, по-видимому, идентичен у двух видов и обнаружен в 54 из 78 (69%) сайтов связывания CBR-TRA-1. Для 64 из 78 сайтов связывания CBR-TRA-1 синтенические выравнивания однозначно идентифицировали единственную область в геноме C. elegans , соответствующую связанной области в C. briggsae . Из этих 64 синтенических регионов 19 совпадали с одной из 184 C.elegans TRA-1-сайты связывания (Dataset S1), подтверждая существенное сохранение регуляции TRA-1 посредством эволюции нематод. Примечательно, что сайты, представляющие регуляцию обратной связи пути определения пола, в том числе соседние с tra-1 , fem-3 и xol-1 , показали занятость TRA-1 у обоих видов (рис. 5 B ). ). Сайт около Cbr-sup-26 также обнаружил слабое связывание CBR-TRA-1, но это было ниже порогового значения. Точно так же связывание TRA-1 рядом с гетерохронными генами daf-12 , kin-20 и lin-14 также является консервативным, предполагая, что эти события связывания, вероятно, опосредуют биологически релевантную регуляцию.

Обсуждение

Здесь мы использовали ChIP-seq для идентификации 184 сайтов связывания глобального полового регулятора нематоды TRA-1. Пилотный анализ генов, прилегающих к этим сайтам, выявил семь генов-мишеней TRA-1, которые, по-видимому, способствуют мужской половой дифференциации на основе характерных для мужчин паттернов экспрессии и / или специфичных для мужчин фенотипов РНКи. Однако ни одна из исследованных нами мишеней не показала специфического для гермафродитов фенотипа снижения функции или паттерна экспрессии. Аналогичным образом, ChIP-seq показал, что обратная связь TRA-1 с вышестоящим путем определения пола происходит исключительно на генах, способствующих развитию самцов (рис.7), что согласуется с их подавлением TRA-1 у гермафродитов. Кроме того, 12 из 256 (4,7%) кодирующих генов (Dataset S1), соседних с сайтами, связанными с TRA-1 в L2 или L3, показали смещенную к мужчинам экспрессию в опубликованном анализе L4 RNA-seq (32) по сравнению с 577 из 19 313 (3,0 %) общее количество кодирующих генов со смещенной экспрессией по мужской линии. Напротив, ни один из этих 256 генов не проявил экспрессию с предвзятым отношением к гермафродитам. Мы не можем исключить возможность того, что TRA-1 может активировать, а также подавлять транскрипцию, как некоторые другие белки GLI.Однако наши данные подтверждают мнение, что TRA-1 функционирует в первую очередь как репрессор транскрипции, генерируя экспрессию сексуально диморфных генов, ограничивая экспрессию его мишеней у гермафродитов.

Рис. 7.

Модель TRA-1 регуляции полового развития нематод. TRA-1 подавляет гены определения пола, которые во всем мире способствуют развитию мужчин, включая xol-1 , sup-26 , fem-3 и, возможно, her-1 , а также гены половой дифференциации, которые способствуют развитию тканей. -специфическое мужское половое развитие, включая lin-28 и ptr-5 .

Наши данные и предыдущий генетический анализ (26, 33) показывают, что TRA-1 выполняет две различные роли в регуляции полового развития: он контролирует дифференцировку клеток и тканей, специфичных для пола, регулируя набор нижестоящих эффекторных генов, и он отвечает за несколько шагов вверх по течению, чтобы повлиять на первичное решение об определении пола (рис. 7). Связывание TRA-1 рядом с fem-3 и xol-1 сохранялось между C. elegans и C. briggsae , и последовательности, содержащие TRA-1-связывающие мотивы, также сохраняются рядом с этими генами в Caenorhabditis brenneri и Caenorhabditis remanei (рис.5 С ). Репортерный анализ и иммунофлуоресценция подтвердили роль TRA-1 как репрессора транскрипции fem-3 в соме гермафродита. Многокопийные трансгены обычно не экспрессируются в зародышевой линии, поэтому мы еще не исследовали, происходит ли эта транскрипционная обратная связь также в половых клетках; однако взаимоисключающее распределение ядерных TRA-1 и FEM-3 в зародышевой линии (15) предполагает, что это возможно. Соматическая экспрессия FEM-3 не была показана ранее (34), но подтверждается генетическими данными: соматическая феминизация самцов tra-1 (gf) подавляется мутациями увеличения функции в fem-3 3 ‘ UTR, которые не влияют на уровни транскрипта fem-3 (26).Таким образом, активность FEM-3 регулируется, по крайней мере, тремя отдельными способами: трансмембранный рецепторный белок TRA-2 подавляет активность белка FEM-3 посредством физического взаимодействия (35), мРНК fem- 3 негативно регулируется через 3 ‘UTR ( 36), и мы обнаружили, что fem-3 также транскрипционно репрессируется с помощью TRA-1. Следовательно, fem-3 , по-видимому, является важным узлом для контроля пути определения пола. Обратная связь от TRA-1 может служить как минимум двум целям. Во-первых, мы предполагаем, что это делает глобальное решение об определении пола более надежным и помогает обеспечить скоординированное выполнение последующих событий половой дифференциации.Во-вторых, петли обратной связи могут предоставлять дополнительные входные данные для управления временным переключением определения пола с женского на мужской, которое происходит у гермафродитных видов во время развития зародышевой линии.

Определенные нами сайты связывания TRA-1 предоставляют ресурсы для идентификации и функционального определения набора генов, контролирующих половую дифференциацию нематод. Ограниченные специфические для мужчин паттерны экспрессии и ограниченные специфические для самцов дефекты развития предполагаемых генов-мишеней согласуются с точкой зрения, что TRA-1 контролирует половое развитие, регулируя множество второстепенных игроков в развитии мужчин, а не нескольких основных.Для полной оценки роли, которую эти гены-кандидаты могут играть в половом развитии, важно изучить возможные функциональные совпадения, такие как те, которые происходят между mab-3 и dmd-3 (10), а также выполнить фенотипический анализ на сенсибилизированном фоне и в более мелком масштабе.

Пути определения пола накладывают половую специфичность на пространственный и временной контроль развития у животных с различным строением тела, поведением и физиологией.Сохранение связывания TRA-1 между C. elegans и C. briggsae предполагает существенное эволюционное сохранение полового развития у нематод. Однако TRA-1 является одним из наиболее быстро развивающихся генов у Caenorhabditids (37), и его ортологи, по-видимому, не регулируют определение пола за пределами нематод. Гены DMRT (ортологи TRA-1 нацелены на mab-3 , mab-23 и dmd-3 ) определяют пол у многих других животных, включая насекомых и позвоночных (38).Таким образом, сравнение того, как гены TRA-1 и DMRT накладывают половую специфичность на развитие, может пролить свет на эволюцию полового развития у многоклеточных животных.

Материалы и методы

Штаммы и культура червей.

Следующие штаммы и аллели были получены из Центра генетики Caenorhabditis : дикого типа C. elegans (N2), дикого типа C. briggsae (AF16), LG I: spe-11 (hc77 ) , glp-4 (bn2) , LG II: rrf-3 (pk1426) , LG III: tra-1 (e1834), LG IV: him-8 (e1489) , hT2 [ bli-4 (e937) let -? ( q782 ) qIs48] (I; III).Животных содержали в чашках со средой для выращивания нематод с добавленными бактериями ( Escherichia coli , штамм OP50) при 22 90 247 ° 90 248 ° C, если не указано иное.

ChIP-seq и биоинформатический анализ.

Подробное описание приведено в SI Материалы и методы . Необработанные данные секвенирования и обработанные данные для визуализации в браузере генома доступны на веб-сайте Gene Expression Omnibus (GEO), www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, под идентификатором доступа GSE48917.

Экспрессионный анализ.

Области от 500 до 1000 пар оснований, окружающие сайты связывания TRA-1, были клонированы в pPD107.94 (39). Репортеры ∆TRA-1 были созданы путем замены инвариантного GG в консенсусном связывающем мотиве gggtGGtc на AA с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза Agilent QuikChange XL. FEM-3 :: GFP был создан путем рекомбинации фосмиды WRM067dB02 в соответствии с исх. 40, с кодирующей последовательностью gfp , заменяющей стоп-кодон fem-3 . FEM-3 :: GFP ∆TRA-1 также был получен путем рекомбинирования согласно ссылке.40, сделав такое же изменение, как описано выше. В репортерные конструкции вводили str-1 :: gfp в качестве маркера коинъекции (5–20 нг / мкл репортера, 20 нг / мкл str-1 :: gfp и срезали геномную ДНК N2 до 100 нг / мкл в целом). ДНК) на хим-8 (e1489) животных. Стабильные трансгенные линии анализировали на экспрессию gfp .

РНКи.

хим-8 (э1489) ; rrf-3 (pk1426) животных использовали для всех экспериментов с РНКи, которые проводили в соответствии со стандартом C.elegans протокол кормления РНКи (wormbook.org). Животных-гермафродитов L4 помещали на стандартные планшеты для РНКи, и их потомство оценивали с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии на дефекты полового развития.

Окрашивание антителами FEM-3.

Окрашивание антител осуществляли, как описано в ссылке. 41. Животные дикого типа были проанализированы как молодые взрослые особи. ПЭМ-3, исх. 15 антитело использовали в разведении 1: 200.

Благодарности

Мы благодарим коллег из D.Z. и Центр биологии развития Университета Миннесоты за полезные обсуждения, Дэвида Гринштейна за критическое прочтение рукописи, Петра Мичковски и Хеманта Келкара за высокопроизводительное секвенирование, Брента Чена за создание библиотеки секвенирования и Андреа Калис за гелевый сдвиг. эксперимент. Некоторые штаммы были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры Национального института здравоохранения (NIH), грантом OD010440.Эта работа была поддержана грантами NIH GM53099, HG004270, GM98200, HD007480 и RR026341.

Сноски

Авторы: M.B., K.I., S.A., J.D.L. и D.Z. спланированное исследование; M.B., K.I. и S.A. проводили исследования; M.B., K.I. и S.A. предоставили новые реагенты / аналитические инструменты; M.B., K.I., S.A., J.D.L. и D.Z. проанализированные данные; и M.B., K.I., J.D.L. и D.Z. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
↵ * Для этой статьи с прямым представлением был назначен редактор.
Размещение данных: данные, представленные в этой статье, были депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO), www.ncbi.nlm.nih.gov/geo (инвентарный номер GSE48917).
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1312087110/-/DCSupplemental.

Целевая оценка рисков (TRA) — Ecetoc

Инструмент целевой оценки рисков (TRA)

ECETOC рассчитывает риск воздействия химических веществ на рабочих, потребителей и окружающую среду.Он был определен Регламентом Европейской комиссии о регистрации, оценке, разрешении и ограничении использования химических веществ (REACH) как предпочтительный подход для оценки рисков для здоровья потребителей и работников (ECHA, 2010 a, b).

В ответ на отзывы, полученные от пользователей TRA, ECETOC дополнительно улучшил потребительскую часть модели, добавив возможность учитывать нечастое использование потребительских товаров. Изменения, которые были разработаны в сотрудничестве с ECHA, находятся в текущей версии 3.1 TRA, а также находятся в Chesar, начиная с версии 2.3 (https://chesar.echa.europa.eu).

Подробное объяснение причин изменений содержится в Приложении к Техническому отчету 114 ECETOC (опубликованному как Технический отчет ECETOC № 124), в котором дается дальнейшее разъяснение того, как ECETOC применил «коэффициенты передачи» в прогнозе TRA устного воздействие на кожу и при вдыхании. Эти улучшения теперь позволяют использовать информацию, содержащуюся в таких разработках, как Специфические детерминанты воздействия на потребителя DUCC (http: // www.ducc.eu/Activities.aspx) для соответствующей обработки.

Обновление до версии 3.1 было использовано как повод для включения обновленного списка конкретных классов экологических выбросов (SpERC) и улучшений функциональных возможностей, предлагая экспорт и импорт наборов данных по отдельным веществам. Версия 3.1 доступна как в виде интегрированной модели, так и в виде отдельной версии для потребительской части, и ее можно загрузить здесь вместе с обновленными руководствами пользователя для этих инструментов и техническими отчетами ECETOC TRA.

ECHA. 2010 ^_a. Техническое руководство REACH по требованиям к информации и оценке химической безопасности, Глава R14: Оценка воздействия на рабочем месте. Европейское химическое агентство, Хельсинки, Финляндия.

ECHA. 2010 г. ^б. Руководство по требованиям к информации и оценке химической безопасности, Глава R15: Оценка воздействия на потребителей (Версия 2, апрель 2010 г.). Европейское химическое агентство, Хельсинки, Финляндия. Приложение к TR114: Техническая основа для TRA v3.1 (июнь 2014 г.)

Группа пользователей TRA в Linked In

Крио-ЭМ структура субъединицы коактиватора SAGA и NuA4 Tra1 при разрешении 3,7 ангстрем

Коактиваторы гораздо менее многочисленны, чем активаторы, и представляют собой центры регуляции транскрипции. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе функции коактиватора, необходимо для выяснения того, как устанавливаются сложные программы экспрессии генов. Хотя SAGA и NuA4 хорошо охарактеризованы с точки зрения их ферментативной активности и локализации в геноме, их взаимодействие с активаторами плохо изучено.Tra1 был идентифицирован как ключевая мишень активатора, но молекулярные детали его взаимодействия с активаторами и его родительскими комплексами еще предстоит определить. Чтобы получить представление об этом аспекте функции коактиватора, мы определили структуру Tra1 с помощью крио-ЭМ и построили атомарную модель полного белка, позволяющую картировать мутации, разрушающие активатор, в структуре и выделять потенциальные сайты связывания TAD. Модель также однозначно вписалась в существующую реконструкцию SAGA, чтобы выявить ее интерфейс связывания и интеграцию в комплекс.

Интеграция Tra1 в SAGA оставляет Tra1 относительно беспрепятственным для связывания активатора, поскольку его взаимодействие закрывает очень мало его доступной для растворителя поверхности. Точно так же, поскольку его конформация в SAGA кажется неизменной по сравнению с апо-Tra1 (видео 1), это предполагает, что активаторы не могут отличить SAGA от NuA4 через нацеливание только на Tra1, а другие субъединицы, специфичные для SAGA, могут действовать как дополнительные мишени активатора и обеспечивать специфичность, например, многочисленные активаторы могут напрямую нацеливаться на субъединицы SAGA Gcn5, Ada1, Taf6 и Taf12 (Klein et al., 2003; Ривз и Хан, 2005; Zhang et al., 2014). Возможно, что представление Tra1 с помощью NuA4 может ограничивать или изменять его связывание с активаторами по сравнению с SAGA, но это еще предстоит определить; Визуальное сравнение наших средних значений класса Tra1 2D со средними значениями из ранее определенной крио-ЭМ реконструкции NuA4 (Chittuluru et al., 2011) (рисунок 3 — приложение к рисунку 1) показывает, что весь NuA4 полностью соответствует Tra1 по внешнему виду, что указывает на то, что остальные субъединицы NuA4 очень динамичны и / или диссоциировали при реконструкции.Поскольку эндогенная очистка NuA4 не приводит к совместной очистке субъединиц SAGA (и наоборот), Tra1 вряд ли соединит два коактиватора в единый комплекс, а его присутствие в отдельных коактиваторах может быть результатом перекрывания сайтов контакта как с SAGA, так и с NuA4, что исключает возможность их сборка вокруг одной и той же молекулы Tra1. Следовательно, контактные сайты SAGA, идентифицированные в Tra1, могут также использоваться для взаимодействий NuA4, что поддерживается делеционными мутациями в Tra1, которые одновременно вызывают дефекты сборки SAGA и NuA4 (Knutson and Hahn, 2011).

Мутации, которые нарушают взаимодействие Tra1 с Gal4, Gcn4, Rap1 и VP16, распространяются по Tra1, располагаются в областях Finger, Ring и Head и преимущественно находятся на удалении от интерфейса с SAGA. Однако точный механизм разрушения остается неизвестным; а также, в частности, устранение интерфейса Tra1-активатор, эти мутации могут также вызывать аллостерические изменения, влиять на стабильность белка или некоторые их комбинации. Тем не менее, 4/5 аминокислотных замен, которые нарушают взаимодействие с Gal4, расположены в пальце на участках, подверженных воздействию растворителя, а три пространственно проксимальны друг к другу (D397N / h500Y / S404F) (Рисунок 4), что убедительно свидетельствует о наличии прямого интерфейса Gal4.Кроме того, из трех делеционных мутантов, которые влияют на Gcn4 и Rap1, два также расположены в Finger, рядом с интерфейсом Gal4 на его N-концевой стороне (h4 и H6-H7), поэтому мы предполагаем, что Finger может функционировать как платформа. для взаимодействия с несколькими активаторами. Палец вряд ли будет единственным сайтом взаимодействия активатора, учитывая расположение третьего мутанта с делецией в кольце (проксимальнее головы в h35-h36), кластеризацию мутаций, которые влияют на взаимодействие с VP16 внутри головы, и Взаимодействие in vitro между С-концевым фрагментом Tra1 и VP16 (Brown et al., 2001). Важнейшей особенностью этих мутаций является способность разрушать определенные активаторы, не затрагивая другие, т.е. мутации, которые нарушают взаимодействие Gal4 с Tra1, не влияют на Gcn4 (Lin et al., 2012) и наоборот (Knutson and Hahn, 2011). Напротив, мутации, которые влияют на Gcn4, также влияют на Rap1, указывая на то, что эти активаторы нацелены на Tra1 аналогичным образом. Хотя нельзя исключить аллостерические эффекты, самый простой механизм состоит в том, что Tra1 имеет несколько интерфейсов для активаторов, которые могут быть специфичными для отдельных активаторов (Gal4) или связывать несколько активаторов (Gcn4 и Rap1).Таким образом, наличие нескольких интерфейсов обеспечивает механизм для Tra1 интеграции сигналов от активаторов, позволяя нескольким активаторам взаимодействовать при стимуляции транскрипции. Индивидуальные сайты связывания также могут различаться по аффинности и кинетике взаимодействия, дополнительно регулируя силу активации транскрипции. Также можно предположить более сложные механизмы, такие как конкуренция между различными активаторами за один и тот же сайт связывания или аллостерические изменения при связывании активатора, которые изменяют его взаимодействие с другими активаторами и / или компонентами коактиватора.Хотя Tra1 не нуждается в конформационных изменениях, чтобы соответствовать SAGA (Figure 3), белки с повторами HEAT очень гибкие (Kappel et al., 2010) и Tra1 может претерпевать конформационные изменения при взаимодействии с др. Факторами, такими как активаторы. В этом отношении N-концевая часть пальца является наиболее структурно динамичной частью Tra1 (рисунок 1 — рисунок в приложении 4B) и имеет обширные контакты с кольцом, поэтому связывание активатора в этом месте может вызывать конформационные изменения и стимулировать аллостерические изменения. внутри Tra1, который может оказывать влияние на его родительский комплекс модификации гистонов.

Замечательная и неожиданная структурная гомология с фактором репарации ДНК DNA-PKcs предполагает, что Tra1 играет роль за пределами активации транскрипции. У дрожжей отсутствует гомолог ДНК-PKcs, а родительский комплекс Tra1 NuA4 необходим для репарации двухцепочечных разрывов (DSB) (Bird et al., 2002), поэтому есть соблазн предположить, что Tra1 может иметь функциональное сходство с ДНК-PKcs и прямая роль в репарации ДНК. DNA-PKcs опосредует лигирование двухцепочечных разрывов (DSB) путем образования синаптического комплекса с Ku70-Ku80 и выравнивания разорванных концов ДНК, после чего его киназа становится активной и координирует дальнейшую сборку механизма репарации (Dobbs et al., 2010). Хотя Tra1 не обладает киназной активностью, которая имеет решающее значение для функции ДНК-PKcs (Chen et al., 2005; Cui et al., 2005), структурная гомология между Tra1 и ДНК-PKcs предполагает, что Tra1 может сохранять некаталитические свойства ДНК-PKcs в связывании нуклеиновых кислот и / или привлечении дополнительных факторов репарации. Рекрутирование активных киназ может затем заменить отсутствие каталитической активности Tra1, такой как ATM, который взаимодействует с Tip60 (человеческий гомолог NuA4) в клетках человека (Sun et al., 2005).Хотя прямая роль в репарации ДНК остается предположительной, связи между Tra1 и повреждением ДНК уже хорошо установлены, поскольку истощение TRRAP ставит под угрозу репарацию DSB (Murr et al., 2006; Robert et al., 2006), и задействуется его родительский комплекс Tip60. к DSBs TRRAP-зависимым образом (Murr et al., 2006), что приводит к ацетилированию h5, которое облегчает репарацию. TRRAP также образует комплекс с комплексом MRE11, RAD50 и NBS1 (MRN) (Robert et al., 2006), ключевым датчиком DSB, который также привлекает ATM члена семейства PIKK к участкам DSB (Falck et al., 2005). Таким образом, MRN может функционировать аналогично Ku70-Ku80, который рекрутирует ДНК-PKcs в сайты DSB. Кроме того, NuA4 может распознавать DSB напрямую (Bird et al., 2002), а SAGA и NuA4 предпочтительно ацетилируют концы линейной матрицы хроматина (Vignali et al., 2000), следовательно, Tra1 может обеспечивать эту способность распознавания, учитывая его гомологию с ДНК. -PKcs, который имеет сродство к концам ДНК (Gottlieb and Jackson, 1993).

Как прямая мишень для множества активаторов и как общий компонент SAGA и NuA4, Tra1 играет центральную роль в регуляции транскрипции.Однако его размер и присутствие в дополнительных комплексах, связанных с хроматином, а также его гомология с ДНК-PKcs указывают на роль, выходящую за рамки нацеливания на активатор. Представленная здесь структура является важным шагом на пути к раскрытию этих ролей, и дальнейшие структурные и биохимические исследования Tra1, связанного с активаторами и / или его родительскими комплексами, выявят новые механизмы его функций.

Руководство по торговле (TAA и TRA) COVID-19-Q&A

State Staffing Flexibility, подразумевает, что все права на получение помощи по перестройке торговли (TRA) должны следовать за исчерпанием статуса пособия по пандемической безработице (PUA).Означает ли это, что право на участие в программе PUA снижает максимальное право на получение TRA, как это предусмотрено в 20 CFR 617.14?

ОТВЕТ НА ОТВЕТ № 23

Нет. Право на участие в программе PUA не уменьшает максимальное право на получение TRA, предусмотренное 20 CFR 617.14.

Закон о торговле с поправками и нормативная ссылка в 20 CFR 617.14 требуют, чтобы максимальная сумма TRA, подлежащая уплате, была уменьшена на сумму UI, доступную физическому лицу, включая:

Регулярная компенсация;
Расширенная компенсация; и
Федеральная дополнительная компенсация (включая компенсацию по безработице в связи с пандемией только в первый период выплаты пособия СП).

Право на участие в программе PUA похоже на пособие по безработице в случае стихийных бедствий (DUA), как будет объяснено позже, и не включено в применимые сокращения для TRA. Хотя правила определяют право ИП, включая дополнительную компенсацию, выплачиваемую в соответствии с законодательством штата, оно не применяется с момента вступления в силу поправок 2002 года к Закону. Любые применимые сокращения максимального права на TRA применимы только к Basic TRA.

Дополнительные и / или завершенные TRA оплачиваются за определенное количество недель, чтобы помочь человеку пройти полное обучение TAA.Любое право на UI, доступное физическому лицу в течение периода, в течение которого оплачиваются дополнительные и / или завершенные TRA, только приостанавливает право на получение TRA. Это не уменьшает максимальное количество недель, оплачиваемых за Дополнительный и / или Завершенный TRA. В соответствии с законодательством штата, еженедельная сумма, подлежащая выплате, может быть уменьшена в результате пенсии или другого дисквалифицирующего дохода.

Право на участие в программе

PUA, аналогичное праву на участие в программе DUA, как предусмотрено в 20 CFR 625.4 (i), требует, чтобы данное лицо не имело права на «компенсацию», как определено в 20 CFR 625.2 (г). «Компенсация» в соответствии с правилами DUA, которые также регулируют PUA, включает любую компенсацию по безработице, как определено в разделе 85 (b) Налогового кодекса 1986 года, а также обычную компенсацию, дополнительную компенсацию, расширенную компенсацию, федеральную дополнительную компенсацию , и выплаты по инвалидности. Кроме того, сюда входят пособия по страхованию от безработицы на железных дорогах и TRA. Это устанавливает DUA и PUA в качестве платежа последней инстанции, так что существует чрезвычайно ограниченная возможность для DUA и PUA быть оплаченным до TRA.

Лицо, получающее базовый TRA, чье обучение TAA было прервано по причине, связанной с COVID-19, может продолжить получать базовый TRA, как предусмотрено в 20 CFR 617.18 (b) (2), если прекращение такого обучения вызвано уважительной причиной. Лицо, чье обучение, утвержденное TAA, было прервано по причине, связанной с COVID-19, не может получить дополнительный / завершенный TRA, потому что эти преимущества требуют «фактического» участия в обучении TAA. Последний человек может иметь право на получение пособия PUA, но, как объяснялось выше, право на получение PUA не влияет на TRA.

Общие сведения об алмазных терморезисторах ТРА-1 и ТРА-2

Уникальные особенности конструкции ТРА-1 и ТРА-2

Технические характеристики алмазных терморезисторов

Особенности эксплуатации ТРА-1 и ТРА-2

Математическое описание характеристик терморезисторов

Применение ТРА-1 и ТРА-2 в различных областях

Рекомендации по монтажу и эксплуатации

Сравнение ТРА-1 и ТРА-2 с другими типами терморезисторов

Алмазные терморезисторы ТРА-1, ТРА-2, характеристики и описание

Основные технические характеристики

Преобразователь DC-DC модульный TRACO POWER TRA 1-0511

Основные характеристики

Входные характеристики

Выходные характеристики

Входные разъемы

Выходные разъемы

Защита и фильтрация

Параметры окружающей среды

Физические характеристики

Прочие характеристики

Ссылки

Техническо-распорядительный акт (ТРА) станции — orgperevozok.ru

TRA-1 | SFERE | UNIS Group

Параметры конфиденциальности

Этот веб-сайт будет

Этот сайт не будет

Этот веб-сайт будет

Этот сайт не будет

Этот веб-сайт будет

Этот сайт не будет

Этот веб-сайт будет

Этот сайт не будет

FESTOOL 203813 — MINI-Systainer T-LOC SYS-MINI 1 TL TRA

Рецензии MINI-Systainer T-LOC SYS-MINI 1 TL TRA

Похожие на FESTOOL 203813

Антитело против человеческого TRA-1-60, клон TRA-1-60R

Обзор

Научные ресурсы

Документация по продукту

Учебные материалы (3)

Приложения для продуктов

Данные и публикации

Данные

Публикации (1)

Аннотация

Антитело против человеческого TRA-1-81, клон TRA-1-81

Обзор

Научные ресурсы

Документация по продукту

Учебные материалы (3)

Приложения для продуктов

Данные и публикации

Данные

специфичность связывания маркерных антител Tra-1-60 и Tra-1-81 выявляет новый ассоциированный с плюрипотентностью лактозаминный эпитоп типа 1 | Гликобиология

Аннотация

Введение

Результаты

Моноклональные антитела Tra-1-60 и Tra-1-81 окрашивают недифференцированные hESC чувствительным к β1,3-галактозидазе способом

Моноклональные антитела Tra-1-60 и Tra-1-81 специфически связываются с эпитопом лактозамина 1 типа

hESC

Обсуждение

Материалы и методы

Клеточные линии и культура клеток

Моноклональные антитела

Обработка клеток гликозидазой

Проточная цитометрия

Набор гликанов

Финансирование

Конфликт интересов

Сокращения

Благодарности

Список литературы

TRA-1 ChIP-seq выявляет регуляторы половой дифференциации и многоуровневую обратную связь в определении пола нематод.

Значимость

Abstract

Результаты

Ассоциация хроматина TRA-1 демонстрирует временную и тканевую специфичность.

Гены-мишени TRA-1 участвуют в специфическом половом развитии мужчин.

TRA-1 связывает и регулирует экспрессию генов, контролирующих время развития.

TRA-1 возвращается на путь определения пола на нескольких уровнях.