Что такое стабилитрон Д816Б. Каковы его основные характеристики. Где применяется стабилитрон Д816Б. Как работает стабилитрон Д816Б. В чем особенности данного полупроводникового прибора.
Общая характеристика стабилитрона Д816Б
Стабилитрон Д816Б представляет собой кремниевый полупроводниковый диод средней мощности, предназначенный для стабилизации напряжения. Основные характеристики данного прибора:
- Напряжение стабилизации: 27 В
- Максимальный ток стабилизации: 180 мА
- Минимальный ток стабилизации: 10 мА
- Рассеиваемая мощность: 5 Вт
- Температурный диапазон: от -60°C до +130°C
- Корпус: металлостеклянный с жесткими выводами
Стабилитрон Д816Б относится к серии стабилитронов Д816, которая включает также модификации Д816А, Д816В, Д816Г и Д816Д, отличающиеся напряжением стабилизации.
Принцип действия стабилитрона Д816Б
Работа стабилитрона Д816Б основана на эффекте электрического пробоя p-n перехода при обратном включении. При повышении обратного напряжения до определенного значения (напряжения стабилизации) в p-n переходе возникает лавинный пробой, при котором ток резко возрастает, а напряжение остается практически неизменным.
Данный эффект позволяет поддерживать постоянное напряжение на стабилитроне в широком диапазоне токов. Для Д816Б напряжение стабилизации составляет 27 В в диапазоне токов от 10 до 180 мА.
Основные области применения стабилитрона Д816Б
Стабилитрон Д816Б находит применение в следующих областях:
- Стабилизация напряжения в источниках питания
- Ограничение напряжения для защиты электронных схем
- Формирование опорного напряжения в измерительных приборах
- Создание параметрических стабилизаторов напряжения
- Фиксация уровней сигналов в импульсных схемах
Благодаря достаточно высокой мощности рассеивания (5 Вт) стабилитрон Д816Б может использоваться в силовых цепях маломощной радиоаппаратуры.
Особенности конструкции стабилитрона Д816Б
Стабилитрон Д816Б выполнен в металлостеклянном корпусе, что обеспечивает следующие преимущества:
- Высокая механическая прочность
- Хороший отвод тепла
- Возможность работы при высоких температурах (до +130°C)
- Герметичность и защита от влаги
- Устойчивость к вибрациям и ударам
Корпус стабилитрона является отрицательным электродом (катодом). Это позволяет напрямую крепить стабилитрон к радиатору для лучшего теплоотвода.
Сравнение стабилитрона Д816Б с аналогами
Рассмотрим основные характеристики Д816Б в сравнении с другими стабилитронами серии Д816:
| Параметр | Д816А | Д816Б | Д816В | Д816Г | Д816Д |
|---|---|---|---|---|---|
| Напряжение стабилизации, В | 22 | 27 | 33 | 39 | 47 |
| Максимальный ток стабилизации, мА | 230 | 180 | 150 | 130 | 110 |
| Минимальный ток стабилизации, мА | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Мощность рассеивания, Вт | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
Как видно, стабилитрон Д816Б занимает промежуточное положение по напряжению и току стабилизации, что делает его универсальным прибором для различных применений.
Особенности эксплуатации стабилитрона Д816Б
При использовании стабилитрона Д816Б следует учитывать некоторые важные моменты:
- Необходимо обеспечить ток через стабилитрон в диапазоне от 10 до 180 мА
- Рекомендуется использовать радиатор для отвода тепла при токах более 50-70 мА
- Напряжение на стабилитроне не должно превышать 33 В
- При последовательном соединении нескольких стабилитронов суммарное напряжение не должно превышать 1000 В
- Недопустимо прямое включение стабилитрона
Соблюдение этих правил обеспечит надежную и долговременную работу стабилитрона Д816Б в различных электронных устройствах.
Маркировка и внешний вид стабилитрона Д816Б
Стабилитрон Д816Б имеет следующую маркировку на корпусе:
- Буквенно-цифровое обозначение: Д816Б
- Цветовая маркировка: две полосы — красная и зеленая
- Знак полярности: «+» у анодного вывода
Внешний вид представляет собой цилиндрический металлический корпус диаметром около 9 мм и длиной 16 мм с двумя жесткими выводами. Анодный вывод расположен со стороны, противоположной плоскости крепления корпуса.
Заключение о применении стабилитрона Д816Б
Стабилитрон Д816Б является надежным и проверенным временем полупроводниковым прибором для стабилизации напряжения. Его основные преимущества:
- Стабильное напряжение 27 В в широком диапазоне токов
- Высокая мощность рассеивания (5 Вт)
- Прочная конструкция и широкий температурный диапазон
- Доступность и низкая стоимость
Эти качества делают Д816Б востребованным компонентом для разработки источников питания, измерительной аппаратуры и другой радиоэлектронной техники, где требуется надежная стабилизация напряжения.
Стабилитрон Д816 — DataSheet
Перейти к содержимому
Корпус стабилитронов Д816, Д816, Д817
Описание
Стабилитроны кремниевые, диффузионно-сплавные, средней и большой мощности. Предназначены для стабилизации номинального напряжения 5, 6…100 В в диапазоне токов стабилизации 5 мА…1,4 А. Выпускаются в металлостеклянном корпусе с жесткими выводами. Тип стабилитрона приводится на корпусе. Корпус стабилитрона в рабочем режиме служит отрицательным электродом (катодом). Масса стабилитрона с комплектующими деталями не более 6 г.
Стабилитрон должен крепиться к теплоотводящему радиатору, обеспечивающему сохранение температуры корпуса при работе не выше +130 °С Рекомендуется применение алюминиевого радиатора черного цвета толщиной 3…4 мм, площадью не менее 100 см 2. При креплении стабилитрона к радиатору крутящий момент, воздействующий на вывод катода, не должен превышать 1,17 Н·м. Запрещается прилагать к анодному выводу растягивающую силу более 14,7 Н и изгибающее усилие, превышающее 7,35 Н·м в месте просечки.
Пайка анодного вывода допускается не ближе 5 мм от корпуса; время пайки не более 3 с при температуре жала паяльника не выше +280 °С.
Допускается последовательное соединение любого числа стабилитронов. Параллельное включение стабилитронов разрешается при условии, что суммарная рассеиваемая на всех стабилитронах мощность не превышает допустимую для одного стабилитрона.
| Обозначение | Значение для: | Ед. изм. | |||||
| Д816А | Д816Б | Д816В | Д816Г | Д816Д | |||
| Аналог | — | — | — | — | — | — | |
| Uст | мин. | 19.6 | 24.2 | 29.5 | 35 | 42.5 | В |
| ном. | — | — | — | — | — | ||
| макс. | 29.5 | 36 | 51.5 | ||||
| при Iст | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 | мА | |
| αUст | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | %/°C | |
| δUст | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | % | |
| Uпр (при Iпр, мА) | 1.5 (500) | 1.5 (500) | 1.5 (500) | 1.5 (500) | 1.5 (500) | В | |
| rст (при Iст, мА) | 7 (150) | 8 (150) | 10 (150) | 12 (150) | 15 (150) | Ом | |
| Iст | мин. | 10 | 10 | 10 | 10 | мА | |
| макс. | 230 | 180 | 150 | 130 | 110 | ||
| Pпp | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | Вт | |
| T | -60…+130 | -60…+130 | -60…+130 | -60…+130 | -60…+130 | °C | |
«>
«>24.2
«>
- Uст — Напряжение стабилизации.
- αUст — Температурный коэффициент напряжения стабилизации.
- δUст — Временная нестабильность напряжения стабилизации.
- Uпр — Постоянное прямое напряжение.
- Iпр — Постоянный прямой ток.
- rст — Дифференциальное сопротивление стабилитрона.
- Iст — Ток стабилизации.
- Pпp — Прямая рассеиваемая мощность.
- T — Температура окружающей среды.
Зависимость максимальной рассеиваемой мощности от температуры | Зависимость максимального тока стабилизации от температуры |
Зависимость максимального тока стабилизации от температуры | Зависимость максимального тока стабилизации от температуры |
| Зависимость дифференциального сопротивления от тока стабилизации | |
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Д816А, Д816АП, Д816Б, Д816БП, Д816В, Д816ВП, Д816Г, Д816ГП, Д816Д, Д816ДП
Стабилитроны кремниевые диффузионные: Д816А, Д816АП, Д816Б, Д816БП, Д816В, Д816ВП, Д816Г, Д816ГП, Д816Д, Д816ДП. Выпускаются в металлостеклянном корпусе с жёсткими выводами. У стабилитронов, в обозначении которых отсутствует буква П, корпус является отрицательным электродом. У стабилитронов, имеющих в обозначении букву П, полярность обратная. Масса стабилитрона не более 6 граммов. Чертёж стабилитрона Д816А, Д816АП, Д816Б, Д816БП, Д816В, Д816ВП, Д816Г, Д816ГП, Д816Д, Д816ДП Электрические параметры.
Предельные эксплуатационные данные Д816А, Д816АП, Д816Б, Д816БП, Д816В, Д816ВП, Д816Г, Д816ГП, Д816Д, Д816ДП.
Зависимость дифференциального сопротивления от тока Зависимость дифференциального сопротивления от тока. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ном=150 мА
ном
Стабилитрон Д816Б
Количество драгоценных металлов в стабилитроне Д816Б согласно документации производителя. Справочник массы и наименований ценных металлов в советских стабилитронах Д816Б.
Стабилитрон Д816Б количество содержания драгоценных металлов:
Золото: 0,0004 грамм.
Серебро: 0 грамм.
Платина: 0 грамм.
Палладий: 0 грамм.
Согласно данным: .
Справочник содержания ценных металлов из другого источника:
Стабилитрон Д816Б 0,0004 0 0 0 троп. Стабилитрон Д816Б 0,0005 0 0 0 Из Перечней МЧС
Стабилитроны Д816Б теория
Полупроводниковый стабилитрон, или диод Зенера — полупроводниковый диод, работающий при обратном смещении в режиме пробоя. До наступления пробоя через стабилитрон протекают незначительные токи утечки, а его сопротивление весьма высоко. При наступлении пробоя ток через стабилитрон резко возрастает, а его дифференциальное сопротивление падает до величины, составляющей для различных приборов от долей Ома до сотен Ом.
Поэтому в режиме пробоя напряжение на стабилитроне поддерживается с заданной точностью в широком диапазоне обратных токов.
Прежде всего, не следует забывать, что стабилитрон работает только в цепях постоянного тока. Напряжение на стабилитрон подают в обратной полярности, то есть на анод стабилитрона будет подан минус “-“. При таком включении стабилитрона через него протекает обратный ток (I обр) от выпрямителя. Напряжение с выхода выпрямителя может изменяться, будет изменяться и обратный ток, а напряжение на стабилитроне и на нагрузке останется неизменным, то есть стабильным. На следующем рисунке показана вольт-амперная характеристика стабилитрона.
Основное назначение стабилитронов — стабилизация напряжения. Серийные стабилитроны изготавливаются на напряжения от 1,8 В до 400 В. Интегральные стабилитроны со скрытой структурой на напряжение около 7 В являются самыми точными и стабильными твердотельными источниками опорного напряжения: лучшие их образцы приближаются по совокупности показателей к нормальному элементу Вестона.
Особый тип стабилитронов, высоковольтные лавинные диоды («подавители переходных импульсных помех», «суппрессоры», «TVS-диоды») применяется для защиты электроаппаратуры от перенапряжений.
Стабилитроны Д816Б Принцип действия
Советские и импортные стабилитроны
Полупроводниковый стабилитрон — это диод, предназначенный для работы в режиме пробоя на обратной ветви вольт-амперной характеристики. В диоде, к которому приложено обратное, или запирающее, напряжение, возможны три механизма пробоя: туннельный пробой, лавинный пробой и пробой вследствие тепловой неустойчивости — разрушительного саморазогрева токами утечки. Тепловой пробой наблюдается в выпрямительных диодах, особенно германиевых, а для кремниевых стабилитронов он не критичен. Стабилитроны проектируются и изготавливаются таким образом, что либо туннельный, либо лавинный пробой, либо оба эти явления вместе возникают задолго до того, как в кристалле диода возникнут предпосылки к тепловому пробою. Серийные стабилитроны изготавливаются из кремния, известны также перспективные разработки стабилитронов из карбида кремния и арсенида галлия.
Первую модель электрического пробоя предложил в 1933 году Кларенс Зенер, в то время работавший в Бристольском университете. Его «Теория электического пробоя в твёрдых диэлектриках» была опубликована летом 1934 года. В 1954 году Кеннет Маккей из Bell Labs установил, что предложеный Зенером туннельный механизм действует только при напряжениях пробоя до примерно 5,5 В, а при бо́льших напряжениях преобладает лавинный механизм. Напряжение пробоя стабилитрона определяется концентрациями акцепторов и доноров и профилем легирования области p-n-перехода. Чем выше концентрации примесей и чем больше их градиент в переходе, тем больше напряжённость электрического поля в области пространственного заряда при равном обратном напряжении, и тем меньше обратное напряжение, при котором возникает пробой:
Туннельный, или зенеровский, пробой возникает в полупроводнике только тогда, когда напряжённость электрического поля в p-n-переходе достигает уровня в 106 В/см. Такие уровни напряжённости возможны только в высоколегированных диодах (структурах p+-n+-типа проводимости) с напряжением пробоя не более шестикратной ширины запрещённой зоны (6 EG ≈ 6,7 В), при этом в диапазоне от 4 EG до 6 EG (4,5…6,7 В) туннельный пробой сосуществует с лавинным, а при напряжении пробоя менее 4 EG (≈4,5 В) полностью вытесняет его.
С ростом температуры перехода ширина запрещённой зоны, а вместе с ней и напряжение пробоя, уменьшается: низковольтные стабилитроны с преобладанием туннельного пробоя имеют отрицательный температурный коэффициент напряжения (ТКН).
В диодах с меньшими уровнями легирования, или меньшими градиентами легирующих примесей, и, как следствие, бо́льшими напряжениями пробоя наблюдается лавинный механизм пробоя. Он возникает при концентрациях примесей, примерно соответствующих напряжению пробоя в 4 EG (≈4,5 В), а при напряжениях пробоя выше 4 EG (≈7,2 В) полностью вытесняет туннельный механизм. Напряжение, при котором возникает лавинный пробой, с ростом температуры возрастает, а наибольшая величина ТКН пробоя наблюдается в низколегированных, относительно высоковольтных, переходах.
Механизм пробоя конкретного образца можно определить грубо — по напряжению стабилизации, и точно — по знаку его температурного коэффициента. В «серой зоне» (см. рисунок), в которой конкурируют оба механизма пробоя, ТКН может быть определён только опытным путём.
Источники расходятся в точных оценках ширины этой зоны: С. М. Зи указывает «от 4 EG до 6 EG» (4,5…6,7 В), авторы словаря «Электроника» — «от 5 до 7 В»8, Линден Харрисон — «от 3 до 8 В»26, Ирвинг Готтлиб проводит верхнюю границу по уровню 10 В9. Низковольтные лавинные диоды (LVA) на напряжения от 4 до 10 В — исключение из правила: в них действует только лавинный механизм.
Оптимальная совокупность характеристик стабилитрона достигается в середине «серой зоны», при напряжении стабилизации около 6 В. Дело не столько в том, что благодаря взаимной компенсации ТКН туннельного и лавинного механизмов эти стабилитроны относительно термостабильны, а в том, что они имеют наименьший технологический разброс напряжения стабилизации и наименьшее, при прочих равных условиях, дифференциальное сопротивление. Наихудшая совокупность характеристик — высокий уровень шума, большой разброс напряжений стабилизации, высокое дифференциальное сопротивление — свойственна низковольтным стабилитронам на 3,3—4,7 В.
Область применения стабилитрона Д816Б
Основная область применения стабилитрона — стабилизация постоянного напряжения источников питания. В простейшей схеме линейного параметрического стабилизатора стабилитрон выступает одновременно и источником опорного напряжения, и силовым регулирующим элементом. В более сложных схемах стабилитрону отводится только функция источника опорного напряжения, а регулирующим элементом служит внешний силовой транзистор.
Прецизионные термокомпенсированные стабилитроны и стабилитроны со скрытой структурой широко применяются в качестве дискретных и интегральных источников опорного напряжения (ИОН), в том числе в наиболее требовательных к стабильности напряжения схемах измерительных аналого-цифровых преобразователей. C середины 1970-х годов и по сей день (2012 год) стабилитроны со скрытой структурой являются наиболее точными и стабильными твердотельными ИОН. Точностные показатели лабораторных эталонов напряжения на специально отобранных интегральных стабилитронах приближаются к показателям нормального элемента Вестона.
Особые импульсные лавинные стабилитроны («подавители переходных импульсных помех», «суппрессоры», «TVS-диоды») применяются для защиты электроаппаратуры от перенапряжений, вызываемых разрядами молний и статического электричества, а также от выбросов напряжения на индуктивных нагрузках. Такие приборы номинальной мощностью 1 Вт выдерживают импульсы тока в десятки и сотни ампер намного лучше, чем «обычные» пятидесятиваттные силовые стабилитроны. Для защиты входов электроизмерительных приборов и затворов полевых транзисторов используются обычные маломощные стабилитроны. В современных «умных» МДП-транзисторах защитные стабилитроны выполняются на одном кристалле с силовым транзистором.
Маркировка стабилитронов Д816Б
Маркировка стабилитронов
Есть информация о стабилитроне Д816Б – высылайте ее нам, мы ее разместим на этом сайте посвященному утилизации, аффинажу и переработке драгоценных и ценных металлов.
Фото Стабилитрон Д816Б:
Предназначение Стабилитрон Д816Б.
Характеристики Стабилитрон Д816Б:
Купить или продать а также цены на Стабилитрон Д816Б (стоимость, купить, продать):
Отзыв о стабилитроне Д816Б вы можете в комментариях ниже:
- Стабилитроны
Автоматическое зарядное устройство для кислотных аккумуляторов
Описываемый ниже автомат предназначен для обслуживания двенадцативольтовых кислотных аккумуляторных батарей. Он может быть использован и как мощный источник переменного напряжения 12 В для питания вулканизаторов, переносных ламп и другого оборудования.
Основные характеристики автомата
- Ток зарядки на пределе 5 А 5,8 — 4,5;
- Ток зарядки на пределе 2 А 2 — 1,5;
- Ток разрядки, А 2 — 1,5;
- Мощность, потребляемая от сети переменного тока в режиме зарядки, Вт, не более 150;
- Ток, потребляемый автоматом от заряжаемой батареи по окончании цикла зарядки, мА, не более 17;
- Мощность, потребляемая нагрузкой с гнезда «12 В». Вт, не более 80.
Вт, не более 80.Автомат может работать в одном из трех режимов: двух автоматических — «АП», «КТЦ» или ручном «РУЧН».
Режим автоматической подзарядки «АП» — предназначен для автоматической подзарядки батареи. В его основу положена функциональная зависимость напряжения на зажимах батареи от степени её заряженности. При достижении напряжения 14,6 -14.8 В автомат отключится от сети. Цикл зарядки повторится, если напряжение батареи станет ниже 12,8 — 13 В.
Режим «КТЦ» — контрольно-тренировочный цикл — предназначен для десульфатации пластин батареи. Он представляет собой многократное чередование режимов зарядки до напряжения 14,6 — 14,8 В и разрядки до 10,6 — 10,8 В.
В автоматических режимах устройство не боится замыкания выходной цепи при отключенной батарее.
В ручном режиме «РУЧН» автомат используют в качестве обычного зарядного устройства.
Принципиальная схема
Узел стабилизации и ограничения зарядного тока выполнен на нелинейных элементах — лампах накаливания HL1 — HL3, включенных последовательно с заряжаемой батареей.
При увеличении, например, тока зарядки сопротивление нитей ламп увеличивается, препятствуя изменению тока. Требуемое значение зарядного тока выбирают тумблером SA3.
Напряжение на выводах батареи контролирует триггер Шмитта, выполненный на операционном усилителе DA1. С параметрического стабилизатора VD6, R5 на вход усилителя поступает образцовое напряжение, а с делителя R2, R3, R6 — напряжение, пропорциональное напряжению батареи.
Если тумблеры SA2 и SA4 установлены в положения, показанные на схеме, что соответствует режиму «АП». То при подключении аккумуляторной батареи её напряжение поступает на делитель R2, R3, R6. Если оно меньше 14,6 — 14,8 В, то на выходе операционного усилителя DA1 установится напряжение низкого уровня, которое откроет составной транзистор VT2, VTЗ.
Реле К1 сработает и своими контактами К1.1 и К 1.2 подключит трансформатор Т1 к сети. Батарея начнет заряжаться, о чём будет сигнализировать свечение лампы HL5 «ЗАРЯД».
При зарядке батареи до 14,6 — 14,8 В падение напряжения на делителе превысит порог срабатывания триггера, что приведет к его переключению и установлению на его выходе напряжения высокого уровня.
Транзисторы VT2, VTЗ закроются и обесточат реле К1 — автомат отключится от сети и лампа HL5 погаснет. Когда напряжение на батарее уменьшится до 12,8 — 13В, цикл подзарядки повторится.
Для перехода в режим «КТЦ» переключают тумблер SA4. При этом цикл зарядки батареи происходит так же, как в режиме «АП». По окончании зарядки напряжение высокого уровня с выхода DA1 закрывает транзисторы VT2, VTЗ и открывает транзистор VT1, который входит в насыщение и вместе с резистором R4 шунтирует резистор R6 делителя напряжения.
В результате этого снижается порог переключения триггера Шмитта до 10 — 10,8 В. До этого порога батарея разряжается через резисторы R14, RI5, замкнутые контакты SA4.2 и К1.3. Свечение лампы HL4 «РАЗРЯД» сигнализирует о цикле разрядки.
При уменьшении напряжения на выводах батареи до 10,6 — 10.8 В напряжение низкого уровня с выхода DA1 закроет транзистор VT1 и откроет транзисторы VT2, VTЗ. Реле К1 сработает и цикл зарядки повторится.
Конденсатор С1 устраняет преждевременное отключение автомата из-за пульсаций напряжения, которые могут возникнуть при зарядке сильно сульфатированной батареи.
Конденсатор С2 предотвращает ложное срабатывание автомата от действия помех. Параметрический стабилизатор VD5, R13 служит для защиты DA1 от пробоя напряжением самоиндукции вторичной обмотки трансформатора Т1.
Рис. 1. Принципиальная схема зарядного устройства.
Используя прибор в качестве источника переменного напряжения 12 В, следует отдать предпочтение режиму «РУЧН», так как во всех остальных автомат подключается к сети только в том случае, когда его выход соединен с батареей. Свечение лампы HL5 в этом режиме сигнализирует о включении устройства а сеть.
Настройка устройства
При налаживании автомата тумблеры SA2, SA4 сначала устанавливают в положение, соответствующее режиму «АП», движок резистора R3 — в верхнее по схеме положение. К автомату вместо батареи подключают регулируемый источник постоянного тока и плавно от нуля увеличивают напряжение. При напряжении 8 — 9,5 В должно сработать реле К1.
Далее увеличивают напряжение до 14,6 — 14,8 В и подстроенным резистором R4 добиваются выключения реле.
Плавно уменьшая напряжение, убеждаются в срабатывании реле при напряжении 12,8 — 13 В (если реле не срабатывает, то подбирают резисторы R7, R9).
После этого переводят устройство в режим «КТЦ» и отпаивают цепь R14, R15, HL4. Плавно увеличивая напряжение источника от 5 — 7 В, убеждаются, что реле выключается при напряжении 14,6 — 14,8 В. Далее уменьшают напряжение до 10,6 -10,8 В и подстроечным резистором R4 добиваются срабатывания реле.
В заключение еще раз проверяют работу автомата в режимах «АП» и «КТЦ» и вновь подключают цепь R14, R15, HL4.
Следует отметить, что при эксплуатации автомата в режимах «АП» или «КТЦ» с батареями емкостью до 55 А ч предпочтительнее пользоваться пределом тока зарядки 2 А, что исключит чрезмерно частые переключения реле.
В режиме «РУЧН» нельзя допускать замыкания выходной цепи.
Детали
Трансформатор Т1 — серийный, ТН-6І-220/127-50 мощностью 190 Вт или любой другой, рассчитанный на мощность 190 — 250 Вт, с напряжением на вторичной обмотке 12 -19 В притоке 7 -8 А.
Вместо операционного усилителя К140УД6 в автомате применим К157УД1. Транзистор КТ315Г может быть заменен на КТ315Б, КТ315Е, а КТ361Д — на КТ361В, КТ361К. Вместо ГТ403В подойдут транзисторы ГТ403Г — ГТ403И, а также КТ814В,КТ814Г.
Диоды VD1 — VD4 — любые из серий Д242, Д243, Д245, ВЛ10; VD7 — любой из серий Д226, Д7, КД105. Вместо стабилитрона Д816А можно применить Д816Б. Диоды VD1 — VD4 установить на металлическом шасси через изолирующие прокладки.
В устройстве использовано реле ПЭ-ЗОУЗ. Оно должно срабатывать при напряжении 8 — 9 В и токе не более 100 мА, поэтому обмотка перемотана проводом ПЭВ-2 0,16 мм до заполнения каркаса. Возможно применение реле ПЭ-23УЗ или МКУ-48. обмотки которых придется перемотать, а сечение провода подобрать экспериментально. Контакты используемого реле должны быть рассчитаны на ток не менее 5 А.
Тумблеры SA1, SA3, SA4 — ТП1-2, SA2 — ТВ 1-4. Лампы накаливания HL1 — HL3 — автомобильные на 12 В мощностью 40 — 50 Вт, а HL4, HL5 — любые маломощные на 13,5 и 24 В соответственно.
Лампы HL1 — HL3 крепят на отдельной плате, которую вместе с резисторами R14, R15 размещают по возможности дальше от печатной платы, рядом с вентиляционными отверстиями в кожухе прибора. Подстроенные резисторы — многооборотные, из серии СП5. Резисторы R14, R15 -ПЭВ-10. Конденсатор Cl — К53-18, К 50-6 либо К50-16 на напряжение не менее 15 В. Конденсатор С2 — любой керамический. Соединяют автомат с батареей гибкими проводниками из меди, сечением не менее 2,5 мм2, с пружинными зажимами на концах.
Чертёж монтажной платы зарядного устройства можно посмотреть в журнале «Радио» за 1992,№ 12, С 11,12.
Системный мастоцитоз | Программа тестирования биомаркеров Blueprint
Программа тестирования биомаркеров Blueprint
Программа тестирования биомаркеров Blueprint
Пожалуйста, предоставьте некоторые сведения о вашей практике, и представитель программы свяжется с вами в ближайшее время, чтобы помочь вам с вашим запросом.
Для использования этой формы у вас должен быть включен JavaScript.
Тема — Выбрать — Запрос приветственного пакета Заказ на исследование, сбор образцов и/или доставкаОтправленный заказ на исследованиеРезультаты Запрос центра обслуживания пациентов LabcorpДругое
Если другое, укажите
Название практики
Номер учетной записи Labcorp (если применимо)
Номер телефона, связанный с учетной записью Labcorp (если применимо)
Контактное лицо
Электронная почта
Номер телефона
Почтовый индекс
Обязательные поля
*Обязательные поля
Программа тестирования биомаркеров Blueprint для системного мастоцитоза
Системный мастоцитоз (СМ) — редкое заболевание, характеризующееся неопластической пролиферацией тучных клеток, вызываемой KIT Мутация D816V более чем в 90% случаев. 1 Раннее тестирование биомаркеров с использованием неинвазивного, высокочувствительного и количественного теста KIT D816V может сократить время установления диагноза у пациента.
Этот тест бесплатно предоставляется Labcorp Oncology для пациентов, соответствующих критериям, в рамках спонсируемой программы тестирования от Blueprint Medicines.*0044
Участие в программе
1
Запросить приветственный пакет
Запросить приветственный пакет у команды программы Labcorp (щелкнув ЗДЕСЬ), чтобы получить информацию о настройке учетной записи и подробные инструкции по заказу тестов и отчетности.
2
Закажите тест KIT D816V
Подтвердите соответствие пациента критериям приемлемости (см. раздел «Право на участие в программе» ниже) и заполните форму заявки на тест. Затем соберите образец и свяжитесь с Labcorp, чтобы запланировать доставку.
ИЛИ
Направьте пациента в один из наших центров обслуживания пациентов Labcorp вместе с заполненной формой заявки на анализ для сбора образцов.
3
Получение результатов
Результаты будут переданы поставщику медицинских услуг на основании настроек получения отчетов (например, Labcorp Link).
пациентов Labcorp могут получить доступ к своим результатам через портал для пациентов Labcorp.
Право на участие в программе
Пациент должен быть в возрасте 18 лет или старше, ранее не проходил тестирование в рамках этой программы, И иметь ДВА или более из следующих признаков и симптомов системного мастоцитоза.
| Clinical Features |
|
| Анамнез |
|
| Lab Gendings | 777|
LAB GENTIOR иммунофенотипирование тучных клеток IHC (т. е. триптаза, CD117, CD25, CD30) с проточной цитометрией или без нее (т. е. CD34, CD117, CD25, CD2, CD30) |
О системном мастоцитозе
Системный мастоцитоз (СМ) представляет собой редкую клональную неопластическую пролиферацию тучных клеток, приводящую к гетерогенным симптомам из-за инфильтрации клональными тучными клетками различных систем органов, включая, но не ограничиваясь к, костному мозгу, желудочно-кишечному тракту, коже, печени и селезенке. 2,3,4
Среднее время от появления симптомов до постановки диагноза СМ может занимать до семи лет, при этом пациенты посещают нескольких специалистов. 5 Кроме того, прогноз для пациентов с далеко зашедшими формами системного мастоцитоза плохой, при этом медиана выживаемости колеблется от менее чем шести месяцев до трех лет в зависимости от подтипа. 6,7 Мутация KIT D816V, распространенность которой превышает 90% случаев, является одновременно отличительной чертой СМ и частью клинических критериев диагностики СМ.
8,9
Пациенты со СМ могут иметь тяжелые, непредсказуемые симптомы, негативно влияющие на качество жизни, включая, но не ограничиваясь:
- Adult-onset cutaneous mastocytosis 10
- Anaphylaxis (in adult patients), often severe and presenting with cardiovascular features, including hypotensive syncope 5
- Chronic diarrhea, nausea, and vomiting 5
Роль мутации
KIT D816V в СМ Подавляющее большинство взрослых пациентов с СМ имеют мутацию KIT D816V, при этом исследования показывают увеличение уровней KIT Мутация D816V при сравнении индолентного СМ с агрессивным СМ. 1,3,6,11 Анализы с низкой чувствительностью могут не выявить мутацию KIT D816V, и тестирование этой мутации с помощью неинвазивного и высокочувствительного теста может сократить время постановки диагноза пациентами. 8,12 Пациенты с диагнозом СМ с мутацией KIT D816V могут реагировать на лечение, направленное на эту мутацию.
8 Кроме того, мониторинг уровней мутации KIT D816V может помочь в оценке реакции пациентов на лечение и прогрессирования заболевания. 13
Цифровой ПЦР-тест KIT D816V от Labcorp представляет собой высокочувствительный анализ, обнаруживающий эту мутацию до 0,03%.
Ресурсы
Образец отчета KIT D816V Цифровая ПЦР (положительный)
Образец отчета KIT D816V Цифровой ПЦР (отрицательный)
Targetsm.com — образовательный ресурс о СМ для медицинских работников, разработанный Blueprint Medicines.
Ссылки
- Garcia-Montero AC, et al. Мутация KIT в тучных клетках и других линиях гемопоэтических клеток костного мозга при системных заболеваниях тучных клеток: проспективное исследование Испанской сети по мастоцитозу (REMA) в серии из 113 пациентов. Кровь. 2006 г.; 108 (7): 2366–2372.
- Vaes M, et al. Целевые варианты лечения мастоцитоза. Фронт Мед. 2017;4:110.
- Хара-Асеведо М. и др. Обнаружение мутации KIT D816V в периферической крови при системном мастоцитозе: диагностическое значение. Мод Патол. 2015 г.; 28(8):1138-1149.
- Rossignol J, et al. Последние достижения в понимании и терапевтическом лечении мастоцитоза. F1000рез. 2019; 8.
- Дженнингс С.В. и др. Восприятие пациентов при заболеваниях тучных клеток. Immunol Allergy Clin of North Am. 2018; 38(3): 505-525.
- Лим К.Х. и др. Системный мастоцитоз у 342 последовательных взрослых: исследования выживаемости и прогностические факторы. Кровь. 2009 г.; 113(23):5727-5736.
- Сперр В.Р. и др. Международная прогностическая система оценки мастоцитоза (IPSM): ретроспективное когортное исследование. Ланцет Гематол. 2019 декабрь; 6(12): е638-е649.
- Парданани А. и др. Системный мастоцитоз у взрослых: обновленная информация о диагностике, стратификации риска и лечении, 2021 г. Am J Гематол. 2021 1 апреля; 96(4):508-525.
- Валент П. и др. Мастоцитоз: обновленная классификация ВОЗ 2016 г. и новые новые концепции лечения. Кровь. 2017 16 марта; 129(11): 1420–1427.
- Березовская С. и др. Мастоцитоз кожи у взрослых свидетельствует о системном мастоцитозе. Мод Патол. 2014; 27(1):19–29.
- Greiner G, et al. Цифровая ПЦР: чувствительный и точный метод количественного определения KIT D816V при мастоцитозе. Клин Хим. 2018 01 марта; 64(3): 547–555.
- Арок М. и др. Анализ мутаций KIT в новообразованиях тучных клеток: рекомендации Европейской сети компетенций по мастоцитозу. Лейкемия. 2015 июнь; 29(6): 1223–1232.
- Эрбен П. и др. KIT D816V экспрессирует аллельную нагрузку для диагностики и мониторинга системного мастоцитоза. Энн Хематол. 2014; 93:81–88.
и др. Обнаружение мутации KIT D816V в периферической крови при системном мастоцитозе: диагностическое значение. Мод Патол. 2015 г.; 28(8):1138-1149.
и новые новые концепции лечения. Кровь. 2017 16 марта; 129(11): 1420–1427. * Тест KIT D816V будет бесплатно предоставляться пациентам, поставщикам медицинских услуг и плательщикам в рамках этой программы. Исключая посещение офиса, сбор образцов для тестов, не связанных с этой программой, и любые другие связанные с этим расходы для пациентов. Labcorp не будет выставлять счет страховке KIT 9 соответствующего пациента.
0036 Тест D816V, однако Labcorp выставит счет выбранным плательщикам за другие заказанные услуги по тестированию.
Язык аттестации программы поставщиков медицинских услуг
Поставщик медицинских услуг («Вы» или «Ваш») несет ответственность за назначение тестирования в рамках этой программы в соответствии с вашим собственным медицинским заключением и действующим законодательством. Вы понимаете, что Blueprint Medicines Corporation покроет стоимость тестирования соответствующих критериям пациентов, и тестирование будет проводиться Labcorp. Вы понимаете критерии приемлемости, изложенные выше, и определили, что пациент соответствует этим критериям. Пациент был проинформирован Вами о том, что Blueprint Medicines покрывает стоимость тестирования, и Пациент понимает, что он не обязан покупать или использовать какие-либо продукты или услуги Blueprint Medicines. Пациент также был проинформирован Вами о том, что никакие идентифицирующие данные пациента не будут переданы компании Blueprint Medicines в рамках этой программы.
Вы понимаете и признаете, что (i) Вы не будете требовать возмещения расходов на этот бесплатный тест от какой-либо третьей стороны, включая, помимо прочего, государственные программы здравоохранения и Пациента; (ii) Вы не обязаны рекомендовать, покупать, заказывать, назначать, продвигать или использовать какой-либо продукт или услугу, предлагаемые Blueprint Medicines или Labcorp; (iii) Вы не обязаны участвовать или поощрять пациентов к участию в каких-либо клинических испытаниях или других исследовательских программах, проводимых Blueprint Medicines; и (iv) Вы будете участвовать в Программе в соответствии с действующим законодательством. Вы даете согласие на передачу информации об организации и контактных данных врача компании Blueprint Medicines, которая может напрямую связываться с вами и вашей организацией в связи с Программой. Вы подтверждаете, что в соответствии с применимым законодательством Вы уполномочены заказывать этот тест и что Пациент соответствует критериям приемлемости.
Дополнительная информация об этой программе
Программа тестирования биомаркеров Blueprint предлагается компанией Blueprint Medicines, чтобы помочь людям принимать более обоснованные решения в отношении своего здоровья.
В рамках этой программы Blueprint Medicines по соглашению с Labcorp делает тестирование KIT D816V бесплатным для пациентов, которые проходят обследование на системный мастоцитоз.
- Хотя Blueprint Medicines оказывает финансовую поддержку этой программе, услуги по тестированию предоставляются независимой третьей стороной, и Blueprint Medicines не несет никакой ответственности и не предоставляет никаких гарантий в отношении услуг по тестированию, предоставляемых независимыми третьими сторонами.
- Медицинские работники должны использовать независимое медицинское заключение при определении того, соответствуют ли пациенты критериям участия в программе.
- Никакие идентифицирующие данные пациентов не будут переданы Blueprint Medicines в рамках этой программы.
- Эта программа доступна только в США.
- Медицинские работники и пациенты, которые используют эту программу, не обязаны рекомендовать, покупать, заказывать, назначать, продвигать, администрировать, использовать или поддерживать какие-либо продукты или услуги Blueprint Medicines или Labcorp.
- Счета за эту программу не выставляются плательщикам, в том числе государственным плательщикам.
Бремя аллелей KIT D816V позволяет прогнозировать выживаемость пациентов с мастоцитозом и коррелирует с типом заболевания по ВОЗ
Аллергия. Авторская рукопись; доступно в PMC 2016 7 июня. 2014 июнь; 69(6): 810–813.
Опубликовано в Интернете 17 апреля 2014 г. doi: 10.1111/all.12409
PMCID: PMC48
EMSID: EMS68508
PMID: 24750133
, 1 , 2 , 3 , 4 , 1 , 5 , 2, 6, 7 , 1 , 1 , 2, 6 и 2, 6
Авторская информация об авторских правах и лицензии Отказ от ответственности
- Dopentary Material при системном мастоцитозе (СМ). Мы определили Набор аллелей KIT D816V методом количественной ПЦР в реальном времени в костном мозге и периферической крови 105 больных мастоцитозом. KIT D816V был обнаружен у 92/105 пациентов (88%). Между подгруппами заболеваний наблюдались значительные различия в среднем аллельном бремени; кожный мастоцитоз (0,042%), индолентный СМ (0,285%), вялотекущий СМ (5,991%), агрессивный СМ (9,346%) и СМ с ассоциированным гематологическим заболеванием не тучноклеточного происхождения (3,761%) ( P <0,001). 9Нагрузка 0035 KIT D816V также коррелировала с уровнем триптазы в сыворотке ( R =0,5, P <0,005), но не с инфильтрацией тучных клеток в костном мозге или медиаторными симптомами. Более того, бремя аллелей имело прогностическое значение в отношении выживаемости ( P <0,01). У пациентов, ответивших на циторедуктивную терапию, наблюдалось достоверное снижение KIT D816V ( P <0,03). В заключение, бремя KIT D816V коррелирует с вариантом мастоцитоза, предсказывает выживаемость и является ценным параметром наблюдения при СМ.
Ключевые слова: мастоцитоз, аллельная нагрузка, KIT D816V, выживаемость, ответ на лечение
Подавляющее большинство пациентов с системным мастоцитозом (СМ) имеют соматическую точковую мутацию KIT D816V (1–4).
Кристенсен и др. сообщили о высокочувствительной количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) для KIT D816V (5). Недавно была подтверждена важность измерения аллельной нагрузки методами количественной ПЦР с использованием различных методов (6). Кроме того, различия в 9Наблюдалась аллельная нагрузка 0035 KIT D816V среди индолентных и агрессивных форм (6, 7). Целью настоящего исследования было оценить влияние нагрузки аллеля KIT D816V на клиническое течение и выживаемость при СМ.Всего 105 взрослых пациентов с мастоцитозом, т.е. кожным мастоцитозом (CM, N =12), кожным мастоцитозом (MIS, N =3), вялотекущим SM (ISM, N =67), тлеющим SM (SSM, N =5), агрессивный SM (ASM, N = 7), тучноклеточный лейкоз (MCL, N = 1) и СМ с ассоциированным гематологическим заболеванием, не относящимся к МС (SM-AHNMD, N = 10). Характеристики пациентов показаны в Таблице S1. Количество аллелей KIT D816V определяли по геномной ДНК аспиратов костного мозга (КМ) и периферической крови с использованием аллель-специфичной количественной ПЦР, как описано (5).
При постановке диагноза KIT D816V определялся у 92/105 пациентов (88%) со средним значением KIT аллельная нагрузка D816V 0,315% (диапазон: 0,005%-50,183%). У KIT пациентов D816V+ ( N =92) мы сравнили нагрузку мутантных аллелей в разных подгруппах ВОЗ. В CM медиана аллельной нагрузки KIT D816V составила 0,042% (диапазон: 0,005%-0,530%), в MIS 0,084% (диапазон: 0,029%-0,165%), в ISM 0,285% (диапазон: 0,006%-34,585%) , в SSM 5,991% (диапазон: 0,023%-29,620%), в ASM 9,346% (диапазон: 8,816%-32,480%) и 3,761% (диапазон 0,083%-50,183%) в SM-AHNMD. Эти различия были очень значимыми (критерий Крускала-Уоллиса; Р <0,001; ).
Открыть в отдельном окне
Бремя аллеля KIT D816V при различных ВОЗ-подтипах мастоцитоза и его влияние на выживаемость.
(A) Высокозначимые различия по аллельной нагрузке KIT D816V обнаружены между пациентами с кожным мастоцитозом (КМ), кожным мастоцитозом (МИС), вялотекущим системным мастоцитозом (ИСМ), вялотекущим системным мастоцитозом (ССМ), агрессивный системный мастоцитоз (ASM), тучноклеточный лейкоз (MCL) и системный мастоцитоз с ассоциированным гематологическим заболеванием, не относящимся к тучноклеточному происхождению (SM-AHNMD) (9).
0035 P <0,001, тест Крускала-Уоллиса). (B) График Каплана-Мейера для общей выживаемости пациентов с мастоцитозом с бременем KIT D816V <2% и пациентов с бременем KIT D816V ≥ 2% на момент постановки диагноза. Разница в вероятности выживания была достоверной ( P =0,001).Аллельная нагрузка KIT D816V достоверно коррелировала с уровнями триптазы в сыворотке (корреляция Пирсона; R =0,50, P <0,005) и возрастом ( R =0,56, P <0,005), но только приблизительно с инфильтрацией тучных клеток (ТК) в КМ ( R =0,369) или процентом ТК в мазках КМ ( R =0,334) (рис. С1). При сравнении пациентов с симптомами, связанными с медиаторами, и без них не было обнаружено существенных различий в аллельной нагрузке (рис. S2).
Бремя мутаций KIT D816V было значимым предиктором выживаемости у наших 92 KIT пациентов D816V+ (регрессия Кокса, P = 0,015). Используя уровень отсечения 2% мутантных аллелей, были разделены две прогностически разные группы.
В группе с мутантным аллельным бременем <2% ( N =66) медиана выживаемости не была достигнута, тогда как у пациентов с KIT D816V аллельным бременем ≥2% ( N =26) медиана выживаемости составила 6,3. лет (критерий логарифмического ранга; P =0,001; ).У 30 пациентов с аллельным бременем KIT D816V можно было наблюдать в течение среднего времени наблюдения 21 месяц (диапазон 3–178 месяцев). У пациентов со стабильным клиническим течением ( N =19), существенного увеличения или уменьшения аллельной нагрузки KIT D816V не наблюдалось (; рис. S3). В случаях поздних стадий СМ, получавших циторедуктивную терапию ( N =11), наблюдались выраженные изменения в бремени мутантных аллелей (рис. S4). У пациентов с хорошим или частичным ответом на циторедуктивное лечение (кладрибин N =4, гидроксимочевина N =1, интерферон N =1) достоверное снижение нагрузки KIT D816V (9наблюдалось среднее снижение на 1,6%) (парный критерий Стьюдента; P = 0,027).
Открыть в отдельном окне
Бремя аллеля KIT D816V во время наблюдения.
Изменение фракции положительного аллеля KIT D816V в ходе наблюдения у пациентов без (A; N =19) и с циторедуктивным лечением (B; N =11). Аллельная нагрузка была нормализована к мутантной нагрузке при постановке диагноза. Значение 1 соответствует отсутствию изменений доли аллелей с течением времени, а значения 0,1 и 10 (пунктирные линии) соответствуют 10-кратному уменьшению и увеличению. (C-F) Продолжение Бремя аллеля KIT D816V (синий) и триптаза в сыворотке (черный) у отдельных пациентов с мастоцитозом с неосложненным течением (C, ISM; D, SSM), у пациента с исходным диагнозом ISM с прогрессированием заболевания до ASM-CMML и реакцией на циторедуктивную терапию. терапия кладрибином (2-CDA) (E) и пациент с ССМ, получающий циторедуктивную терапию из-за повторяющихся эпизодов опасной для жизни сосудистой нестабильности, требующей поддержки адреналином (F).
Недавно было показано, что количественная ПЦР является надежным тестом для количественного определения KIT D816V у больных мастоцитозом (5-11). В соответствии с этими результатами медиана аллельной нагрузки KIT D816V у наших пациентов составила 0,315%. Считается, что различные подгруппы СМ существенно различаются в отношении бремени неопластического СК (12). Действительно, самая низкая аллельная нагрузка KIT D816V наблюдалась при ВМ, за которой следовали ISM и SSM, самая высокая — при ASM и SM-AHNMD. Аналогичные результаты недавно были получены в исследовании, посвященном вялотекущему СМ, но не случаям МАС (7). Чем выше Бремя аллеля KIT D816V при распространенном СМ, включая SM-AHNMD, также может указывать на то, что клетки не-MC-клона содержат мутацию у этих пациентов. В связи с этим следует отметить, что при поздних стадиях СМ часто происходит многолинейное вовлечение (13, 14). Многолинейность также может объяснить, почему аллельная нагрузка KIT D816V лишь умеренно коррелирует с уровнями триптазы в сыворотке и не коррелирует с количеством ТК в биоптатах и мазках костного мозга.
Другим объяснением может быть то, что другие онкогенные мутации участвуют в пролиферации и/или выживании ТК в костном мозге (15).Поскольку мутация KIT D816V запускает автономную активацию KIT, нас интересовало, будут ли клинические симптомы, связанные с медиатором, коррелировать с бременем мутанта KIT D816V. Однако нам не удалось продемонстрировать такую корреляцию, которая также подтверждает результаты, полученные Broesby-Olsen et al (8) в когорте, включающей продвинутую СМ. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что симптомы, связанные с медиатором, возникают независимо от подгруппы ВОЗ и независимо от бремени KIT — мутировавший МС.
Недавно было высказано предположение о влиянии бремени аллеля KIT D816V на выживаемость в когорте с очень высоким процентом (52%) поздних стадий СМ (6). В нашей когорте последовательно диагностированных пациентов только с 17% поздних стадий СМ, таким образом отражая менее отобранную популяцию пациентов, бремя аллелей KIT D816V имело прогностическое значение в отношении выживаемости.
Используя пороговый уровень 2% мутантной аллельной нагрузки в нашем исследовании, можно было разделить две прогностически разные группы пациентов с явно разным временем выживания. Однако значение конкретного порогового значения необходимо подтвердить в будущих проспективных испытаниях.В настоящее время доступно лишь несколько лабораторных параметров для мониторинга ответа на лечение при поздних стадиях СМ (4). До сих пор данные последующего наблюдения аллельной нагрузки KIT D816V были опубликованы только для пациентов с ISM (8) и 4 пациентов с распространенным SM (6). В нашей когорте у пациентов с вялотекущим течением заболевания наблюдалась стабильная аллельная нагрузка во время наблюдения, тогда как в случаях с прогрессированием заболевания было обнаружено заметное увеличение KIT D816V. У пациентов, ответивших на циторедуктивную терапию, наблюдалось значительное снижение КОМПЛЕКТ Нагрузка D816V. Таким образом, аллельная нагрузка KIT D816V может использоваться для оценки ответа в клинических испытаниях.
Вместе мы подтверждаем диагностическую ценность KIT D816V qPCR при мастоцитозе. Более того, наши данные показывают, что бремя мутаций значительно различается среди пациентов разных подгрупп ВОЗ и имеет прогностическое значение в отношении выживаемости. Наконец, аллельное бремя KIT D816V является ценным параметром для последующего наблюдения за нелечеными и получающими медикаментозное лечение пациентами с распространенным СМ.
Рис. S1
Щелкните здесь для просмотра. (1.1M, tif)
Рис. S2
Щелкните здесь для просмотра. (503K, tif)
Рис. S3
Щелкните здесь для просмотра. (997K, tif)
Рис. S4
Щелкните здесь для просмотра. (1.0M, tif)
Дополнение
Щелкните здесь для просмотра. (22K, docx)
Авторы благодарят Matthias Mayerhofer (Госпиталь Hanusch, Вена, Австрия) за критическое прочтение рукописи.
Финансовая поддержка
Это исследование было поддержано проектом Австрийского национального научного фонда (FWF) P26079-B13 и проектом SFB F4704-B20.
MC mast cell SM systemic mastocytosis CM cutaneous mastocytosis ISM indolent systemic mastocytosis SSM smoldering systemic mastocytosis ASM aggressive systemic mastocytosis SM-AHNMD systemic mastocytosis with an associated hematologic non-mast cell lineage disease MCL mast cell leukemia AML acute myeloid лейкоз ХММЛ хронический миеломоноцитарный лейкоз ВМ костный мозг КПЦР количественная ПЦР в реальном времени Предоставлено
Вклад автора
G.
H., G.E.D., G.G., G.M., and C.M. провели молекулярные тесты и проанализировали данные. Г.Х., К.В.Г., Ф.В., Э.Х., П.В. и В.Р.С. получены и проанализированы клинические данные. Г.Х. и П.В. и W.R.S. разработал исследование и написал статью. Все авторы пересмотрели и одобрили рукопись.Конфликт интересов
П.В. является консультантом в глобальном исследовании Novartis, изучающем эффекты PKC412 у пациентов с прогрессирующим системным мастоцитозом. Кроме того, П.В. получил гонорары и исследовательский грант от Novartis. Авторы заявляют об отсутствии других конкурирующих финансовых интересов.
1. Longley BJ, Jr, Metcalfe DD, Tharp M, Wang X, Tyrrell L, Lu SZ, et al. Активирующие и доминантно-инактивирующие мутации каталитического домена c-KIT при различных клинических формах мастоцитоза человека. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (4): 1609–1614. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
2. Nagata H, Worobec AS, Oh CK, Chowdhury BA, Tannenbaum S, Suzuki Y, et al.
Выявление точечной мутации в каталитическом домене протоонкогена c-kit в мононуклеарных клетках периферической крови больных мастоцитозом с сопутствующим гематологическим заболеванием. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(23):10560–10564. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]3. Valent P, Akin C, Escribano L, Fodinger M, Hartmann K, Brockow K, et al. Стандарты и стандартизация при мастоцитозе: консенсусные заявления по диагностике, рекомендации по лечению и критерии ответа. Евро Джей Клин Инвест. 2007;37(6):435–453. [PubMed] [Google Scholar]
4. Gotlib J, Pardanani A, Akin C, Reiter A, George T, Hermine O, et al. Международная рабочая группа по исследованию и лечению миелопролиферативных новообразований (IWG-MRT) и Европейская сеть компетенций по мастоцитозу (ECNM) разработали согласованные критерии ответа при прогрессирующем системном мастоцитозе. Кровь. 2013;121(13):2393–2401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
5. Kristensen T, Vestergaard H, Moller MB.
Улучшенное обнаружение мутации KIT D816V у пациентов с системным мастоцитозом с использованием количественного и высокочувствительного количественного ПЦР в реальном времени. J Мол Диагн. 2011;13(2):180–188. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]6. Erben P, Schwaab J, Metzgeroth G, Horny HP, Jawhar M, Sotlar K, et al. KIT D816V экспрессирует аллельную нагрузку для диагностики и мониторинга системного мастоцитоза. Энн Хематол. 2014;93(1):81–88. [PubMed] [Google Scholar]
7. Kristensen T, Vestergaard H, Bindslev-Jensen C, Moller MB, Broesby-Olsen S. Чувствительный анализ крови на мутацию KIT D816V в качестве диагностического теста при мастоцитозе. Am J Гематол. 2014 [PubMed] [Google Scholar]
8. Broesby-Olsen S, Kristensen T, Vestergaard H, Brixen K, Moller MB, Bindslev-Jensen C, et al. Бремя мутаций KIT D816V не коррелирует с клиническими проявлениями вялотекущего системного мастоцитоза. J Аллергия Клин Иммунол. 2013;132(3):723–728. [PubMed] [Академия Google]
9.
Кристенсен Т., Бросби-Олсен С., Вестергаард Х., Биндслев-Йенсен С., Моллер М.Б. KIT D816V Мутационно-положительные клеточные фракции в биоптатах пораженной кожи взрослых с системным мастоцитозом. Дерматология. 2013;226(3):233–237. [PubMed] [Google Scholar]10. Kristensen T, Broesby-Olsen S, Vestergaard H, Bindslev-Jensen C, Moller MB. Центр мастоцитоза Университет Оденсе H. Циркулирующие мутации KIT D816V немастоциты в периферической крови характерны для вялотекущего системного мастоцитоза. Евр Дж Гематол. 2012;89(1): 42–46. [PubMed] [Google Scholar]
11. Kristensen T, Broesby-Olsen S, Vestergaard H, Bindslev-Jensen C, Moller MB. Центр мастоцитоза Университет Оденсе H. Триптаза в сыворотке коррелирует с бременем мутации KIT D816V у взрослых с вялотекущим системным мастоцитозом. Евр Дж Гематол. 2013;91(2):106–111. [PubMed] [Google Scholar]
12. Sperr WR, Jordan JH, Fiegl M, Escribano L, Bellas C, Dirnhofer S, et al. Уровни триптазы в сыворотке у пациентов с мастоцитозом: корреляция с массой тучных клеток и значение для определения категории заболевания.
Int Arch Allergy Immunol. 2002;128(2):136–141. [PubMed] [Академия Google]13. Киршенбаум А.С., Гофф Дж.П., Семер Т., Фостер Б., Скотт Л.М., Меткалф Д.Д. Демонстрация того, что тучные клетки человека возникают из популяции клеток-предшественников, которая представляет собой CD34 (+), c-kit (+) и экспрессирует аминопептидазу N (CD13) крови. 1999;94(7):2333–2342. [PubMed] [Google Scholar]
14. Garcia-Montero AC, Jara-Acevedo M, Teodosio C, Sanchez ML, Nunez R, Prados A, et al. Мутация KIT в тучных клетках и других линиях гемопоэтических клеток костного мозга при системных заболеваниях тучных клеток: проспективное исследование Испанской сети по мастоцитозу (REMA) в серии из 113 пациентов. Кровь. 2006;108(7):2366–2372. [PubMed] [Академия Google]
15. Schwaab J, Schnittger S, Sotlar K, Walz C, Fabarius A, Pfirrmann M, et al. Комплексное мутационное профилирование при прогрессирующем системном мастоцитозе. Кровь. 2013;122(14):2460–2466. [PubMed] [Google Scholar]
Циркулирующие мутации KIT D816V немастоциты в периферической крови характерны для индолентного системного мастоцитоза
Сохранить цитату в файл
Формат: Резюме (текст)PubMedPMIDAbstract (текст)CSV
Добавить в коллекции
- Создать новую коллекцию
- Добавить в существующую коллекцию
Назовите свою коллекцию:
Имя должно содержать менее 100 символов
Выберите коллекцию:
Невозможно загрузить вашу коллекцию из-за ошибки
Повторите попыткуДобавить в мою библиографию
- Моя библиография
Не удалось загрузить делегатов из-за ошибки
Повторите попыткуВаш сохраненный поиск
Название сохраненного поиска:
Условия поиска:
Тестовые условия поиска
Эл.
адрес:
(изменить)Который день? Первое воскресеньеПервый понедельникПервый вторникПервая средаПервый четвергПервая пятницаПервая субботаПервый деньПервый рабочий день
Который день? воскресеньепонедельниквторниксредачетвергпятницасуббота
Формат отчета: SummarySummary (text)AbstractAbstract (text)PubMed
Отправить максимум: 1 штука5 штук10 штук20 штук50 штук100 штук200 штук
Отправить, даже если нет новых результатов
Необязательный текст в электронном письме:
Создайте файл для внешнего программного обеспечения для управления цитированием
Полнотекстовые ссылки
Уайли
Полнотекстовые ссылки
.
2012 июль; 89 (1): 42-6.дои: 10.1111/j.1600-0609.2012.01789.х. Epub 2012 28 апр.
Томас Кристенсен 1 , Сигурд Бросби-Олсен, Ханне Вестергаард, Карстен Биндслев-Йенсен, Майкл Б. Мёллер, Центр мастоцитоза Университетская больница Оденсе (MastOUH)
Филиалы
принадлежность
- 1 Отделение патологии Университетской больницы Оденсе, Оденсе, Дания. [email protected]
- PMID: 22469616
- DOI: 10.1111/ж.1600-0609.2012.01789.х
Томас Кристенсен и соавт.
Евр Дж Гематол.
2012 июль. 2012 июль; 89 (1): 42-6.
дои: 10.1111/j.1600-0609.2012.01789.х. Epub 2012 28 апр.
Авторы
Томас Кристенсен 1 , Сигурд Бросби-Олсен, Ханне Вестергаард, Карстен Биндслев-Йенсен, Майкл Б. Мёллер, Центр мастоцитоза Университетская больница Оденсе (MastOUH)
принадлежность
- 1 Отделение патологии Университетской больницы Оденсе, Оденсе, Дания. [email protected]
- PMID: 22469616
- DOI:
10. 1111/ж.1600-0609.2012.01789.х
Абстрактный
В настоящее время считается, что мутация KIT D816V выявляется в тканях с неопластическими тучными клетками у большинства пациентов с индолентным системным мастоцитозом. В этом исследовании неопластические тучные клетки были обнаружены в костном мозге, но не в периферической крови, с помощью проточной цитометрии во всех 25 включенных случаях вялотекущего системного мастоцитоза. Тем не менее, мутация KIT D816V была обнаружена с помощью специфической для мутации количественной ПЦР как в костном мозге, так и в периферической крови во всех 25 случаях, что впервые продемонстрировало, что мутация KIT D816V постоянно присутствует в немастичных клетках при индолентном системном мастоцитозе и что эти клетки циркулируют в периферической крови.
© 2012 John Wiley & Sons A/S.
Похожие статьи
Обнаружение мутации KIT D816V в периферической крови при системном мастоцитозе: диагностическое значение.
Хара-Асеведо М., Теодосио К., Санчес-Муньос Л., Альварес-Твоуз И., Маядо А., Кальдас К., Матито А., Моргадо Х.М., Муньос-Гонсалес Д.И., Эскрибано Л., Гарсия-Монтеро А.К., Орфао А. Хара-Асеведо М. и др. Мод Патол. 2015 авг; 28 (8): 1138-49. doi: 10.1038/modpathol.2015.72. Epub 2015 12 июня. Мод Патол. 2015. PMID: 26067933
Системный мастоцитоз, связанный с хроническим идиопатическим миелофиброзом: отдельный подтип системного мастоцитоза, связанный с [скорректированным] клональным гематологическим заболеванием без тучных [скорректированных] клеточных линий, несущим мутации активирующей точки KITD816V и JAK2V617F.
Сотлар К., Баче А., Стеллмахер Ф., Бюльтманн Б., Валент П., Хорни Х.П. Сотлар К. и др. J Мол Диагн. 2008 Январь; 10 (1): 58-66. doi: 10.2353/jmoldx.2008.070061. Epub 2007, 28 декабря. J Мол Диагн. 2008.
PMID: 18165278
Бесплатная статья ЧВК.Уровень триптазы в сыворотке коррелирует с бременем мутации KIT D816V у взрослых с индолентным системным мастоцитозом.
Кристенсен Т., Бросби-Олсен С., Вестергаард Х., Биндслев-Йенсен С., Меллер М.Б.; Центр мастоцитоза Университетская больница Оденсе. Кристенсен Т. и др. Евр Дж Гематол. 2013 авг; 91 (2): 106-11. doi: 10.1111/ejh.12128. Epub 2013 28 июня. Евр Дж Гематол. 2013. PMID: 23621866
Мастоцитоз: современное состояние.
Horny HP, Сотлар К, Валент П. Horny HP и др. Патобиология. 2007;74(2):121-32. дои: 10.1159/000101711. Патобиология. 2007. PMID: 17587883 Обзор.
[Системный мастоцитоз.
Недооценка состояния больных с идиопатической анафилаксией.Гюлен Т., Готтберг Л., Далин Б., Нильссон Г., Хэгглунд Х. Гюлен Т. и др. Лакартинген. 2012 29 февраля — 13 марта; 109 (9–10): 474–7. Лакартинген. 2012. PMID: 22530411 Обзор. шведский. Аннотация недоступна.
Посмотреть все похожие статьи
Цитируется
Системный мастоцитоз: междисциплинарный подход.
Zanotti R, Tanasi I, Crosera L, Bonifacio M, Schena D, Orsolini G, Mastropaolo F, Tebaldi M, Olivieri E, Bonadonna P. Занотти Р. и соавт. Mediterr J Hematol Infect Dis. 1 ноября 2021 г .; 13 (1): e2021068. doi: 10.4084/MJHID.2021.068. Электронная коллекция 2021. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2021. PMID: 34804442 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Системный мастоцитоз: молекулярный ландшафт и значение для лечения.
Мональди К., Де Сантис С., Манчини М., Бруно С., Каво М., Соверини С. Мональди С. и др. Mediterr J Hematol Infect Dis. 1 июля 2021 г .; 13 (1): e2021046. doi: 10.4084/MJHID.2021.046. Электронная коллекция 2021. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2021. PMID: 34276915 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Клиническое влияние унаследованных и приобретенных генетических вариантов при мастоцитозе.
Недошитко Б., Арок М., Лайонс Дж. Дж., Бачело Г., Шварц Л. Б., Райтер А., Джавхар М., Швааб Дж., Ланге М., Грайнер Г., Хорманн Г., Недошитко М., Меткалф Д. Д., Валент П. Недошитко Б и соавт. Int J Mol Sci. 2021 2 января; 22 (1): 411. дои: 10.3390/ijms22010411. Int J Mol Sci. 2021. PMID: 33401724 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Последние достижения в молекулярной биологии системного мастоцитоза: значение для диагностики, прогноза и терапии.
Мартелли М., Мональди С., Де Сантис С., Бруно С., Манчини М., Каво М., Соверини С. Мартелли М. и др. Int J Mol Sci. 2020 2 июня; 21 (11): 3987. дои: 10.3390/ijms21113987. Int J Mol Sci. 2020. PMID: 32498255 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Спектр агрессивного мастоцитоза: отчет о семинаре и обзор литературы.
Легит Р., Хебеда К., Кремер М., Ван дер Вальт Дж., Джанелли У., Цанков А., Орази А. Легит Р. и др. Патобиология. 2020;87(1):2-19. дои: 10.1159/000504099. Epub 2019 4 декабря. Патобиология. 2020. PMID: 31802761 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Просмотреть все статьи «Цитируется по»
термины MeSH
вещества
Полнотекстовые ссылки
Уайли
Укажите
Формат: ААД АПА МДА НЛМ
Отправить по номеру
Нинтеданиб нацелен на опухолевые клетки KIT D816V, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток системного мастоцитоза | Кровь
Пропустить пункт назначения
МИЕЛОИДНАЯ НЕОПЛАЗИЯ| 15 апреля 2021 г.
Марсело А. С. Толедо,
Малрун Гатц,
Стефани Зонтаг,
Каролина В. Гляйкснер,
Грегор Эйзенворт,
Кристина Фельдберг,
Ахмед Э. И. Хамуда,
Фредерик Клюге,
Риккардо Гуарески,
Джулия Россетти,
Антонио С. Сечи,
Олли М. Дж. Дуфва,
Сату М.
Мусйоки,Ангела Маурер,
Хердит М. Шулер,
Роман Гетцке,
Тилль Брауншвейг,
Энн Кайзер,
Йенс Пансе,
Мохамад Джаухар,
Андреас Райтер,
Франк Хилберг,
Питер Эттмайер,
Вольфганг Вагнер,
Штеффен Кошмидер,
Тим Х.
Брюммендорф,Питер Валент,
Николя Шатен,
Мартин Зенке
Кровь (2021) 137 (15): 2070–2084.
https://doi.org/10.1182/blood.201
09
История статьи
Подано:
13 декабря 2019 г.
Принято:
8 декабря 2020 г.
Первая редакция:
23 декабря 2020 г. Это связанная статья с: «Освоение» открытия лекарств с помощью ИПСК
- Разделенный экран
- Делиться
- Твиттер
- Инструменты
Запросить разрешения
Иконка Цитировать Цитировать
- Поиск по сайту
Цитата
Марсело А.
С. Толедо, Малрун Гац, Стефани Зонтаг, Каролина В. Гляйкснер, Грегор Эйзенворт, Кристина Фельдберг, Ахмед Э.И. Хамуда, Фредерик Клюге, Риккардо Гуарески, Джулия Россетти, Антонио С. Сечи, Олли М.Дж. Дуфва, Сату М. Мусйоки, Анджела Маурер, Хердит М. Шулер, Роман Гетцке, Тилль Брауншвейг, Анне Кайзер, Йенс Пансе, Мохамад Джавар, Андреас Райтер, Франк Хилберг, Петер Эттмайер, Вольфганг Вагнер, Штеффен Кошмидер, Тим Х. Брюммендорф, Петер Валент, Николя Шатен, Мартин Зенке ; Нинтеданиб воздействует на опухолевые клетки KIT D816V, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток системного мастоцитоза. Кровь 2021; 137 (15): 2070–2084. doi: https://doi.org/10.1182/blood.20109
Скачать файл цитирования:
- Рис (Зотеро)
- Менеджер ссылок
- EasyBib
- Подставки для книг
- Менделей
- Бумаги
- КонецПримечание
- РефВоркс
- Бибтекс
Полученные от пациента KIT ИПСК D816V и разработанные с помощью CRISPR KIT ЭСК D816V моделируют гетерогенность заболевания СМ и служат платформой для скрининга лекарств.
Нинтеданиб избирательно воздействует на KIT D816V клетки, полученные из иПСК и ЭСК, и первичные образцы от пациентов с СМ.
Предметы:
Кроветворение и стволовые клетки, Миелоидная неоплазия
Темы:
мастоцитоз, системный, нинтеданиб, стволовые клетки, плюрипотентные, усиленный синдром s-cone, минимальное сознательное состояние, поддерживающие кардиохирургические процедуры, тучноклеточная саркома, когортное исследование тысячелетия, мутация, рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста
Visual Abstract
Посмотреть большойСкачать слайд
Посмотреть большойСкачать слайд
Темы:
Кроветворение и стволовые клетки, Миелоидная неоплазия
Темы:
мастоцитоз, системный, нинтеданиб, стволовые клетки, плюрипотентные, усиленный синдром s-cone, минимальное сознательное состояние, поддерживающие кардиохирургические процедуры, тучноклеточная саркома, когортное исследование тысячелетия, мутация, Рецепторы фактора роста эндотелия сосудов
Мутация KIT D816V обнаруживается более чем у 80% пациентов с системным мастоцитозом (СМ) и является ключом к размножению и накоплению опухолевых тучных клеток (ТК) в пораженных органах.
Таким образом, KIT D816V представляет собой основную терапевтическую мишень для СМ. Здесь мы создали панель специфичных для пациента KIT D816V, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с агрессивным СМ и лейкемией тучных клеток, чтобы разработать модель заболевания СМ для конкретного пациента для механистических исследований и исследований по открытию лекарств. KIT ИПСК D816V дифференцировались в неопластические гемопоэтические клетки-предшественники и ТК со специфическими для пациента фенотипическими признаками, тем самым отражая гетерогенность заболевания. CRISPR/Cas9n-инженерные KIT D816V эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) при дифференцировке в гемопоэтические клетки повторяли фенотип, наблюдаемый для гемопоэза иПСК KIT D816V. KIT D816V вызывает конститутивную активацию рецептора тирозинкиназы KIT, и мы использовали наши иПСК и ЭСК для исследования новых ингибиторов тирозинкиназы, нацеленных на KIT D816V. Наше исследование выявило нинтеданиб, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ингибитор ангиокиназы, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов, рецептор фактора роста тромбоцитов и рецептор фактора роста фибробластов, в качестве нового ингибитора KIT D816V. Нинтеданиб избирательно снижал жизнеспособность полученных из иПСК KIT Кроветворные клетки-предшественники D816V и ТК в наномолярном диапазоне. Нинтеданиб также был активен в первичных образцах пациентов с KIT D816V SM. Исследования молекулярной стыковки показывают, что нинтеданиб связывается с карманом связывания аденозинтрифосфата неактивного KIT D816V. Наши результаты позволяют предположить, что нинтеданиб является новым лекарственным средством-кандидатом для направленной на KIT D816V терапии распространенного СМ.Предметы:
Кроветворение и стволовые клетки, Миелоидная неоплазия
Темы:
мастоцитоз системный, нинтеданиб, стволовые клетки, плюрипотентные, усиленный синдром s-cone, минимальное сознательное состояние, поддерживающие кардиохирургические процедуры, тучноклеточная саркома, когортное исследование тысячелетия, мутация, рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста
Мастоцитоз представляет собой группу гемопоэтических злокачественных новообразований, характеризующихся аномальной пролиферацией и накоплением опухолевых тучных клеток (ТК) в 1 или нескольких тканях и органах, включая костный мозг (КМ), селезенку, печень и кожу .
1,2 Степень инфильтрации СК, количество пораженных тканей/органов и мутационная нагрузка определяют гетерогенную патологию и отдельные категории заболеваний при системном мастоцитозе (СМ): индолентный СМ, тлеющий СМ, агрессивный СМ (АСМ), МС лейкоз (MCL) и СМ с ассоциированным гематологическим заболеванием (SM-AHD). 1,3,4 ASM, MCL и SM-AHD представляют собой запущенные формы SM, которые характеризуются выраженной инфильтрацией MC, нарушающей функцию органа, быстрым прогрессированием заболевания и неблагоприятным прогнозом. Для этих пациентов доступно лишь несколько терапевтических вариантов. 4-6 Мутации в гене, кодирующем рецептор KIT, играют центральную роль в эволюции СМ, а мутация KIT D816V является наиболее распространенной и выявленной во всех категориях СМ. 3,6-8 Эта мутация приводит к конститутивной активации KIT и аномальной экспансии и накоплению ТК в пораженных органах. 6,8,9 Сообщалось, что несколько ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) ингибируют активность KIT в неопластических ТК.
10-14 Однако KIT D816V придает устойчивость к некоторым из этих TKI, включая иматиниб. 11,15 Другие ИТК, такие как мидостаурин, подавляют рост неопластических ТК KIT D816V, а недавно мидостаурин был одобрен для лечения распространенного СМ. 16-18 Совсем недавно были идентифицированы два дополнительных соединения, нацеленных на KIT D816V, рипретиниб (DCC-2618) и авапритиниб (BLU-285), которые проходят клинические испытания при распространенном СМ. 19-21 Однако эффективность и переносимость этих ИТК могут варьироваться, поскольку СМ является гетерогенной патологией; поэтому необходимы дальнейшие усилия по созданию доклинических моделей и выявлению новых ИТК.Первичные образцы пациентов со СМ представляют собой дефицитный и очень изменчивый источник клеток для доклинических исследований. Более того, ТК часто составляют незначительную часть аспиратов костного мозга. Кроме того, доступно несколько линий МС человека; среди них только 2, ГМК-1.
2 и РОСА Д816В , экспресс КОМПЛЕКТ Д816В. 8 Кроме того, сконструированные или установленные клеточные линии KIT D816V не полностью рекапитулируют KIT D816V SM из-за дополнительных мутаций в таких генах, как ASXL1 , CBL , RUNX1 , SRSF2 и TET2 обычно обнаруживаются у пациентов с KIT D816V ASM и MCL. 8,22-24 Эти одновременные мутации способствуют гетерогенности и прогрессированию заболевания. Следовательно, для изучения патологии СМ и скрининга соединений, нацеленных на клетки СМ, необходимы более аутентичные модели заболеваний, которые более точно повторяют генетические и функциональные особенности СМ.Индуцированные пациентом плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представляют собой неиссякаемый источник клеток для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, сохраняя при этом специфический для пациента генетический фон, включая специфичные для заболевания и/или ассоциированные мутации.
25-27 Кроме того, иПСК и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) легко подвергаются геномной инженерии с помощью CRISPR/Cas9 для точного введения или восстановления онкогенных мутаций. 26,28,29 Здесь мы сообщаем о получении ИПСК KIT D816V у пациентов с СМ. Полученные из СМ KIT D816V иПСК дифференцировались в гемопоэтические клетки-предшественники (ГПК) и ТК со специфическими для пациента особенностями. Кроме того, мы ввели мутацию KIT D816V в ЭСК человека с помощью CRISPR/Cas9.n, в результате чего была получена панель из KIT D816V и KIT — немутированных линий iPSC и ESC. Скрининг соединений идентифицировал ИТК нинтеданиб (Варгатеф, Офев) и его аналоги как мощные новые ингибиторы KIT D816V. Этот вывод был повторен в гемопоэтических клетках KIT D816V, полученных из иПСК и ЭСК, и первичных образцах SM, тем самым демонстрируя специфичное для KIT D816V нацеливание нинтеданиба.
Генерация и культура иПСК
Перепрограммирование первичных образцов СМ (дополнительная таблица 1; доступно на Blood Web site) и культивирование иПСК проводили, как описано ранее.
29 Мутация KIT D816V была обнаружена с помощью аллель-специфической ПЦР (дополнительная таблица 2).Получение ЭСК
KIT D816V путем редактирования CRISPR/Cas9nЭСК человека HES-3 (ES03) были получены из Исследовательского института WiCell и культивированы, как описано для ИПСК. 29 Исследования ЭСК были одобрены властями Германии, Институт Роберта Коха, Берлин, Германия (разрешение № 1710-79-1-4-79). KIT ЭСК D816V были получены, как описано ранее, с использованием вектора pX335 (Addgene 42335) и олигонуклеотидов, перечисленных в дополнительной таблице 3. 29
Цитогенетический анализ и тест Epi-Pluri Полосы GTG, как и раньше.
29 Анализ Epi-Pluri-Score был выполнен, как описано. 30Иммунофлуоресцентное окрашивание
ИПСК и ЭСК окрашивали на маркеры плюрипотентности, а эндотелиальные клетки окрашивали на CD31 и CD144 (дополнительная таблица 4), в основном, как описано ранее.
29 Гематопоэтическая дифференцировка ИПСК и ЭСК
ИПСК дифференцировали в гемопоэтические клетки-предшественники и ТК с использованием протокола на основе эмбрионального тела (ЭТ). 31,32 ЭСК были дифференцированы в направлении гемопоэтической линии путем адаптации протокола, основанного на гипоксии. 29 CD34 + HPC выделяли методом магнитно-активированной клеточной сортировки (MACS; Miltenyi Biotec) и размножали до 12 дней при 37°C и 5% CO 2 в гемопоэтической дифференцировочной среде. 31
Тестирование соединений на гемопоэтических клетках, ТК и эндотелиальных клетках , с 10
4 клеток на лунку, в 90 мкл среды для скрининга лекарств (RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ l-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; все от Thermo Fisher Scientific) в течение 66 часов. Жизнеспособность клеток определяли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, планшетного ридера SpectraMAX i3 и программного обеспечения SoftMax Pro.CD45 + KIT высокая ТК, полученные из иПСК, высевали с плотностью 5 × 10 3 клеток на лунку и подвергали тестированию соединений, как указано выше. Эндотелиальные клетки (10 4 клеток на лунку) обрабатывали соединениями в полностью дополненной среде EGM-2 (Lonza) в течение 48 часов и затем анализировали, как указано выше.
Подробные методы анализа секвенирования следующего поколения (NGS), дифференцировки эндотелиальных клеток, анализа пролиферации, анализа поглощения липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), анализа и сортировки проточной цитометрией, анализа апоптоза, вестерн-блоттинга, колониеобразующих единиц (КОЕ) анализ, препараты цитоспина, анализ чувствительности и устойчивости к лекарственным средствам (DSRT), тестирование соединений на первичных клетках, исследования на животных, анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) и молекулярный докинг представлены в дополнительных методах.
ИПСК KIT D816V экспрессируют конститутивно активный рецептор KITИПСК KIT D816V были получены из 14 пациентов с SM D816V/H путем перепрограммирования мононуклеарных клеток периферической крови или костного мозга (табл. 1). Было получено более 1000 линий иПСК и 5 линий иПСК KIT D816V (3 от пациента 1, 1 от пациента 2 и 1 от пациента 3) и 5 немутированных линий KIT иПСК (2 от пациента 1, 1 от пациента 2 и 2 от пациента 3 (далее именуемые контролем) использовались в этом исследовании. Все 10 линий иПСК были плюрипотентными, что определялось морфологически; экспрессия маркеров плюрипотентности OCT4, NANOG, TRA-1-60 и TRA-1-81; и с помощью анализа Epi-Pluri-Score (Рисунок 1A; дополнительный рисунок 1A-B). 30 Анализ кариотипа всех иПСК показал нормальную полосатость GTG и отсутствие числовых аномалий (дополнительная фигура 1C).
Рисунок 1.
Просмотреть в большом формате Загрузить PPT
Гематопоэтическая дифференциация ИПСК KIT D816V, специфичных для пациента.
(A) KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью аллель-специфичной ПЦР (верхняя панель). KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью секвенирования по Сэнгеру (нижние панели). Контроль 1-3, иПСК без мутации; D816V 1-3, иПСК с мутацией; М, маркер молекулярной массы; W, контроль воды; — клеточная линия НМС-1.1; +, клеточная линия НМС-1.2. (B) Протокол гемопоэтической дифференцировки. ЗТ были сформированы из ИПСК (Ba-b) и дифференцированы в сторону гемопоэтической линии (Bc-d). Масштабные линейки, 500 мкм. (C) Репрезентативный анализ проточной цитометрии KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из иПСК, от пациентов с 1 по 3. Графики представляют собой синхронизированные эксперименты по дифференцировке гемопоэза и показывают фенотипы, характерные для пациентов. Ворота 1, 2 и 3 предназначены для клеток CD45 + /KIT high , CD45 + /KIT + и CD235α + соответственно. (D) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT high для KIT D816V и контрольных клеток, полученных из ИПСК, от всех 3 пациентов (P1, P2 и P3). Проточную цитометрию проводили между 15 и 31 днями гемопоэтической дифференцировки (n = 4-21). * P < .0001. (E) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P ≤ 0,0003. (F) Количественная оценка популяции CD235α + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P < .0001. (G) Анализ КОЕ для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК. Количество колоний и фенотип оценивали через 14 дней после посева. Столбцы показывают среднее количество колоний ± стандартное отклонение ≥3 независимых экспериментов, за исключением контрольных ИПСК пациента 2 (n = 2). * Р = 0,02. (H) Количественные данные RT-PCR для пациента 1, полученного из KIT D816V, и контрольных ИПСК и соответствующих HPC. Результаты получены из 2 и 4 независимых экспериментов по гемопоэтической дифференцировке для контроля и KIT D816V HPC соответственно. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной иерархической кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий представляют собой высокую и низкую экспрессию генов соответственно). Статистический анализ проводился с помощью шкалы Уэлча 9.0035 т тест.Рисунок 1.
Просмотреть в большом формате Загрузить PPT
Гематопоэтическая дифференциация ИПСК KIT D816V, специфичных для пациента. (A) KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью аллель-специфичной ПЦР (верхняя панель). KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью секвенирования по Сэнгеру (нижние панели). Контроль 1-3, иПСК без мутации; D816V 1-3, иПСК с мутацией; М, маркер молекулярной массы; W, контроль воды; — клеточная линия НМС-1.1; +, клеточная линия НМС-1.2. (B) Протокол гемопоэтической дифференцировки. ЗТ были сформированы из ИПСК (Ba-b) и дифференцированы в сторону гемопоэтической линии (Bc-d). Масштабные линейки, 500 мкм. (C) Репрезентативный анализ проточной цитометрии KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из иПСК, от пациентов с 1 по 3.
Графики представляют собой синхронизированные эксперименты по дифференцировке гемопоэза и показывают фенотипы, характерные для пациентов. Ворота 1, 2 и 3 предназначены для клеток CD45 + /KIT high , CD45 + /KIT + и CD235α + соответственно. (D) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT high для KIT D816V и контрольных клеток, полученных из ИПСК, от всех 3 пациентов (P1, P2 и P3). Проточную цитометрию проводили между 15 и 31 днями гемопоэтической дифференцировки (n = 4-21). * P < .0001. (E) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P ≤ 0,0003. (F) Количественная оценка популяции CD235α + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P < .0001. (G) Анализ КОЕ для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК. Количество колоний и фенотип оценивали через 14 дней после посева. Столбцы показывают среднее количество колоний ± стандартное отклонение ≥3 независимых экспериментов, за исключением контрольных ИПСК пациента 2 (n = 2). * Р = 0,02. (H) Количественные данные RT-PCR для пациента 1, полученного из KIT D816V, и контрольных ИПСК и соответствующих HPC. Результаты получены из 2 и 4 независимых экспериментов по гемопоэтической дифференцировке для контроля и KIT D816V HPC соответственно. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной иерархической кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий представляют собой высокую и низкую экспрессию генов соответственно). Статистический анализ проводился с помощью шкалы Уэлча 9.0035 т тест.Близкая модель
Все ИПСК KIT D816V показали пониженную поверхностную экспрессию KIT по сравнению с немутировавшими клетками KIT (дополнительный рисунок 1D-E), что соответствует тому, что KIT D816V ограничивается внутриклеточными компартментами и передает сигналы от них .
KIT D816V и контрольные иПСК проявляют специфичные для пациента фенотипы при гемопоэтической дифференцировке. 9 Кроме того, ИПСК KIT D816V показали сильное фосфорилирование гликозилированных и негликозилированных форм рецептора без стимуляции фактором стволовых клеток (SCF) (дополнительный рисунок 1F). Контрольные иПСК показали очень низкое фосфорилирование гликозилированного KIT; при стимуляции SCF наблюдалась интернализация рецептора и фосфорилирование немутировавших гликозилированных KIT, AKT и STAT3. Эти данные соответствуют KIT D816V, представляющему конститутивно активный рецептор в ИПСК.KIT D816V и контрольные иПСК были индуцированы для дифференцировки в гемопоэтические клетки в протоколе на основе ЭБ (рис. 1В). 31 A CD45 + /KIT высокая популяция MC наблюдалась для KIT D816V и контрольных клеток, полученных из ИПСК. В образцах пациентов 1 и 2 эта популяция была более заметной в KIT 9.
0036 генотипа D816V (рис. 1C-D) и наблюдался в ранние моменты времени (> 14 дней; дополнительный рисунок 2A). KIT D816V придавал клеткам KIT + пролиферативное преимущество, независимо от стимуляции SCF, по сравнению с KIT — немутантными клетками KIT + (дополнительная фигура 2B). KIT D816V также сохранял жизнеспособность клеток после отмены цитокинов. Таким образом, KIT D816V способствует развитию тучных клеток in vitro в нашей модели иПСК и придает гемопоэтическим клеткам большую способность к пролиферации.Кроме того, иПСК проявляли склонность к дифференцировке, специфичной для пациента. Пациент 1. Клетки, полученные из ИПСК KIT D816V, показали выраженную эритроидную популяцию CD235α + CD43 + KIT + ; в анализах КОЕ колонии, образующие взрывообразующую единицу-эритроид (BFU-E), наблюдались только в мутантном генотипе (рис. 1C, F-G; дополнительный рисунок 3A-B).
Цитоспиновые препараты клеток KIT D816V CD235α + выявили различные стадии созревания эритроидных клеток (дополнительная фигура 3C). ИПСК пациента 2 показали заметный CD45 9Популяция 0037 + /KIT + во время дифференцировки с морфологией миелоидных предшественников, сочетающейся с выраженным апоптозом (рис. 1C, E; дополнительная рис. 4). Анализы КОЕ показали сильное смещение в сторону гранулоцитов и макрофагов для KIT D816V и контрольных клеток, тогда как аномальные КОЕ-М небольшого размера наблюдались только в контроле (рис. 1G). Пациент 3 KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из ИПСК, показали заметный CD45 + /KIT высокий 9Популяция 0038 MC (рис. 1C-D; дополнительная рис. 5A). Анализы КОЕ выявили сниженный колониеобразующий потенциал и смещение в сторону линии макрофагов, что согласуется с обилием макрофагов в препаратах цитоспина (рис. 1G; дополнительная рис. 5B).Наконец, клетки, полученные из иПСК, продемонстрировали профили экспрессии гемопоэтических генов, а также воспроизвели эритроидный уклон, наблюдаемый у пациента 1 KIT D816V Гемопоэтические клетки, полученные из иПСК, о чем свидетельствует высокая экспрессия генов гемоглобина HBB , HBE и HBZ (рис.
Комплект D816V IPSCS HARBRE PATED SPECIFIC PROFILES 1H).Предыдущие исследования показали, что мутации, отличные от комплекта D816V у пациентов с продвинутым мастоцитозом, чаще всего в ASXL1 , CBL , 6, , , , , , , , , , , , , . и TET2 , которые коррелируют с плохой выживаемостью. 22,23 В соответствии с этими наблюдениями мы идентифицировали специфичную для пациента подгруппу мутаций в первичных образцах ASM и MCL, которая была воспроизведена в полученных из них ИПСК (таблица 1; дополнительная фигура 6). Особое значение имеет 9Усеченная мутация 0035 NFE2 была идентифицирована одновременно с KIT D816V в ИПСК пациента 1. У пациента 2 внутрирамочная 8-аа-делеция SRSF2 (P95_R102del) была обнаружена во всех клеточных линиях ИПСК, тогда как дополнительные вероятно патогенные мутации в RUNX1 и TET2 были обнаружены только в контрольных ИПСК.
В первичном образце от пациента 3 не было обнаружено KIT D816V или другой патогенной или вероятно патогенной мутации, что согласуется с низким числом 9Получено 0035 KIT ИПСК D816V (скринировано 1/129). Наличие различных одновременных мутаций отражает клональный состав и генетическую сложность патологии СМ и подчеркивает ценность линий ИПСК, полученных в этом исследовании, в качестве инструмента для моделирования заболеваний и скрининга соединений.Таблица 1.
Мутации, обнаруженные с помощью NGS, и частота их аллелей в первичных образцах от пациентов 1, 2 и 3 и полученных ИПСК
. Стенограмма . Местоположение . г. HGVS . стр. HGVS . Класс мутаций† . Первичная проба, % . Д816В 1, % . Д816В 2, % . Д816В 3, % . Контроль 1, % . Контроль 2, % . Patient 1 ABL1 NM_007313 E11 c.2972C>T p.Ser991Leu 2 52 50 47 62 46 49 ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 100 100 100 KIT NM_000222 E17 c. 2447A>T p.Asp816Val 5 41 54 49 51 — — NFE2 NM_006163 E3 c.782_785del p.Glu261Alafs*3 4 32 — 48 48 — — NRAS NM_002524 E2 c.35G>A p.Gly12Asp 5 1 — — — 50 48 TET2 NM_001127208 E3 c.2917delT p.Cys973Alafs*34 4 1 — — — 48 48 TET2 NM_001127208 E11 c . 5284a> GP.Ile1762VAL 2 99 100 100 100 100 100 767685 100100 - 76767677676767676767676767676767697676767697697676767697697697697676767689н
77697697697697697697697697697697697697697697697697697697979н .0080 E4 c.215C>G p.Pro72Arg 2 64 61 60 54 51 52 Patient 2 ABL1 NM_007313 E11 c.2173G>A p.Gly725Ser 
«> 2 51 52 50 ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 IDH2 NM_005896 E67080 C.532G> 708080808080808080808080808080808080808080808080.>.00802 46 49 48 KIT NM_000222 E17 c.2447A>T p.Asp816Val 5 35 41 — PDGFRA NM_006206 E10 c.1432T>C p. Ser478Pro 1 48 51 53 RUNX1 NM_001754 E4 c.302_318del p.Val101Alafs*31 4 11 — 47 RUNX1 NM_001754 E5 c.399G>A p.Met133Ile 3 34 50 — SRSF2 NM_003016 E1 c.284_307del p.Pro95_Arg102del 4 73 62 67 TET2 NM_001127208 E6 c. 3781C>T p.Arg1261Cys 3 31 50 — TET2 NM_001127208 E7 c.3876C>G p.Ser1292Arg 3 50 52 54 TET2 NM_001127208 E10 c.4393C>T p.Arg1465Ter 4 8.5 — 46 TP53 NM_000546 E4 c.215C>G p.Pro72Arg 2 100 100 100 Пациент 3 . 0093ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 100 KIT NM_000222 E17 c.2447A>T p.Asp816Val 5 — 48 — — PDGFRA NM_006206 E10 c.1432T>C p.Ser478Pro 1 38 51 47 48 TET2 NM_001127208 E3 c.100C>T p.Leu34Phe 2 55 48 
«> 48 53 TET2 NM_001127208 E3 c.652G>A p.Val218Met 1 50 52 52 49 TET2 NM_001127208 E11 c.5284A>G p.Ile1762Val 2 46 49 46 48 TET2 NM_001127208 E11 c.5333A>G p.His1778Arg 2 55 53 52 52 TP53 NM_000546 E4 c.215C >G p.Pro72Arg 2 
«> 100 100 99 100
9000.. HGVS, обозначение Общества вариаций генома человека на уровне транскрипта; п. HGVS, обозначение Общества вариаций генома человека на уровне белка; — мутация не обнаружена.. Стенограмма . Местоположение . г. HGVS . стр. HGVS . Класс мутаций† . Первичная проба, % . Д816В 1, % . Д816В 2, % . Д816В 3, % . Контроль 1, % . Контроль 2, % . Patient 1 ABL1 NM_007313 E11 c.2972C>T p.Ser991Leu 
«> 2 52 50 47 62 46 49 ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 100 100 100 KIT NM_000222 E17 c.2447A>T p.Asp816Val 5 41 54 49 51 — — NFE2 NM_006163 E3 c.782_785del p.Glu261Alafs*3 4 32 — 48 48 — — NRAS NM_002524 E2 c. 35G>A p.Gly12Asp 5 1 — — — 50 48 TET2 NM_001127208 E3 c.2917delT p.Cys973Alafs*34 4 1 — — — 48 48 TET2 NM_001127208 E11 c .5284a> G P.Ile1762VAL 2 99 100 100 100 100 100 767685 100100 - 76767677676767676767676767676767697676767697697676767697697697697676767689н
77697697697697697697697697697697697697697697697697697697979н .0080 E4 c.215C>G p. Pro72Arg 2 64 61 60 54 51 52 Patient 2 ABL1 NM_007313 E11 c.2173G>A p.Gly725Ser 2 51 52 50 ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 IDH2 NM_005896 E67080 C.532G> 708080808080808080808080808080808080808080808080. >.00802 46 49 48 KIT NM_000222 E17 c.2447A>T p.Asp816Val 5 35 41 — PDGFRA NM_006206 E10 c.1432T>C p.Ser478Pro 1 48 51 53 RUNX1 NM_001754 E4 c.302_318del p.Val101Alafs*31 4 11 — 47 RUNX1 NM_001754 E5 c. 399G>A p.Met133Ile 3 34 50 — SRSF2 NM_003016 E1 c.284_307del p.Pro95_Arg102del 4 73 62 67 TET2 NM_001127208 E6 c.3781C>T p.Arg1261Cys 3 31 50 — TET2 NM_001127208 E7 c.3876C>G p.Ser1292Arg 3 50 52 54 TET2 NM_001127208 E10 c. 4393C>T p.Arg1465Ter 4 8.5 — 46 TP53 NM_000546 E4 c.215C>G p.Pro72Arg 2 100 100 100 Пациент 3 .0093 ASXL1 NM_015338 E12 c.2444T>C p.Leu815Pro 1 100 100 100 100 KIT NM_000222 E17 c. 2447A>T p.Asp816Val 5 — 48 — — PDGFRA NM_006206 E10 c.1432T>C p.Ser478Pro 1 38 51 47 48 TET2 NM_001127208 E3 c.100C>T p.Leu34Phe 2 55 48 48 53 TET2 NM_001127208 E3 c.652G>A p.Val218Met 1 50 52 52 49 TET2 NM_001127208 E11 c. 5284A>G p.Ile1762Val 2 46 49 46 48 TET2 NM_001127208 E11 c.5333A>G p.His1778Arg 2 55 53 52 52 TP53 NM_000546 E4 c.215C > G P.PRO72ARG 2 100 100 99 100 †
1, непатогенный или не имеющий клинического значения; 2, скорее всего, непатогенный или мало клинически значимый; 3 — вариант неопределенного значения; 4, вероятно патогенные или имеющие клиническое значение; 5, определенно патогенные или имеющие клиническое значение.
Увеличить
KIT ЭСК D816V резюмируют фенотипы KIT ИПСК D816VЧтобы ответить на вопрос о потенциальном влиянии одновременных мутаций на дифференцировку СМ ИПСК, мы ввели KIT Мутация D816V в ЭСК человека с помощью технологии CRISPR/Cas9n (дополнительная фигура 7). Как наблюдалось для иПСК KIT D816V, поверхностная экспрессия рецептора KIT в ЭСК KIT D816V была ниже, чем в контрольных ЭСК, хотя не было обнаружено различий в экспрессии матричной РНК (мРНК) KIT (дополнительная фигура 8A). Сильное фосфорилирование негликозилированного рецептора KIT D816V также наблюдалось в вестерн-блоттинге (дополнительная фигура 8B-C).
9Дифференцировка 0035 KIT D816V ESC дала > 95% CD45 + гемопоэтических клеток, включая CD45 + /KIT high MC (рис. 2А; дополнительная рис. 9). Важно отметить, что гемопоэтические клетки, полученные из ЭСК KIT D816V, показали эритроидный уклон, хотя он не был таким заметным, как в клетках, полученных из иПСК KIT D816V от пациента 1 (CD235 + ESC D816V 1 = 8,0 ± 2,9; CD237 90 + ЭСК D816V 2 = 9,6 ± 3,9; CD235 + пациента 1 D816V = 24,6 ± 14,5, размер популяции в процентах от живых клеток).
Соответственно, цитоспиновые препараты показали большее количество ядерных эритроцитов в течение 9Клетки 0035 KIT D816V (рис. 2А). В анализах КОЕ эритроидная колониеобразующая единица (КОЕ-Э) и БОЕ-Э наблюдались только для мутировавших предшественников, и наблюдалась более высокая экспрессия генов гемоглобина HBB , HBE и HBZ (рис. 2А, CD). Для популяций KIT D816V и контрольных CD45 + /KIT high MC значимых различий не наблюдалось, что согласуется с сообщением о слабом онкогенном эффекте KIT D816V в отдельности. 33 В совокупности эти результаты демонстрируют, что ЭСК KIT D816V повторяют фенотипы, наблюдаемые в иПСК KIT D816V, полученных от пациентов, такие как конститутивное фосфорилирование KIT, снижение поверхностной экспрессии мутантного рецептора и смещение эритроидного ряда при гемопоэтической дифференцировке.Рисунок 2.
Просмотреть в большом формате Скачать PPT0035 КОМПЛЕКТ ИПСК D816V.
(A) Анализ методом проточной цитометрии KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ЭСК, через 11 дней после селекции CD34 + MACS (верхние панели). Заметные популяции CD235α + и CD45 + /KIT high наблюдаются в клетках, полученных из ЭСК KIT D816V. В цитоспиновых препаратах тех же образцов показаны ядерные эритроциты (красные стрелки) (нижние панели). Шкала баров, 50 мкм. (B) Количественная оценка популяций гемопоэтических клеток (n = 4), полученных из KIT D816V клон 1 и D816V клон 2 ЭСК и контрольные ЭСК. KIT D816V ESC демонстрируют заметные популяции CD45 + /KIT + и CD235 + . Популяции CD45 + /KIT high MC не отличались статистически значимо для KIT D816V и контроля. (C) Количественные данные RT-PCR для KIT D816V и контрольных ESC и соответствующих HPC через 11 дней после обогащения CD34 + с помощью MACS. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий, высокая и низкая экспрессия генов соответственно). (D) анализ КОЕ гемопоэтических клеток, полученных из КОМПЛЕКТ D816V и ESC управления. Столбики показывают среднее значение ± стандартное отклонение для 3 независимых экспериментов. * P < 0,05, тест Уэлча t . G, гранулоцит; ГМ, гранулоциты, макрофаги; М, макрофаги.Рисунок 2.
Просмотр LARGEDOWNLOAD PPT
KIT D816V ESCS Среди комплект HIGH и фенотип ERYTHROUID PETAPI KIT D816V IPSCS. (A) Анализ проточной цитометрии KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из ЭСК, через 11 дней после селекции CD34 + MACS (верхние панели). Заметные популяции CD235α + и CD45 + /KIT high наблюдаются в клетках, полученных из ЭСК KIT D816V.
В цитоспиновых препаратах тех же образцов показаны ядерные эритроциты (красные стрелки) (нижние панели). Шкала баров, 50 мкм. (B) Количественная оценка популяций гемопоэтических клеток (n = 4), полученных из KIT D816V клон 1 и D816V клон 2 ESC и контрольных ESC. KIT D816V ESC демонстрируют заметные популяции CD45 + /KIT + и CD235 + . Популяции CD45 + /KIT high MC не отличались статистически значимо для KIT D816V и контроля. (C) Количественные данные RT-PCR для KIT D816V и контрольных ESC и соответствующих HPC через 11 дней после обогащения CD34 + с помощью MACS. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий, высокая и низкая экспрессия генов соответственно). (D) анализ КОЕ гемопоэтических клеток, полученных из КОМПЛЕКТ D816V и ESC управления. Столбики показывают среднее значение ± стандартное отклонение для 3 независимых экспериментов. * P < 0,05, тест Уэлча t . G, гранулоцит; ГМ, гранулоциты, макрофаги; М, макрофаги.Близкая модель
ИТК нинтеданиб нацелен на
KIT D816V гемопоэтические клеткиДалее мы сосредоточились на идентификации соединений, которые избирательно воздействуют на KIT D816V гемопоэтические клетки, полученные из иПСК. Библиотека из 459 соединений была сначала протестирована на клеточных линиях HMC-1 (дополнительный рисунок 10; дополнительная таблица 5), а выбранные соединения были дополнительно проанализированы на полученных из ИПСК KIT гемопоэтические клетки D816V (фиг. 3A-B). Мы идентифицировали нинтеданиб как мощный ингибитор KIT D816V, значительно снижающий жизнеспособность гемопоэтических клеток KIT D816V у всех 3 пациентов в наномолярном диапазоне (50% ингибирующая концентрация [IC50] D816V = 27,5-104,9 нМ; IC50 контроль = 262,1-541,7 нМ).
Мы также включили в наши исследования мидостаурин и иматиниб, поскольку мидостаурин используется для лечения пациентов с распространенным СМ, тогда как иматиниб неэффективен в 9 случаях.0035 КОМПЛЕКТ D816V СМ. 15-17,20 Нинтеданиб и мидостаурин показали схожую активность на клетках KIT D816V, и, как и ожидалось, иматиниб был практически неэффективен. Ригосертиб, миметик RAS, также был протестирован, поскольку онкогенные мутации RAS часто встречаются при гематологических злокачественных новообразованиях, включая SM. 2,34 Лечение ригосертибом клеток, полученных из иПСК, не показало специфичности в отношении клеток KIT D816V, и ответ у разных пациентов был разным (рис. 3В).Рисунок 3.
Посмотреть большую загрузку PPT
Тестирование соединений на гемопоэтических клетках, полученных из KIT D816V иПСК/ЭСК, и оценка влияния нинтеданиба на образцы пациентов с СМ. (A) Кривые лекарственной реакции (0–10 мкМ) для нинтеданиба, мидостаурина и иматиниба на KIT D816V (n = 1–4) и контроле (n = 2) полученных из иПСК KIT + гемопоэтических клеток пациента 1.
Значения IC50 рассчитывали на основании усредненных кривых титрования, полученных для клеток, полученных из разных линий ИПСК. Значения IC50 для нинтеданиба составляли от 27 до 105 нМ в течение KIT клеток D816V и от 262 до 542 нМ для контрольных клеток. (B) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных клеток KIT + , полученных из иПСК, обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина, иматиниба или ригосертиба в течение 66 часов. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля (0 нМ). Пациент 1: n = 6-12. Пациент 2: n = 3-9. Пациент 3: n = 6-9. * P ≤ 0,05, ** P < 0,001, *** P ≤ 0,0001, ответ на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными клетками KIT + при той же концентрации препарата, тест Уэлча t . (C) Репрезентативный Вестерн-блот анализ передачи сигналов рецептора KIT при обработке нинтеданибом или мидостаурином гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК KIT D816V. Клетки обрабатывали 1 мкМ соединения в течение 4 часов перед анализом. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Указаны положения маркеров молекулярной массы. (D) Кривые ответа нинтеданиба (0–10 мкМ) для первичного образца SM (пациент 10) и здорового донора (HD; n = 2). МНК были подвергнуты MACS, и KIT 9Клетки 0037+ и KIT — обрабатывали нинтеданибом в течение 66 часов с последующим измерением жизнеспособности с помощью анализа CellTiter Glo. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Нинтеданиб проявляет цитотоксичность по отношению к здоровым донорским клеткам только при концентрациях, близких к 10 мкМ, тогда как жизнеспособность клеток серьезно снижается при концентрациях > 100 нМ. (E) Усредненный ответ от 7 до 11 первичных образцов SM и от 6 до 8 первичных образцов HD на обработку 1 мкМ нинтеданиба или мидостаурина. МНК обрабатывали, как описано в (D). Лечение нинтеданибом привело к значительному снижению жизнеспособности KIT 9. 0037 + SM MNC, тогда как мидостаурин одинаково нацелен на клетки KIT + и KIT — . Кроме того, нинтеданиб не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток HD, в отличие от мидостаурина, который приводил к значительному снижению жизнеспособности клеток KIT + и KIT — HD. * P ≤ 0,0003, тест Уэлча t .Рис. 3.
Посмотреть в большом формате Загрузить PPT
Тестирование соединений на KIT Гемопоэтические клетки, полученные из иПСК/ЭСК D816V, и оценка влияния нинтеданиба на образцы пациентов с СМ. (A) Кривые лекарственной реакции (0–10 мкМ) для нинтеданиба, мидостаурина и иматиниба на KIT D816V (n = 1–4) и контроле (n = 2) полученных из иПСК KIT + гемопоэтических клеток пациента 1. Значения IC50 рассчитывали на основании усредненных кривых титрования, полученных для клеток, полученных из разных линий ИПСК. Значения IC50 для нинтеданиба составляли от 27 до 105 нМ для клеток KIT D816V и от 262 до 542 нМ для контрольных клеток.
(B) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольные клетки KIT + , полученные из ИПСК, обработанные 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина, иматиниба или ригосертиба в течение 66 часов. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля (0 нМ). Пациент 1: n = 6-12. Пациент 2: n = 3-9. Пациент 3: n = 6-9. * P ≤ 0,05, ** P < 0,001, *** P ≤ 0,0001, реакция клеток KIT D816V против контрольных клеток KIT + при той же концентрации препарата, критерий Welch’s t тест. (C) Репрезентативный вестерн-блот-анализ передачи сигналов рецептора KIT при лечении 9 нинтеданибом или мидостаурином.0035 KIT D816V Кроветворные клетки, полученные из иПСК. Клетки обрабатывали 1 мкМ соединения в течение 4 часов перед анализом. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Указаны положения маркеров молекулярной массы. (D) Кривые ответа нинтеданиба (0–10 мкМ) для первичного образца SM (пациент 10) и здорового донора (HD; n = 2). МНК подвергали MACS, а клетки KIT + и KIT — обрабатывали нинтеданибом в течение 66 часов с последующим измерением жизнеспособности с использованием анализа CellTiter Glo. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Нинтеданиб проявляет цитотоксичность по отношению к здоровым донорским клеткам только при концентрациях, близких к 10 мкМ, тогда как жизнеспособность клеток серьезно снижается при концентрациях > 100 нМ. (E) Усредненный ответ от 7 до 11 первичных образцов SM и от 6 до 8 первичных образцов HD на обработку 1 мкМ нинтеданиба или мидостаурина. МНК обрабатывали, как описано в (D). Лечение нинтеданибом привело к значительному снижению жизнеспособности KIT 9.0037 + SM MNC, тогда как мидостаурин одинаково нацелен на клетки KIT + и KIT — . Кроме того, нинтеданиб не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток HD, в отличие от мидостаурина, который приводил к значительному снижению жизнеспособности клеток KIT + и KIT — HD. * P ≤ 0,0003, тест Уэлча t .Близкий модальный
Далее мы сравнили реакцию на лекарственные препараты KIT + и KIT — и наблюдали селективное нацеливание нинтеданиба и мидостаурина на клетки KIT + , которое было более выражено в клетках KIT D816V, чем в контрольных клетках (дополнительная фигура 11A). Вестерн-блот анализ клеток, полученных из иПСК, обработанных нинтеданибом или мидостаурином, выявил эффективное снижение фосфорилирования KIT и STAT3; эти эффекты были более выражены в образцах, получавших нинтеданиб, в которых наблюдалось значительное снижение общего белка KIT (рис. 3C; дополнительная рис. 12).
Важно отметить, что активность нинтеданиба и мидостаурина и более высокая селективность в отношении клеток KIT + по сравнению с клетками KIT — также наблюдались в клетках, полученных из ЭСК KIT D816V (дополнительная фигура 11B-D).
Таким образом, клетки, полученные из ЭСК KIT D816V, полностью повторяют гемопоэтические фенотипы и реакции на лекарственные препараты, наблюдаемые для клеток, полученных из ИПСК KIT D816V, и дополнительно подтверждают, что KIT D816V является ценной мишенью при СМ.Чтобы оценить, влияет ли стадия происхождения и дифференцировки клеток, полученных из иПСК, на ответ на лекарство, мы использовали MACS для выбора CD34 + HPC из гемогенного эндотелия и расширенных клеток в течение дополнительных 10-20 дней. Опять же, сильное снижение жизнеспособности мутантных клеток KIT + наблюдалось при обработке нинтеданибом или мидостаурином (дополнительная фигура 13A-C). Кроме того, CD34 + HPC демонстрировали такое же смещение клеточной судьбы, как и клетки, полученные непосредственно из ИПСК, например смещение эритроидного ряда, наблюдаемое у пациента 1 (дополнительная фигура 13D).
Далее мы сравнили ответы KIT D186V Гематопоэтические клетки, полученные из иПСК, на нинтеданиб, авапритиниб (BLU-2815) или рипретиниб (DCC-2618), поскольку последние 2 соединения проходят клинические испытания при распространенном СМ.
19-21,35 Авапритиниб и рипретиниб эффективно снижали жизнеспособность клеточных линий HMC-1.1 и HMC-1.2 и фосфорилирование KIT, STAT5, AKT и ERK (дополнительная фигура 14), что согласуется с предыдущими исследованиями. 19,21,35 Наконец, как и в случае с нинтеданибом, авапритиниб и рипретиниб преимущественно снижали жизнеспособность полученных из ИПСК 9Ячейки 0035 KIT D816V (дополнительный рисунок 15). Эти результаты показывают селективность авапритиниба и рипретиниба в отношении KIT D816V и подтверждают надежность системы ИПСК KIT D816V, установленной в этом исследовании.Затем мы оценили влияние лечения нинтеданибом на жизнеспособность первичных образцов KIT D816V/H и KIT S476I SM. Снижение жизнеспособности клеток ≥50% наблюдалось для 6 из 9 образцов первичных мононуклеарных клеток (MNC) (дополнительная фигура 16A; дополнительная таблица 6). Кроме того, нинтеданиб преимущественно нацелен на KIT 9.0037 + первичных МНК по сравнению с KIT — первичных МНК, что привело к снижению жизнеспособности клеток ≥50% в 6 из 11 первичных образцов.
KIT D816V ТК, происходящие из иПСК, являются мишенями для нинтеданиба Напротив, мидостаурин показал меньшую селективность и воздействовал на первичные клетки KIT + и KIT — от пациентов со СМ и здоровых доноров (рис. 3D-E; дополнительная фигура 16B; дополнительная таблица 6). Лечение нинтеданибом привело к снижению аллельной нагрузки KIT D816V в SM MNC (дополнительная фигура 16C), а степень ответа на нинтеданиб положительно коррелировала с мутационной нагрузкой KIT D816V/H (дополнительная фигура 17A). Вестерн-блоттинг показал сильное снижение фосфорилирования KIT, STAT5 и ERK в первичном образце KIT D816H SM при обработке нинтеданибом (1 мкМ) (дополнительная фигура 17B), что согласуется с данными, полученными с использованием нашей модели на основе iPSC.A CD45 + /KIT высокая Популяция ТК была получена в более поздние моменты гемопоэтической дифференцировки для всех KIT, использованных в контрольных линиях ИПСК , и D86V контрольных линий D86V исследование (рис.
4А). KIT D816V MC показали более высокую поверхностную и генную экспрессию FCER1A, чем контрольные клетки, тогда как для CD45 и KIT различий не наблюдалось (рис. 4B, E). Флуоресцентно-активированные клеточные сортировки (FACS)-очищенные СК выявили гомогенную клеточную популяцию с многодольчатыми ядрами и некоторые более крупные клетки с метахроматическими и триптазо-положительными цитоплазматическими гранулами, признаками незрелых СК (рис. 4C-D; дополнительная фигура 18). Количественный анализ RT-PCR показал высокую экспрессию продуктов гена триптазы TPSAB1 и TPSB2, тогда как экспрессия мРНК карбоксипептидазы A3 и CMA1 была довольно низкой (рис. 4E).Рисунок 4.
Просмотреть в большом формате Загрузить PPT
Нинтеданиб нацелен на KIT D816V MC. (A) Анализ методом проточной цитометрии KIT D816V и контрольных CD45 + + /KIT high MC, полученных из иПСК, при >30 днях дифференцировки (пациент 1).
(B) KIT D816V MC (красный) демонстрируют более высокую экспрессию FCER1A по сравнению с контрольными клетками (синий) (верхняя панель; пунктирная линия показана в качестве ссылки). Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) FCER1A (n = 6-9), KIT (n = 18–19) и CD45 (n = 15–17) на KIT D816V MC и элементах управления (нижние панели) * P = 0,017, тест Уэлча t . ( C ) Репрезентативные составные изображения цитоспинов, окрашенных кислым толуидиновым синим (левые панели) или мазков (правые панели) KIT D816V, отсортированных с помощью FACS, и контрольных MC (сборка изображений обозначена пунктирными линиями). Наблюдалась гомогенная популяция многодольчатых промастоцитов с метахроматическими гранулами (стрелки) или без них (стрелки). Шкала баров, 25 мкм. (D) То же, что и в (C), но окрашено на триптазу. Наблюдались клетки с высоким (стрелки) и низким (стрелки) количеством триптазоположительных гранул. Шкала баров, 25 мкм. Полные репрезентативные изображения (C) и (D) см. на дополнительном рисунке 18. (E) Количественный анализ ОТ-ПЦР для KIT D816V и контрольные СК, отсортированные по FACS (n = 9–15 и n = 3–7 соответственно). Экспрессия мРНК MC-специфичной химазы 1 ( CMA1 ), триптазы α/β 1 ( TPSAB1 ), триптазы β2 ( TPSB2 ), карбоксипептидазы A3 ( CPA3 ), KIT 3 909 и FCER1A изображено. KIT D816V ТК демонстрируют более высокую экспрессию мРНК FCER1A по сравнению с немутировавшими клетками KIT . * P = 0,014, тест Уэлча t . (F) Кривые реакции на лекарство для FACS-сортированных KIT D816V и контрольные ТК (n = 5 и n = 4, соответственно, полученные из 2 линий иПСК KIT D816V и 1 контрольной линии иПСК), получавших нинтеданиб, мидостаурин или иматиниб. Значения IC50 нинтеданиба составляли 34 и 633 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. Значения IC50 мидостаурина составляли 48 и 570 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (G) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных СК, полученных из ИПСК, отсортированных с помощью FACS (n = 9-15 и n = 12 соответственно), обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина или иматиниба. * P = 0,02, ** P ≤ 0,0006, реакция на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными MC при той же концентрации лекарства, тест Уэлча t . нс, не имеет значения.. (A) Анализ методом проточной цитометрии KIT D816V и контрольного CD45, полученного из иПСК + /KIT высокая ТК при дифференцировке >30 дней (пациент 1). (B) KIT D816V MC (красный) демонстрируют более высокую экспрессию FCER1A по сравнению с контрольными клетками (синий) (верхняя панель; пунктирная линия показана в качестве ссылки). Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) FCER1A (n = 6–9), KIT (n = 18–19) и CD45 (n = 15–17) на KIT D816V MC и контролях (нижние панели) * P = 0,017, тест Уэлча t .
( C ) Репрезентативные составные изображения цитоспинов, окрашенных кислым толуидиновым синим (левые панели) или мазков (правые панели) 9, отсортированных с помощью FACS.0035 KIT D816V и контрольные МК (изображение в сборе обозначено пунктиром). Наблюдалась гомогенная популяция многодольчатых промастоцитов с метахроматическими гранулами (стрелки) или без них (стрелки). Шкала баров, 25 мкм. (D) То же, что и в (C), но окрашено на триптазу. Наблюдались клетки с высоким (стрелки) и низким (стрелки) количеством триптазоположительных гранул. Шкала баров, 25 мкм. Полные репрезентативные изображения (C) и (D) см. на дополнительном рисунке 18. (E) Количественный анализ ОТ-ПЦР для KIT D816V и контрольные СК, отсортированные по FACS (n = 9–15 и n = 3–7 соответственно). Экспрессия мРНК MC-специфичной химазы 1 ( CMA1 ), триптазы α/β 1 ( TPSAB1 ), триптазы β2 ( TPSB2 ), карбоксипептидазы A3 ( CPA3 ), KIT 3 909 и FCER1A изображено. KIT D816V ТК демонстрируют более высокую экспрессию мРНК FCER1A по сравнению с немутировавшими клетками KIT . * P = 0,014, тест Уэлча t . (F) Кривые реакции на лекарство для FACS-сортированных KIT D816V и контрольные ТК (n = 5 и n = 4, соответственно, полученные из 2 линий иПСК KIT D816V и 1 контрольной линии иПСК), получавших нинтеданиб, мидостаурин или иматиниб. Значения IC50 нинтеданиба составляли 34 и 633 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. Значения IC50 мидостаурина составляли 48 и 570 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (G) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных СК, полученных из ИПСК, отсортированных с помощью FACS (n = 9-15 и n = 12 соответственно), обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина или иматиниба. * P = 0,02, ** P ≤ 0,0006, реакция на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными MC при той же концентрации лекарства, тест Уэлча t . нс, не имеет значения.Близкая модель
Важно отметить, что, как наблюдалось для гемопоэтических клеток-предшественников, KIT D816V MC продемонстрировали заметное снижение жизнеспособности клеток при лечении нинтеданибом по сравнению с контрольными клетками (пациент 1 IC50 D816V = 34,7 нМ; пациент 3 IC50 D816V = 34,6 нМ; пациент 1 IC50 контроль = 633,2 нМ; Рисунок 4F-G).
В соответствии с нашими данными по ТК, полученным из ИПСК, ТК ROSA KIT D816V 36 сильно реагировали на нинтеданиб in vitro (дополнительная фигура 19А). Лечение мышей NSG с привитым ROSA KIT D816V нинтеданибом приводило к уменьшению популяции этих клеток в периферической крови и селезенке, тогда как в BM эффект не наблюдался (дополнительная фигура 19).Б-Г).
Нинтеданиб преимущественно воздействует на гемопоэтические клетки, полученные из иПСК, а не на эндотелиальные клетки, полученные из иПСК.
37,38 Повышенный ангиогенез в инфильтратах СК КМ является ключевым гистопатологическим признаком у пациентов с СМ. 39 Таким образом, мы определили влияние нинтеданиба на эндотелиальные клетки, полученные из SM KIT D816V и контрольных ИПСК (рис. 5А). KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, экспрессировали CD31, CD34, CD105, CD144 и KIT и были способны поглощать липиды (ацетилированные ЛПНП) (рис. 5B-E). Нинтеданиб снижал жизнеспособность KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток, и значительные различия в реакции на лекарство наблюдались при 1 мкМ соединения (фиг. 5F). Активность нинтеданиба в отношении клеток, полученных из ИПСК, была сравнима с таковой, наблюдаемой в эндотелиальных клетках, полученных из костного мозга человека (дополнительная фигура 20). Важно отметить, что цитотоксические эффекты были в 20-100 раз более выраженными на гемопоэтических клетках-предшественниках и тучных клетках, полученных из иПСК, чем на эндотелиальных клетках, независимо от наличия мутации KIT D816V (рис. 5G).Рисунок 5.
Открыть большую загрузку PPT
Оценка активности нинтеданиба на эндотелиальных клетках, полученных из ИПСК. (A) Эндотелиальная дифференцировка для KIT D816V или контрольных ИПСК. Показаны репрезентативные фазово-контрастные микроскопические изображения дней 1, 7, 11 и 14. Масштабные линейки, 500 мкм.
(B) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, экспрессируют эндотелиальные маркеры CD34, CD31, CD105 и CD144, но не экспрессируют CD45 и CD43. (С) KIT Эндотелиальные клетки D816V (красные) имеют более низкую экспрессию рецептора KIT на поверхности по сравнению с контрольными клетками (синие), как показано на репрезентативных графиках; изотип-контроль показан серым цветом (n = 3) * P = 0,0005. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток показало гомогенную поверхностную экспрессию CD31 (левые панели) и CD144 (средние панели). Клетки эффективно поглощали ацетилированные ЛПНП, конъюгированные с Dil (правые панели). Ядра окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий). Масштабные линейки, 100 мкм. (E) Количественные данные ОТ-ПЦР показывают аналогичную экспрессию CD31, CD34 и CD144 в KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки. Экспрессия мРНК KIT была несколько выше в мутантных клетках (n = 4-5). * P = 0,03. (F) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные от ИПСК пациентов 1 и 3, показали сходные кривые ответа на нинтеданиб (левая панель; n = 2-3). Пациент 1 (P1), IC50 D816V = 1632 нМ и IC50 контроля = 7003 нМ; пациент 3 (P3), IC50 D816V = 2073 нМ и IC50 контроля = 3803 нМ). 9Эндотелиальные клетки 0035 KIT D816V были более подвержены влиянию обработки 1 мкМ нинтеданиба, чем немутированные клетки (правая панель; n = 3-4). * P < 0,01, тест Уэлча t . (G) Сравнение кривых ответа на лекарство, полученных для KIT D816V (левая панель) или контрольных (правая панель) эндотелиальных клеток (n = 2-3), HPC (из рисунка 3) и MC (из рисунка 4), обработанных с помощью нинтеданиб (от 1 нМ до 10 мкМ). НД, не обнаружено.Рисунок 5.
Посмотреть в большом размереСкачать PPT
Оценка активности нинтеданиба на эндотелиальных клетках, полученных из ИПСК.
(A) Эндотелиальная дифференцировка для KIT D816V или контрольных ИПСК. Показаны репрезентативные фазово-контрастные микроскопические изображения дней 1, 7, 11 и 14. Масштабные линейки, 500 мкм. (B) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, экспрессируют эндотелиальные маркеры CD34, CD31, CD105 и CD144, но не экспрессируют CD45 и CD43. (C) Эндотелиальные клетки KIT D816V (красные) имеют более низкую экспрессию рецептора KIT на поверхности по сравнению с контрольными клетками (синие), как показано на репрезентативных графиках; изотип-контроль показан серым цветом (n = 3) * Р = .0005. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток показало гомогенную поверхностную экспрессию CD31 (левые панели) и CD144 (средние панели). Клетки эффективно поглощали ацетилированные ЛПНП, конъюгированные с Dil (правые панели). Ядра окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий). Масштабные линейки, 100 мкм. (E) Количественные данные ОТ-ПЦР показывают аналогичную экспрессию CD31, CD34 и CD144 в KIT D816V и контрольных эндотелиальных клетках. КОМПЛЕКТ 9Экспрессия мРНК 0036 была несколько выше в мутантных клетках (n = 4-5). * P = 0,03. (F) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные от ИПСК пациентов 1 и 3, показали сходные кривые ответа на нинтеданиб (левая панель; n = 2-3). Пациент 1 (P1), IC50 D816V = 1632 нМ и IC50 контроля = 7003 нМ; пациент 3 (P3), IC50 D816V = 2073 нМ и IC50 контроля = 3803 нМ). KIT Эндотелиальные клетки D816V были более подвержены воздействию 1 мкМ нинтеданиба, чем немутированные клетки (правая панель; n = 3–4). * P < 0,01, тест Уэлча t . (G) Сравнение кривых ответа на лекарство, полученных для KIT D816V (левая панель) или контрольных (правая панель) эндотелиальных клеток (n = 2-3), HPC (из рисунка 3) и MC (из рисунка 4), обработанных с помощью нинтеданиб (от 1 нМ до 10 мкМ). НД, не обнаружено.Близкая модель
Нинтеданиб занимает сайт связывания АТФ в KIT D816V
Нинтеданиб является производным индолинона, ингибитором киназы II типа VEGFR, рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) и рецептора фактора роста фибробластов. 37,38 Он связывается с сайтом связывания аденозинтрифосфата (АТФ), расположенным между С- и N-концевыми долями киназного домена VEGFR. 37 Таким образом, мы сравнили сайт связывания нинтеданиба в VEGFR2 (код PDB 3C7Q) с сайтами связывания АТФ всех доступных структур KIT (немутированного и KIT D816V; дополнительная фигура 21A). Наш анализ выявил геометрическое сходство VEGFR2 и KIT и стерическое соответствие нинтеданиба неактивному рецептору KIT, что согласуется с биологическими данными, представленными в этом исследовании. Исследования индуцированного молекулярного докинга показали, что в среднем нинтеданиб имеет более высокое сродство (оцениваемое здесь как показатель скольжения) к неактивному KIT D816V (на основе кода 3G0F в PDB), чем к немутированному KIT как в его неактивном, так и в активном состоянии (код в PDB 3G0E).
и 1PKG соответственно, дополнительная фигура 21B). Нинтеданиб предпочтительно связывается с KIT D816V, ориентируя индольную часть к А-петле, а метилпиперазиновую часть к С-концевой области (дополнительная фигура 22).Дальнейший анализ показал, что мидостаурин и авапритиниб проявляют более высокое сродство к активному немутированному рецептору KIT и низкое сродство к неактивному KIT (немутированному или KIT D816V), тогда как рипретиниб и иматиниб продемонстрировали предпочтение неактивного KIT (немутированного или KIT D816V) по сравнению с активным конформация (дополнительные рисунки 21B и 23), в соответствии с предыдущими отчетами. 19,40
Аналоги нинтеданиба являются мощными ингибиторами KIT D816V
Чтобы еще больше расширить взаимосвязь между структурой и функцией между нинтеданибом и KIT D816V, мы провели скрининг библиотеки из 43 аналогов нинтеданиба с 80% до 98% структурного сходства с нинтеданибом (дополнительная таблица 7).
Соединения тестировали на KIT D816V и контрольных гемопоэтических клетках, полученных из иПСК; 7 из них преимущественно нацелены на клетки KIT D816V (рис. 6А). Четыре соединения (BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS и BIBE3316BS) были дополнительно оценены и показали значения IC50, аналогичные нинтеданибу (рис. 6B-C).Рисунок 6.
Просмотреть в большом размереСкачать PPT
Аналоги нинтеданиба мишень KIT D816V гемопоэтические клетки. (A) Влияние 43 аналогов нинтеданиба на KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из ИПСК, определяли с помощью анализов CellTiter Glo (1 мкМ соединения) и отображали в виде процента необработанных клеток. Селективные соединения KIT D816V выделены цветом и имеют цветовую маркировку. Пунктирные линии указывают на ответ на лечение нинтеданибом. (B) Репрезентативные кривые реакции на лекарство для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из иПСК, обработанных BIBG1724TF, BIBE3315BS, BIBF149.
6ХХ или BIBE3316BS. Значения IC50 составляли от 96 до 203 нМ и от 849 до 917 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (C) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК KIT D816V, обработанных 1 мкМ BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS или BIBE3316BS, демонстрирует значительное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с обработанными контрольными клетками (n = 6–9). ). * P < 0,0001, тест Уэлча t . (D) Структуры и взаимодействия, основанные на отпечатке взаимодействия белок-лиганд, как описано на дополнительной фигуре 24B. Лис593, Glu605, Lys623, Glu671 и Cys673 устанавливают взаимодействие Н-связей с лигандами. Val603/Gly676 и Phe811 устанавливают взаимодействия H-аренов и ароматические взаимодействия, соответственно, с ароматическими фрагментами лигандов. Эти взаимодействия представлены кружками, потому что они распространяются на все атомы ароматических колец. Цвета однозначно идентифицируют каждый остаток, но не относятся к типу установленного взаимодействия.Рис. 6.
Посмотреть в большом форматеСкачать PPT
Аналоги нинтеданиба нацелены на гемопоэтические клетки KIT D816V. (A) Влияние 43 аналогов нинтеданиба на KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из ИПСК, определяли с помощью анализов CellTiter Glo (1 мкМ соединения) и отображали в виде процента необработанных клеток. Селективные соединения KIT D816V выделены цветом и имеют цветовую маркировку. Пунктирные линии указывают на ответ на лечение нинтеданибом. (B) Репрезентативные кривые реакции на лекарство для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из иПСК, обработанных BIBG1724TF, BIBE3315BS, BIBF149.6ХХ или BIBE3316BS. Значения IC50 составляли от 96 до 203 нМ и от 849 до 917 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (C) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК KIT D816V, обработанных 1 мкМ BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS или BIBE3316BS, демонстрирует значительное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с обработанными контрольными клетками (n = 6–9).
). * P < 0,0001, тест Уэлча t . (D) Структуры и взаимодействия, основанные на отпечатке взаимодействия белок-лиганд, как описано на дополнительной фигуре 24B. Лис593, Glu605, Lys623, Glu671 и Cys673 устанавливают взаимодействие Н-связей с лигандами. Val603/Gly676 и Phe811 устанавливают взаимодействия H-аренов и ароматические взаимодействия, соответственно, с ароматическими фрагментами лигандов. Эти взаимодействия представлены кружками, потому что они распространяются на все атомы ароматических колец. Цвета однозначно идентифицируют каждый остаток, но не относятся к типу установленного взаимодействия.Близкий модальный
Чтобы рационализировать на молекулярном уровне наблюдаемую активность производных нинтеданиба, мы смоделировали эти соединения в отношении KIT D816V и немутированных структур KIT, выполнив расчеты молекулярного докинга с индуцированным соответствием. Все производные нинтеданиба продемонстрировали самые высокие показатели скольжения для KIT D816V по сравнению с немутированным KIT, что свидетельствует о предпочтительном связывании с мутантным рецептором (дополнительная фигура 24A), что согласуется с нашими анализами на КОМПЛЕКТ Элементы Д816В.
При связывании с KIT D816V, BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS и BIBE3316BS располагали свою индолоподобную часть по направлению к А-петле в том же положении, что и индольная часть нинтеданиба, и они устанавливали аналогичные молекулярные контакты с теми же аминокислотными остатками в KIT. D186V (рис. 6D; дополнительная рис. 24B).Мы сообщаем, что после дифференцировки в гемопоэтические клетки-предшественники и тучные клетки KIT D816V иПСК пациентов с ASM и MCL повторяют фенотип SM. В этой модели скрининг лекарств идентифицировал нинтеданиб (Варгатеф, Офев) как мощный ИТК, нацеленный на неопластические клетки KIT D816V из ИПСК, специфичных для пациента, ЭСК с отредактированным геном и первичных образцов СМ.
ИПСК KIT D816V содержат параллельные мутации в таких генах, как TET2, NEF2, NRAS, SRSF2 и RUNX1, что отражает клональный состав образцов пациентов и гетерогенность СМ. Влияние этих мутаций наблюдалось во время дифференцировки in vitro, поскольку иПСК, несущие мутации KIT D816V и NFE2 , демонстрировали гемопоэз, ориентированный на эритроид.
Это соответствует зарегистрированному случаю KIT D816V SM-AHD с ассоциированным острым эритроидным лейкозом. 41 Мутации в TET2 , RUNX1 и SRSF2 у пациента 2 ИПСК привели к миелоидному гематопоэзу и выраженному апоптозу, что согласуется с опубликованными данными и миелодиспластическим синдромом, диагностированным у этого пациента. 42-46 Нинтеданиб представляет собой ингибитор киназы II типа, используемый для лечения немелкоклеточного рака легкого и идиопатического легочного фиброза. 37,38,47 Важно отметить, что нинтеданиб имеет управляемый профиль безопасности и переносимости при длительном применении у пациентов с легочным фиброзом. 48 Лечение нинтеданибом снижало жизнеспособность KIT-экспрессирующих гемопоэтических клеток, происходящих из ИПСК, и сильно снижало фосфорилирование KIT и STAT3, что согласуется с важной ролью белков STAT в нижестоящей передаче сигналов онкогенного KIT. 49 KIT Клетки, полученные из ИПСК D816V, также подвергались воздействию мидостаурина, авапритиниба (BLU-285) и рипретиниба (DCC-2618), что согласуется с предыдущими отчетами и клиническими испытаниями этих соединений.
17,19-21 Важно отметить, что нинтеданиб нарушал жизнеспособность клеток в образцах пациентов с СМ и блокировал фосфорилирование KIT D816V и передачу сигналов в первичных клетках пациентов.Исследования молекулярного докинга дополнительно подтвердили наши данные скрининга лекарств и показали, что нинтеданиб предпочтительно связывается с АТФ-связывающим карманом неактивного KIT D816V. Мы также идентифицировали дополнительные аналоги нинтеданиба с селективностью KIT D816V и картировали ключевые остатки в АТФ-связывающем кармане для взаимодействия с индольной частью этих соединений. Эта информация должна быть полезна для исследований направленного химического улучшения соединений на основе нинтеданиба путем адаптации специфических взаимодействий лиганд-рецептор для повышения аффинности и специфичности соединения.
Модель заболевания на основе иПСК также позволила нам оценить влияние KIT D816V на СК. KIT D816V коррелировал с более ускоренным и заметным развитием ТК во время гемопоэтической дифференцировки ИПСК, что согласуется с аномальной экспансией ТК и инфильтрацией, наблюдаемыми при СМ.
Морфологических различий между KIT D816V и контрольными ТК не наблюдалось, но KIT D816V ТК демонстрировали более высокую экспрессию и поверхностные уровни FCER1A, отражая ускоренное развитие и созревание ТК. Самое главное KIT D816V ТК, полученные из иПСК, также были эффективно нацелены на нинтеданиб.Далее мы использовали нашу панель SM iPSC для оценки потенциальных цитотоксических эффектов нинтеданиба на эндотелиальные клетки, поскольку это соединение изначально разрабатывалось как ингибитор VEGFR, ключевого рецептора для развития и функционирования эндотелиальных клеток. 37,38 Интересно, что нинтеданиб преимущественно нацелен на гемопоэтические клетки и ТК, полученные из ИПСК, а не на эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК. Эти результаты демонстрируют универсальность нашей модели заболевания на основе иПСК.
Одним из ограничений нашей модели болезни SM является постоянное присутствие KIT D816V и связанных с ним мутаций в иПСК и во всех клетках, полученных из них.
Таким образом, иПСК KIT D816V представляют собой моментальный снимок конкретного болезненного состояния, и их дифференцировка в гемопоэтические предшественники KIT D816V и ТК не отражает прогрессирования заболевания СМ. В этом контексте обсуждается вопрос о том, является ли мутация KIT D816V ранним или поздним событием в патогенезе СМ. Джавар и др. определили KIT D816V в качестве позднего события после мутаций TET2 , SRSF2 и ASXL1 . 23 Grootens et al., используя секвенирование одноклеточной РНК образцов пациентов с SM, идентифицировали KIT D816V в гемопоэтических стволовых клетках, а также в клетках-предшественниках, примированных по линии, и ТК. 50 Совсем недавно сообщалось, что лейкемические стволовые клетки для MCL находятся во фракции CD34 + /CD38 — злокачественного клона. 51 В свете этих сообщений наша модель заболевания SM на основе иПСК представляет собой мощный инструмент для систематической оценки влияния KIT D816V на различные стадии кроветворения.Таким образом, мы сообщаем о первой модели СМ на основе иПСК и предполагаем расширение нашей библиотеки ИПСК, полученных из СМ, за счет KIT D816V и связанных мутаций, чтобы обеспечить еще более полный набор моделей заболеваний СМ. Кроме того, нинтеданиб, идентифицированный в этом исследовании как эффективный ингибитор KIT D816V, уже используется в клинической практике; таким образом, его следует рассматривать как дополнительный и/или альтернативный вариант лечения распространенного СМ.
Для получения исходных данных и протокола исследования обращайтесь к Мартину Зенке ([email protected]).
Онлайн-версия этой статьи содержит дополнение данных.
Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты постраничных расходов. Поэтому и исключительно для того, чтобы указать на этот факт, эта статья настоящим помечена как «реклама» в соответствии с разделом 1734 18 USC.
Авторы благодарят Урсулу Голлан за цитогенетический анализ; Saskia Mitzka за анализ экспрессии генов; Междисциплинарный центр клинических исследований в Аахене, основной центр FACS и центр обслуживания трансгенных животных, медицинский факультет Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена; Катрин Гётц и Гюлькан Айдин за сортировку клеток; Томасу Иеронимусу за первоначальную работу с мышами NSG; и Эвелин Мирау за квалифицированную административную помощь.
Отделение высокопроизводительной биомедицины Института молекулярной медицины Финляндии, Хельсинки, Финляндия выражает признательность за помощь. Авторы также благодарят Майкла Хубера, Томаса Вильгельма и Маттиаса Бегеманна за обсуждения и советы, Мишеля Арока за клетки ROSA KIT D816V, Ананди Раджендирана и Стефана Дрешерса за предоставление образцов лейкоцитарной пленки здоровых доноров и Йорга Эшвайлера за предоставление образцов бедренной кости.Эта работа была частично поддержана средствами Немецкого исследовательского фонда (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG BR1782/5-1, Ch2509/1-1, KO2155/7-1, WA1706/12-1 и ZE432/10-1) в составе отдела клинических исследований CRU 344; Министерство культуры и науки немецкой земли Северный Рейн-Вестфалия; Европейский фонд регионального развития, Дюссельдорф, Германия; Берингер Ингельхайм, Ингельхайм, Германия; и ERS, Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена (MZ). М.А.С.Т. финансировалась постдокторской стипендией CAPES-Александра фон Гумбольдта (99999.
001703/2014-05) и пожертвование Ульриха Леманна. М.Г., Н.К. и М.З. финансировались IZKF Aachen. С.М.М. был поддержан финскими онкологическими организациями, Фондом Сигрид Юселиус и специальной государственной субсидией Финляндии на медицинские науки, исследования и обучение (Хельсинки, Финляндия). С.К. был поддержан грантом Немецкого фонда лейкемии Хосе Каррераса (DJCLS 16 R/2017). П.В. поддерживается Австрийским научным фондом — проект SFB F4704-B20.Добавлено: M.A.S.T. разработал и провел эксперименты и написал рукопись; М.Г. спроектировал и провел эксперименты; С.С. и Ф.К. проводили эксперименты по генерации иПСК и оказывали поддержку гемопоэтической дифференцировке; MAST, AEIH и NC провели эксперименты по трансплантации мышам NSG и проанализировали данные; К.В.Г. и Г.Э. предоставил образцы пациентов, провел скрининг соединений на первичных образцах и оказал поддержку в анализе данных; К.Ф. проведены эксперименты по вестерн-блоттингу; Р. Гуарески и Г.Р. проведены исследования молекулярного докинга; ЖОПА.
предоставил поддержку для иммуногистохимических анализов; О.М.Дж.Д. и С.М.М. провел высокопроизводительные эксперименты по скринингу наркотиков и проанализировал данные; ЯВЛЯЮСЬ. выполнен анализ NGS; H.M.S. выполнили цитогенетические анализы; Р. Гетцке и В.В. выполнил анализ метилирования ДНК; Т.Б. выполнен гистологический анализ; Дж.П. и А.К. предоставил образцы пациентов и поддержку для анализа данных NGS; М.Дж. и А.Р. предоставленные образцы пациентов; Ф.Х. и П.Е. предоставил аналоги нинтеданиба и поддержку для анализа данных; С.К. и Т.Х.Б. предоставил образцы пациентов и поддержку для анализа данных; П.В. предоставил образцы пациентов, поддержку анализа данных и написал рукопись; NC разработала эксперименты, провела вестерн-блоттинг и обеспечила поддержку анализа данных; М.З. разработал эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись; и все авторы одобрили окончательную версию рукописи для представления.Раскрытие информации о конфликте интересов: S.M.M. получил гонорары и финансирование исследований от Novartis, Pfizer и Bristol Myers Squibb.
В.В. является соучредителем Cygenia GmbH, которая предоставляет услуги по валидации ИПСК Epi-Pluri-Score. П.В. консультирует или является членом консультативных советов Novartis, Deciphera и Blueprint. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.Для переписки: Мартин Зенке, Институт биомедицинской инженерии, кафедра клеточной биологии, Медицинская школа Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена, Pauwelsstr 30, 52074 Ахен, Германия; электронная почта: [email protected].
1.
Valent
P
,
Horny
HP
,
Escribano
7 L 90etal.Диагностические критерии и классификация мастоцитоза: консенсусное предложение
.
Лейк Рез
.
2001
;
25
(
7
):
603
—
625
.
2.
Arber
DA
,
Orazi
A
,
Hasserjian
R
, и др.
Пересмотренная в 2016 г. классификация миелоидных новообразований и острого лейкоза Всемирной организации здравоохранения [опубликованное исправление появляется в Blood . 2016;128(3):462-463]
.
Кровь
.
2016
;
127
(
20
):
2391
—
2405
.
3.
Valent
P
,
Акин
C
,
Меткалф
DD
.Мастоцитоз: обновленная классификация ВОЗ 2016 г. и новые концепции лечения
.
Кровь
.
2017
;
129
(
11
):
1420
—
1427
.
4.
Valent
P
,
Akin
C
,
Hartmann
9 000032 K
Достижения в классификации и лечении мастоцитоза: текущее состояние и перспективы на будущее
.
Рак Res
.
2017
;
77
(
6
):
1261
—
1270
.
5.
Vaes
M
,
Benghiat
FS
,
Hermine
3
Варианты таргетного лечения мастоцитоза
.
Front Med (Лозанна)
.
2017
;
4
:
110
.
6.
Устун
С
,
Arock
M
,
Kluin-Nelemans
HC
, и др.
Распространенный системный мастоцитоз: от молекулярно-генетического прогресса к клинической практике
.
Гематологические
.
2016
;
101
(
10
):
1133
—
1143
.
7.
Арок
М
,
Сотлар
К
,
Акын
С
и др.
Анализ мутаций KIT в новообразованиях тучных клеток: рекомендации Европейской сети компетенций по мастоцитозу
.
Лейкемия
.
2015
;
29
(
6
):
1223
—
1232
.
8.
Арок
М
,
Wedeh
G
,
Hoermann
G
и др.
Доклинические человеческие модели и новые терапевтические средства для прогрессирующего системного мастоцитоза
.
Гематологические
.
2018
;
103
(
11
):
1760
—
1771
.
9.
Сян
Z
,
Kreisel
F
,
Cain
J
,
Colson
A
,
Tomasson
MH
.
Неоплазия, вызываемая мутантным c-KIT, опосредована внутриклеточной, а не плазматической мембраной, передачей сигналов рецептора
.
Мол Селл Биол
.
2007
;
27
(
1
):
267
—
282
.
10.
Akin
C
,
Brockow
K
,
D’Ambrosio
C
, et al.
Влияние ингибитора тирозинкиназы STI571 на тучные клетки человека, несущие c-kit дикого типа или мутантные
.
Эксперт Гематол
.
2003
;
31
(
8
):
686
—
692
.
11.
Shah
NP
,
Lee
FY
,
Luo
R
,
Jiang
Y
,
Donker
M
,
Акын
С
.
Дазатиниб (BMS-354825) ингибирует KITD816V, резистентную к иматинибу активирующую мутацию, которая вызывает рост новообразований у большинства пациентов с системным мастоцитозом
.
Кровь
.
2006
;
108
(
1
):
286
—
291
.
12.
Gleixner
кВ
,
Mayerhofer
M
,
Aichberger
KJ
, et al.
PKC412 ингибирует in vitro рост неопластических тучных клеток человека, экспрессирующих вариант KIT с мутацией D816V: сравнение с AMN107, иматинибом и кладрибином (2CdA) и оценка совместных эффектов препаратов
.
Кровь
.
2006
;
107
(
2
):
752
—
759
.
13.
Dubreuil
P
,
Letard
S
,
Ciufolini
,
Ciufolini
,
Маситиниб (AB1010), сильнодействующий и селективный ингибитор тирозинкиназы, нацеленный на KIT
.
PLoS One
.
2009
;
4
(
9
):
e7258
.
14.
Lortholary
O
,
Chandesris
MO
,
Bulai Livedeanu
C
, et al.
Маситиниб для лечения тяжелосимптомного латентного системного мастоцитоза: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование 3 фазы
.
Ланцет
.
2017
;
389
(
10069
):
612
—
620
.
15.
Мороз
MJ
,
Ferrao
Pt
,
Hughes
TP
,
Ashman
LK
,
LK
,
LK
.
Юкстамембранный мутант V560GKit более чувствителен к иматинибу (STI571) по сравнению с c-kit дикого типа, тогда как мутантный домен киназы D816VKit устойчив
.
Мол Рак Тер
.
2002
;
1
(
12
):
1115
—
1124
.
16.
GOTLIB
J
,
Kluin-Nelemans
HC
,
George
TI
, et al.
Эффективность и безопасность мидостаурина при прогрессирующем системном мастоцитозе
.
N Английский J Med
.
2016
;
374
(
26
):
2530
—
2541
.
17 .
Ответ и прогрессирование на мидостаурин при далеко зашедшем системном мастоцитозе: KIT D816V и другие молекулярные маркеры
.
Кровь
.
2017
;
130
(
2
):
137
—
145
.
18.
Valent
P
,
Akin
C
,
Hartmann
3
3 K
Мидостаурин: волшебное средство, блокирующее рост и активацию тучных клеток
.
Энн Онкол
.
2017
;
28
(
10
):
2367
—
2376
.
19.
Эванс
ЕК
,
Гардино
АК
,
Ким
Прецизионная терапия против рака, вызванного мутациями KIT/PDGFRA
.
Sci Transl Med
.
2017
;
9
(
414
):
1
—
12
.
20 .
Клиническая проверка ингибирования KIT при далеко зашедшем системном мастоцитозе
.
Curr Hematol Malig Rep
.
2018
;
13
(
5
):
407
—
416
.
21.
Schneeweiss
M
,
Peter
B
,
Bibi
S.Ингибитор переключения KIT и PDGFRA DCC-2618 блокирует рост и выживание множественных типов неопластических клеток при прогрессирующем мастоцитозе
.
Гематологические
.
2018
;
103
(
5
):
799
—
809
.
22.
Schwaab
J
,
Schnittger
S
,
Сотлар
9000Комплексное мутационное профилирование при далеко зашедшем системном мастоцитозе
.
Кровь
.
2013
;
122
(
14
):
2460
—
2466
.
23.
Jawhar
M
,
Schwaab
J
,
Schnittger
Молекулярное профилирование миелоидных клеток-предшественников при запущенном системном мастоцитозе с множественными мутациями идентифицирует KIT D816V как отдельное и позднее событие
.
Лейкемия
.
2015
;
29
(
5
):
1115
—
1122
.
24.
Jawhar
M
,
Schwaab
J
,
Schnittger
Дополнительные мутации в SRSF2, ASXL1 и/или RUNX1 определяют группу высокого риска пациентов с запущенным системным мастоцитозом KIT D816V(+)
.
Лейкемия
.
2016
;
30
(
1
):
136
—
143
.
25.
Котини
АГ
,
Чанг
C-J
,
Чоу
Стадийно-специфические плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные человеком, картируют прогрессирование миелоидной трансформации в трансплантируемый лейкоз
.
Стволовая клетка
.
2017
;
20
(
3
):
315
—
328.e7
.
26.
Роу
RG
,
Дейли
GQ
.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в моделировании заболеваний и разработке лекарств
.
Nat Rev Genet
.
2019
;
20
(
7
):
377
—
388
.
27.
Meents
JE
,
Bressan
E
,
Sontag
S et al.Роль Nav1.7 в ноцицепторах человека: выводы из индуцированных человеком плюрипотентных сенсорных нейронов, полученных из стволовых клеток, у пациентов с эритромелалгией
.
Боль
.
2019
;
160
(
6
):
1327
—
1341
.
28.
Хотта
А
,
Яманака
S
.
От геномики к генной терапии: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки встречаются с редактированием генома
.
Annu Rev Genet
.
2015
;
49
(
1
):
47
—
70
.
29.
Sontag
S
,
Förster
M
,
Qin
Jal.
Моделирование кроветворения человека с дефицитом IRF8 и развития дендритных клеток с помощью сконструированных иПС-клеток
.
Стволовые клетки
.
2017
;
35
(
4
):
898
—
908
.
30.
Lenz
M
,
Goetzke
R
,
Schenk
al.Эпигенетический биомаркер для поддержки классификации клеток на плюрипотентные и неплюрипотентные
.
Научный представитель
.
2015
;
5
(
1
):
8973
.
31.
Коварова
М
,
Коллер
Б
.
Дифференциация тучных клеток из эмбриональных стволовых клеток
.
Карр Проток Иммунол
.
2012
;
Глава 22
(
Блок 22F
):
10.1
—
16
.
32.
Kovarova
M
,
Latour
AM
,
Chason
KD
,
Tilley
SL
,
Koller
BH
.
Эмбриональные стволовые клетки человека: источник тучных клеток для изучения аллергических и воспалительных заболеваний
.
Кровь
.
2010
;
115
(
18
):
3695
—
3703
.
33.
Mayerhofer
M
,
Gleixner
KV
,
Hoelbl
A
, et al.
Уникальные эффекты KIT D816V в клетках BaF3: индукция кластерообразования, синтеза гистамина и ранней дифференцировки антигенов тучных клеток
.
Дж Иммунол
.
2008
;
180
(
8
):
5466
—
5476
.
34.
Athuluri-Divakar
SK
,
Vasquez-Del Carpio
R
,
Датта
K
, et.
Небольшая молекула RAS-миметика разрушает ассоциацию RAS с эффекторными белками, блокируя передачу сигналов
.
Сотовый
.
2016
;
165
(
3
):
643
—
655
.
35.
Бай
Y
,
Бандара
G
,
Чинг Чан
9 02003E
Воздействие на карман управления активирующим переключателем KIT: новый механизм ингибирования пролиферации неопластических тучных клеток и активации тучных клеток
.
Лейкемия
.
2013
;
27
(
2
):
278
—
285
.
36.
Салех
R
,
Ведех
G
,
Herrmann
Het.Новая линия тучных клеток человека, экспрессирующая функциональный рецептор IgE, преобразуется в туморогенный рост с помощью трансфекции KIT D816V
.
Кровь
.
2014
;
124
(
1
):
111
—
120
.
37.
Hilberg
F
,
Roth
GJ
,
Krssak
BIBF 1120: тройной ингибитор ангиокиназы с устойчивой блокадой рецепторов и хорошей противоопухолевой эффективностью
.
Рак Res
.
2008
;
68
(
12
):
4774
—
4782
.
38.
Roth
GJ
,
Binder
R
,
Colbatzky
,Нинтеданиб: от открытия до клиники
.
J Med Chem
.
2015
;
58
(
3
):
1053
—
1063
.
39.
Wimazal
F
,
Jordan
J-H
,
Sperr
,
R
Повышение ангиогенеза в костном мозге у пациентов с системным мастоцитозом
.
Ам Дж. Патол
.
2002
;
160
(
5
):
1639
—
1645
.
40.
Гардино
АК
,
Эванс
ЕК
,
Ким
,Точное нацеливание на киназы
.
Mol Cell Oncol
.
2018
;
5
(
3
):
e1435183
.
41.
McClintock-Treep
SA
,
Horny
HP
,
Sotlar
K
,
Foucar
MK
,
Reichard
KK
.
KIT(D816V+) системный мастоцитоз, связанный с KIT(D816V+) острым эритроидным лейкозом: первый клинический случай с молекулярными доказательствами того же происхождения клеток-предшественников
.
Дж. Клин Патол
.
2009
;
62
(
12
):
1147
—
1149
.
42.
Jutzi
JS
,
Bogeska
R
,
Nikoloski
G
, et al.
Пациенты с МПН имеют повторяющиеся укороченные мутации в транскрипционном факторе NF-E2
.
J Exp Med
.
2013
;
210
(
5
):
1003
—
1019
.
43.
Пелуси
N
,
Косанке
М
,
Ридт
Влияние микроокружения селезенки на трансформацию заболевания на мышиной модели KIT D816V -зависимое миелопролиферативное новообразование
.
Научный представитель
.
2017
;
7
(
1
):
41427
.
44.
Bapat
A
,
Keita
N
,
Martelly
3
W.Мутации фактора сплайсинга SRSF2 при миелоидном заболевании вызывают остановку G2-M и нарушение дифференцировки человеческих гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников
.
Стволовые клетки
.
2018
;
36
(
11
):
1663
—
1675
.
45.
Накадзима
H
,
Кунимото
H
.
TET2 как основной эпигенетический регулятор нормального и злокачественного кроветворения
.
Онкология
.
2014
;
105
(
9
):
1093
—
1099
.
46.
Sakurai
M
,
Kunimoto
H
,
Watanabe
N
, et al.
Нарушение гемопоэтической дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с мутациями RUNX1, полученных от пациентов с НФЛ/ОМЛ
.
Лейкемия
.
2014
;
28
(
12
):
2344
—
2354
.
47.
Wollin
L
,
Wex
E
,
Pautsch
3 A
al.Механизм действия нинтеданиба при лечении идиопатического легочного фиброза
.
Евр Респир J
.
2015
;
45
(
5
):
1434
—
1445
.
48.
Крестани
B
,
Хаггинс
JT
,
Кей
3
Долгосрочная безопасность и переносимость нинтеданиба у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом: результаты открытого расширенного исследования INPULSIS-ON
.
Ланцет Респир Мед
.
2019
;
7
(
1
):
60
—
68
.
49.
Chaix
A
,
Lopez
S
,
Voisset
E
,
Gros
L
,
Dubreuil
P
,
Де Сепульведа
Р
.
Механизмы активации белка STAT онкогенными мутантами KIT в опухолевых тучных клетках
.
J Biol Chem
.
2011
;
286
(
8
):
5956
—
5966
.
50.
Грутенс
J
,
Унгерштедт
JS
,
Экофф
М
и др.
Анализ отдельных клеток выявляет мутацию KIT D816V в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках при системном мастоцитозе
.
ЭБиоМедицина
.
2019
;
43
:
150
—
158
.
51.
Эйзенворт
Г
,
Садовник
I
,
Шваб
J
и др.
Идентификация стволовых клеток, инициирующих лейкемию, при тучноклеточном лейкозе человека
.
Лейкемия
.
2019
;
33
(
11
):
2673
—
2684
.
Примечания автора
*
N.C. и M.Z. являются совместными старшими авторами.
Дополнительные данные
Дополнительный файл 1- pdf файл
Войдите через свое учреждение
Abstract 2372: Xkr5 отрицательно регулирует передачу сигналов KIT/D816V | Исследование рака
Пропустить пункт назначения Nav
Постерные презентации — Предлагаемые тезисы | 01 июля 2017 г.
Цзяньминь Сунь;
Тин Тингхольм;
Тяньфэн Ли;
Джулхаш У. Кази;
Хуэй Чжао;
Ларс Рённстранд
Информация об авторе и статье
Номер в Интернете: 1538-7445
Номер для печати: 0008-5472
© Американская ассоциация исследований рака, 2017 г.
2017
Американская ассоциация исследований рака.
Cancer Res (2017) 77 (13_Supplement): 2372.
https://doi.org/10.1158/1538-7445.AM2017-2372
- Разделенный экран
- Просмотры
- Содержание артикула
- Рисунки и таблицы
- Видео
- Аудио
- Дополнительные данные
- Экспертная оценка
- Делиться
- MailTo
- Твиттер
- Инструменты
Получить разрешения
Иконка Цитировать Цитировать
- Поиск по сайту
- Значок версии статьи Версии
- Версия записи
1 июля 2017 г.
- Версия записи
1 июля 2017 г.
Цитирование
Цзяньминь Сун, Тайн Тингхольм, Тяньфэн Ли, Джулхаш У. Кази, Хуэй Чжао, Ларс Рённстранд; Abstract 2372: Xkr5 отрицательно регулирует передачу сигналов KIT/D816V. Рак Res 1 июля 2017 г.; 77 (13_Supplement): 2372. https://doi.org/10.1158/1538-7445.AM2017-2372
Скачать файл цитаты:
- Ris (Zotero)
- Менеджер ссылок
- EasyBib
- Подставки для книг
- Менделей
- Бумаги
- КонецПримечание
- РефВоркс
- Бибтекс
Расширенный поиск
D816V является наиболее часто встречающейся мутацией рецепторной тирозинкиназы III типа KIT при мастоцитозе и CBF-AML. Пытаясь идентифицировать специфические нижестоящие сигнальные пути KIT/D816V, мы обнаружили, что KIT/D816V, но не KIT дикого типа, может связываться с Xkr5, что ранее не изучалось.
Помимо ассоциации с KIT/D816V, Xkr5 фосфорилирован по Tyr 369., Tyr487 и Tyr 543 с помощью KIT/D816V, и фосфорилирование опосредовано только мутациями Asp 816 в KIT, но не другими мутациями KIT, которые происходят в гастроинтестинальных стромальных опухолях и меланоме. Более того, тирозиновое фосфорилирование Xkr5 не зависит от киназ семейства Src, которые играют решающую роль в активации KIT дикого типа. В тучных клетках, экспрессирующих KIT/D816V, фосфорилирование Xkr5 ингибирует KIT/D816V нижестоящие сигнальные молекулы Akt, Erk и p38. Как следствие, пролиферация клеток и образование колоний также ингибируются тирозиновым фосфорилированием Xkr5, что указывает на то, что Xkr5 является негативным регулятором передачи сигналов KIT/D816V.Формат цитирования: Jianmin Sun, Tine Thingholm, Tianfeng Li, Julhash U. Kazi, Hui Zhao, Lars Rönnstrand. Xkr5 негативно регулирует передачу сигналов KIT/D816V [аннотация]. В: Труды ежегодного собрания Американской ассоциации исследований рака, 2017 г .
; 2017 1-5 апреля; Вашингтон. Филадельфия (Пенсильвания): AACR; Cancer Res 2017;77(13 Suppl):Abstract nr 2372. doi:10.1158/1538-7445.AM2017-2372тестов — TMS — Общество по заболеваниям тучных клеток, Inc :TMS — Общество по заболеваниям тучных клеток, Inc
В первую очередь следует провести тщательный осмотр кожи на наличие характерных очагов мастоцитоза. При обнаружении поражений врач должен 5–6 раз сильно погладить их с помощью депрессора для языка, чтобы проверить, нет ли крапивницы (симптом Дарье). Тем не менее, приливы и системное низкое кровяное давление могут быть результатом попыток идентифицировать симптом Дарье у маленьких детей с кожной мастоцитомой или полиморфным вариантом пятнисто-папулезного кожного мастоцитоза с узловыми поражениями, поэтому у этих пациентов следует избегать этого теста. 1, 2 Симптом Дарье положителен почти у всех детей и большинства взрослых с поражением кожи при мастоцитозе. Международная согласованная рабочая группа специалистов по заболеваниям тучных клеток недавно предложила включить симптом Дарье как часть основного критерия диагностики поражения кожи у пациентов с мастоцитозом.
2 Очищенные участки кожи можно поглаживать тем же способом, который описан выше, для проверки на наличие дерматографизма или надписей на коже, при которых пораженный участок воспаляется. Симптом Дарье и дерматографизм являются характерными кожными симптомами при заболеваниях тучных клеток.Информация о тестах для детей с заболеваниями тучных клеток также доступна на этом веб-сайте. Нажмите здесь для получения дополнительной информации .
Тесты на активацию тучных клеток и синдром активации тучных клеток (MCAS)
Повышение уровня триптазы в сыворотке выше исходного уровня и в течение узкого (обычно принимаемого от одного до двух часов) интервала времени после симптоматического эпизода , предлагается в качестве предпочтительного метода для получения доказательств вовлечения тучных клеток. 3-5 В международной согласованной статье приводится метод расчета необходимого минимального повышения уровня триптазы в сыворотке: 5
После реакции уровень триптазы в сыворотке, который как минимум на 20 % превышает базовый уровень триптазы в сыворотке, плюс 2 нг/мл будут соответствовать второму критерию события активации тучных клеток.
Например, если у пациента исходный (исходный уровень, по крайней мере, через 24 часа после реакции) уровень триптазы в сыворотке крови составляет 8 нг/мл, повышение на 20% плюс 2 нг/мл составит 11,6 нг/мл. Чтобы соответствовать вышеприведенному критерию триптазы в сыворотке, пациенту потребуется постреакционный уровень триптазы в сыворотке 9.0035 выше 11,6 нг/мл. Расчет будет проводиться следующим образом:(8 нг/мл x 1,2) + 2 нг/мл = 11,6 нг/мл
(базовый уровень плюс 20%) + дополнительные 2 нг/мл = сыворотка уровень триптазы после реакции, который должен быть превышен, чтобы соответствовать повышению уровня триптазы в сыворотке, что считается событием активации тучных клеток чтобы соответствовать требуемому увеличению по совместному критерию, могут быть достаточными другие медиаторные тесты. Повышение содержания в моче n-метилгистамина, простагландина-D 2 или его метаболит, 11β-простагландин-F 2α (24-часовой анализ мочи на любой из трех), считается альтернативой кокритерию, связанному с необходимостью повышения уровня медиатора тучных клеток во время событие системной активации тучных клеток.
5, 6 В настоящее время некоторые практикующие врачи используют другие тесты для диагностики активации тучных клеток. Хотя мы четко осознаем, что наши ограничения в том, что существует много медиаторов тучных клеток, и все же у нас есть коммерческие тесты менее чем для пяти из них здесь, в США, Общество мастоцитоза, Inc. (TMS) не может одобрить использование других медиаторные маркеры в качестве диагностических инструментов до тех пор, пока они не будут адекватно оценены и не будут доказаны как действительные для болезней тучных клеток в надежных научных исследованиях. TMS решительно поддерживает и в настоящее время финансирует исследования по выявлению лучше маркеров для активации тучных клеток.TMS признает, однако, что уловить подъем медиатора не всегда просто и зависит от многих факторов, как внутренних, так и внешних. Мы видели отрицательные результаты анализов 24-часовых образцов мочи просто потому, что лаборант своевременно не охладил образец (когда тест был повторен и проведен должным образом, результат был положительным).
Поэтому мы поддерживаем использование клинического диагноза и советуем продолжать лечение пациента при соблюдении следующих критериев: 7 - Исчерпывающее обследование исключило другие заболевания с похожими симптомами и проявлениями
- У пациента проявляются постоянные симптомы активации тучных клеток в 2 или более системах органов в течение одного и того же периода времени, таких как кожа, желудочно-кишечный тракт, центральная нервная система и т. д.
- Пациент отвечает на антимедиаторную терапию
- Пациент находится под регулярным наблюдением, с периодическим тестированием на повышение уровня медиаторов, специалистом по тучным клеткам или другим специалистом и/или совместно с признанным местным аллергологом или другим врачом
- Пациент постоянно оценивается на наличие других болезненных процессов, чтобы учитывать любые новые изменения в состоянии пациента
Рутинное и последующее тестирование на MCAS
У пациентов с повышением уровня медиаторов следует периодически повторять тестирование медиаторов.
Кроме того, полный анализ крови (CBC) с дифференциалом, биохимический анализ крови, уровни иммуноглобулина, функциональные тесты печени, сканирование DEXA для определения плотности кости и другие тесты могут быть выполнены как часть обычного обследования, в зависимости от возраста пациента, представляющего симптомы, сопутствующие состояния и медикаментозный профиль. 8 Тесты на клональные заболевания тучных клеток, такие как системный мастоцитоз или моноклональный MCAS
Биопсия костного мозга Аспирированный костный мозг следует направить на проточную цитометрию для оценки наличия тучных клеток с аберрантным фенотипом (т. е. коэкспрессией CD25). Тестирование на мутацию KIT (см. ниже) также можно проводить на аспирате костного мозга. Иммуногистохимия на KIT , триптазу тучных клеток и CD25 следует проводить на срезах биопсии. 1, 9-12
Комплект Тестирование на мутации 13
, чтобы понять, почему Комплект Тестные испытания, необходимо сначала понять различие между Клоналом и неверно-кольцами.
. Клональный означает, что в ДНК тучных клеток человека имеется дефект, в результате чего тучные клетки имеют аномальные характеристики. Хотя наиболее распространенным дефектом, наблюдаемым при болезни тучных клеток, является KIT D816V, он не единственный, который может привести к патологическому процессу. Многочисленные другие мутации в KIT были связаны с мастоцитозом, и в отсутствие мутации KIT D816V для их идентификации можно провести другие тесты, включая секвенирование KIT . Если у вас нет изменений (нет мутации, такой как мутация KIT), идентифицированной в вашей ДНК тучных клеток, но вы испытываете активацию тучных клеток, то у вас может быть неклональное заболевание, такое как идиопатический синдром активации тучных клеток.В течение многих лет был доступен тест на основе ПЦР, опосредованной пептидными нуклеиновыми кислотами, который может идентифицировать мутацию KIT D816V в периферической крови, и он смог обнаружить мутацию у 44% протестированных пациентов с системным мастоцитозом.
14 Более новый тест, аллель-специфический тест олигонуклеотидной количественной ПЦР, оказался гораздо более чувствительным и надежным. Например, у пациентов с индолентным системным мастоцитозом с поражением кожи был обнаружен KIT 9.0036 Мутация D816V в 92% случаев с использованием более нового аллель-специфического анализа крови КПЦР. 14 Хотя был разработан более чувствительный тест на мутацию KIT D816V (аллель-специфическая количественная ПЦР с чувствительностью 0,01%), который можно проводить в образцах периферической крови, он еще не широко доступен здесь, в Соединенные штаты. Тем не менее, клиника Майо в Рочестере, штат Миннесота, может провести ПЦР-тест на аллель-специфические олигонуклеотиды (ASO-PCR) для KIT D816V, и этот тест может быть доступен в нескольких других лабораториях в США. В настоящее время в США результат часто сообщается как положительный или отрицательный, хотя в условиях исследования результаты могут быть представлены более подробно как «частота аллелей», которая, по сути, является мерой степени присутствия мутации.
по сравнению с KIT без этой мутации (частота аллелей может помочь в определении прогноза заболевания). Важно отметить, что получение отрицательного результата теста не исключает заболевание тучных клеток. 13, 15 Если взрослый с системным мастоцитозом не дает положительного результата теста на мутацию KIT D816V с помощью чувствительных методов тестирования, можно рассмотреть секвенирование KIT .Знание статуса мутации KIT может быть очень важным при рассмотрении вариантов лечения, таких как новые лекарства и химиотерапия. Разработка аллель-специфического теста количественной ПЦР сделает тестирование KIT периферической крови более доступным в ближайшем будущем. Более подробная информация об использовании тестирования на мутацию KIT при заболеваниях тучных клеток (включая потенциальное использование в прогнозе и доступна в опубликованных рекомендациях Европейской сети компетенций по мастоцитозу (ECNM)).
Набор для тестирования ARUP уже доступен (2020 г.
) ARUP предлагает количественный цифровой капельный (dd) ПЦР-тест. Рекомендованные NCCN и ECNM сверхчувствительные методы, такие как ddPCR, являются предпочтительными методами первой линии для мутационного анализа KIT для диагностики заболеваний тучных клеток. Это связано с тем, что они очень чувствительны, специфичны и могут выполняться на периферической крови, гарантируя, что инвазивная биопсия костного мозга выполняется только у пациентов, которые в ней нуждаются.
Эта количественная ddPCR для анализа мутации KIT D816V теперь доступна через ARUP в Солт-Лейк-Сити, штат Юта. Тестирование может быть выполнено на периферической крови или костном мозге и сообщается как частота аллелей.
- Узнайте больше об этом тесте и тестировании на заболевания тучных клеток в ARUP Consult, руководстве для врачей по выбору и интерпретации тестов: https://arupconsult.com/algorithm/mast-cell-disorders-testing-algorithm. Весь контент проверяется патологоанатомами и медицинскими директорами ARUP, которые являются преподавателями Медицинской школы Университета Юты, и включает в себя полные медицинские справки.
- См. запись теста в каталоге лабораторных тестов. https://ltd.aruplab.com/Tests/Pub/3002956
- Прочтите пресс-релиз ARUP о запуске этого нового теста. https://www.aruplab.com/news/11-16-2020/new-mast-cell-disorder-screening
Плановое и последующее обследование на системный мастоцитоз (СМ) и тлеющий СМ
Обследования должны проводиться периодически и включать: 13
- Дерматологический осмотр0084
- Тщательная пальпация печени, селезенки и лимфатических узлов
- Полное нейропсихологическое обследование
- СВС с дифференциалом
- Триптаза сыворотки и суточная моча на N-метилгистамин, простагландин D2 (PGD2), 11β-простагландин F 2α
- Функциональные пробы печени, сывороточный альбумин, сывороточный ЛДГ и сывороточная щелочная фосфатаза 16
- Биохимический анализ крови
- Суммарные иммуноглобулины или общий IgE, если это показано предыдущим тестированием
- сканирования DEXA для определения плотности кости; сканирование костей ядерной медицины, если указано
- Биопсия костного мозга с проточной цитометрией и цитологией по показаниям
- Аллель-специфическая кПЦР для KIT Мутация D816V в периферической крови/костном мозге, если она еще не проводилась; KIT секвенирование, если указано 13
- КТ/УЗИ, если указано
- Другие тесты могут быть выполнены по показаниям при подозрении на гематологическое заболевание или для оценки симптомов у конкретного пациента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительную информацию об использовании вышеуказанных тестов и экзаменов можно найти в Таблице 3 рекомендаций ECNM. 13 Компания Mastocytosis Society, Inc. удалила сывороточный β2-микроглобулин из приведенного выше списка после того, как опрос некоторых наших медицинских специалистов показал, что этот тест обычно не назначается для оценки мастоцитоза в США.
Диагностическое обследование для поздних вариантов системного мастоцитоза или ассоциированных гематологических заболеваний 1, 13, 17, 18
При подозрении на прогрессирующее заболевание или связанное с ним гематологическое расстройство дальнейшее обследование пациента помимо биопсии костного мозга и аспирата с проточной цитометрией может включать:
- Комплексный анализ крови
- Рентгенологическое исследование или компьютерная томография органов грудной клетки для выявления признаков значительного увеличения лимфатических узлов (более 2 см в диаметре)
- Рентгенологическое исследование, сканирование костной системы ядерной медициной или сканирование плотности костной ткани для выявления остеопороза, остеосклероза или областей, где кальций полностью утрачен из кости
- КТ или УЗИ органов брюшной полости с целью выявления увеличенной печени или селезенки, 16 увеличенных лимфатических узлов или скопления жидкости
- Эндоскопия/колоноскопия и биопсия желудочно-кишечного тракта для выявления признаков инфильтрации тучными клетками, язв или участков кровотечения. Инфильтрацию тучных клеток можно определить по скоплениям из 15 и более аномальных тучных клеток или пластов тучных клеток. Аномальные тучные клетки можно идентифицировать по наличию CD25 на этих клетках. 19
- Другие тесты могут включать секвенирование следующего поколения и панели миелоидных генов для выявления дополнительных генетических повреждений.
Ссылки
- Valent P, Akin C, Escribano L, Fodinger M, Hartmann K, Brockow K, et al. Стандарты и стандартизация при мастоцитозе: согласованные заявления по диагностике, рекомендации по лечению и критерии ответа . Евро Джей Клин Инвест. 2007 г., июнь; 37 (6): 435-53. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17537151
- Хартманн К., Эскрибано Л., Граттан С., Броков К., Картер М.С., Альварез-Туос И. и др. Кожные проявления у пациентов с мастоцитозом: Консенсусный отчет Европейской сети компетентности по мастоцитозу; Американская академия аллергии, астмы и иммунологии; и Европейская академия аллергологии и клинической иммунологии . J Аллергия Клин Иммунол. 2016 Январь; 137(1):35-45. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26476479
- Шварц Л.Б., Сакаи К., Брэдфорд Т.Р., Рен С., Цвейман Б., Воробец А.С. и соавт. Альфа-форма триптазы человека является преобладающим типом, присутствующим в крови на исходном уровне у нормальных субъектов, и ее уровень повышен у лиц с системным мастоцитозом . Джей Клин Инвест. 1995 декабрь; 96 (6): 2702-10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8675637
- Шварц Л.Б., Ирани А.М. Триптаза сыворотки и лабораторная диагностика системного мастоцитоза . Hematol Oncol Clin North Am. 2000 июнь; 14 (3): 641-57. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/104
- Valent P, Akin C, Arock M, Brockow K, Butterfield JH, Carter MC, et al. Определения, критерии и глобальная классификация заболеваний тучных клеток с особой ссылкой на синдромы активации тучных клеток: консенсусное предложение . Int Arch Allergy Immunol. 2012;157(3):215-25. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22041891
- Гамильтон М.Дж., Хорник Д.Л., Акин С., Кастельс М.С., Гринбергер Н.Дж. Синдром активации тучных клеток: недавно выявленное заболевание с системными клиническими проявлениями . J Аллергия Клин Иммунол. 2011 июль;128(1):147-52 e2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21621255
- Cardet JC, Castells MC, Hamilton MJ. Иммунология и клинические проявления синдрома неклональной активации тучных клеток . Curr Allergy Asthma Rep. 2013 Feb;13(1):10-8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23212667
- Пикард М., Джавина-Бьянки П., Меццано В., Кастельс М. Расширение спектра нарушений активации тучных клеток: моноклональные и идиопатические синдромы активации тучных клеток . Клин Тер. 2013 май; 35(5):548-62. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23642289
- Альварес-Твосе И., Моргадо Дж. М., Санчес-Муньос Л., Гарсия-Монтеро А., Мольехо М., Орфао А. и др. Современное состояние биологии и диагностики клональных болезней тучных клеток у взрослых . Int J Lab Гематол. 2012 Октябрь; 34 (5): 445-60. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22551157
- Horny HP, Sotlar K, Valent P. Мастоцитоз: современное состояние . Патобиология. 2007;74(2):121-32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17587883
- Horny HP, Valent P. Диагностика мастоцитоза: общие гистопатологические аспекты, морфологические критерии и результаты иммуногистохимии . Лейк Рез. 2001 г., июль; 25 (7): 543-51. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11377679
- Escribano L, Garcia Montero AC, Nunez R, Orfao A. Проточный цитометрический анализ нормальных и неопластических тучных клеток: роль в диагностике и последующем наблюдении за заболеванием тучных клеток . Иммунол Аллергия Клин Норт Ам. 2006 авг; 26 (3): 535-47. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16
2 - Арок М., Сотлар К., Акин С., Бросби-Олсен С., Хорманн Г., Эскрибано Л. и др. Анализ мутаций KIT в новообразованиях тучных клеток: рекомендации Европейской сети компетенций по мастоцитозу .
Лейкемия. 2015 июнь;29(6):1223-32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25650093- Хара-Асеведо М., Теодосио С., Санчес-Муньос Л., Альварес-Твоуз И., Маядо А., Калдас С. и др. Обнаружение мутации KIT D816V в периферической крови при системном мастоцитозе: диагностическое значение . Мод Патол. 2015 авг; 28 (8): 1138-49. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26067933
- Kristensen T, Vestergaard H, Bindslev-Jensen C, Moller MB, Broesby-Olsen S, Центр мастоцитоза OUH. Анализ крови Sensitive KIT на мутацию D816V в качестве диагностического теста при мастоцитозе . Am J Гематол. 2014 май; 89 (5): 493-8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24443360
- Джаухар М., Швааб Дж., Хаусманн Д., Клеменс Дж., Науманн Н., Хенцлер Т. и другие. Спленомегалия, повышенный уровень щелочной фосфатазы и мутации в панели генов SRSF2/ASXL1/RUNX1 являются сильными неблагоприятными прогностическими маркерами у пациентов с системным мастоцитозом .
- Арок М., Сотлар К., Акин С., Бросби-Олсен С., Хорманн Г., Эскрибано Л. и др. Анализ мутаций KIT в новообразованиях тучных клеток: рекомендации Европейской сети компетенций по мастоцитозу .
KIT D816V был обнаружен у 92/105 пациентов (88%). Между подгруппами заболеваний наблюдались значительные различия в среднем аллельном бремени; кожный мастоцитоз (0,042%), индолентный СМ (0,285%), вялотекущий СМ (5,991%), агрессивный СМ (9,346%) и СМ с ассоциированным гематологическим заболеванием не тучноклеточного происхождения (3,761%) ( P <0,001). 9Нагрузка 0035 KIT D816V также коррелировала с уровнем триптазы в сыворотке ( R =0,5, P <0,005), но не с инфильтрацией тучных клеток в костном мозге или медиаторными симптомами. Более того, бремя аллелей имело прогностическое значение в отношении выживаемости ( P <0,01). У пациентов, ответивших на циторедуктивную терапию, наблюдалось достоверное снижение KIT D816V ( P <0,03). В заключение, бремя KIT D816V коррелирует с вариантом мастоцитоза, предсказывает выживаемость и является ценным параметром наблюдения при СМ.
Кристенсен и др. сообщили о высокочувствительной количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) для KIT D816V (5). Недавно была подтверждена важность измерения аллельной нагрузки методами количественной ПЦР с использованием различных методов (6). Кроме того, различия в 9Наблюдалась аллельная нагрузка 0035 KIT D816V среди индолентных и агрессивных форм (6, 7). Целью настоящего исследования было оценить влияние нагрузки аллеля KIT D816V на клиническое течение и выживаемость при СМ.
0035 P <0,001, тест Крускала-Уоллиса). (B) График Каплана-Мейера для общей выживаемости пациентов с мастоцитозом с бременем KIT D816V <2% и пациентов с бременем KIT D816V ≥ 2% на момент постановки диагноза. Разница в вероятности выживания была достоверной ( P =0,001).
В группе с мутантным аллельным бременем <2% ( N =66) медиана выживаемости не была достигнута, тогда как у пациентов с KIT D816V аллельным бременем ≥2% ( N =26) медиана выживаемости составила 6,3. лет (критерий логарифмического ранга; P =0,001; ).
Другим объяснением может быть то, что другие онкогенные мутации участвуют в пролиферации и/или выживании ТК в костном мозге (15).
Используя пороговый уровень 2% мутантной аллельной нагрузки в нашем исследовании, можно было разделить две прогностически разные группы пациентов с явно разным временем выживания. Однако значение конкретного порогового значения необходимо подтвердить в будущих проспективных испытаниях.
H., G.E.D., G.G., G.M., and C.M. провели молекулярные тесты и проанализировали данные. Г.Х., К.В.Г., Ф.В., Э.Х., П.В. и В.Р.С. получены и проанализированы клинические данные. Г.Х. и П.В. и W.R.S. разработал исследование и написал статью. Все авторы пересмотрели и одобрили рукопись.
Выявление точечной мутации в каталитическом домене протоонкогена c-kit в мононуклеарных клетках периферической крови больных мастоцитозом с сопутствующим гематологическим заболеванием. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(23):10560–10564. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Улучшенное обнаружение мутации KIT D816V у пациентов с системным мастоцитозом с использованием количественного и высокочувствительного количественного ПЦР в реальном времени. J Мол Диагн. 2011;13(2):180–188. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Кристенсен Т., Бросби-Олсен С., Вестергаард Х., Биндслев-Йенсен С., Моллер М.Б. KIT D816V Мутационно-положительные клеточные фракции в биоптатах пораженной кожи взрослых с системным мастоцитозом. Дерматология. 2013;226(3):233–237. [PubMed] [Google Scholar]
Int Arch Allergy Immunol. 2002;128(2):136–141. [PubMed] [Академия Google]
адрес:
(изменить)
2012 июль; 89 (1): 42-6.
Евр Дж Гематол.
2012 июль
1111/ж.1600-0609.2012.01789.х
PMID: 18165278
Бесплатная статья ЧВК.
Недооценка состояния больных с идиопатической анафилаксией.
_uz94_ux2s.png)
Мусйоки,
Брюммендорф,
С. Толедо, Малрун Гац, Стефани Зонтаг, Каролина В. Гляйкснер, Грегор Эйзенворт, Кристина Фельдберг, Ахмед Э.И. Хамуда, Фредерик Клюге, Риккардо Гуарески, Джулия Россетти, Антонио С. Сечи, Олли М.Дж. Дуфва, Сату М. Мусйоки, Анджела Маурер, Хердит М. Шулер, Роман Гетцке, Тилль Брауншвейг, Анне Кайзер, Йенс Пансе, Мохамад Джавар, Андреас Райтер, Франк Хилберг, Петер Эттмайер, Вольфганг Вагнер, Штеффен Кошмидер, Тим Х. Брюммендорф, Петер Валент, Николя Шатен, Мартин Зенке ; Нинтеданиб воздействует на опухолевые клетки KIT D816V, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток системного мастоцитоза. Кровь 2021; 137 (15): 2070–2084. doi: https://doi.org/10.1182/blood.201
Таким образом, KIT D816V представляет собой основную терапевтическую мишень для СМ. Здесь мы создали панель специфичных для пациента KIT D816V, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с агрессивным СМ и лейкемией тучных клеток, чтобы разработать модель заболевания СМ для конкретного пациента для механистических исследований и исследований по открытию лекарств. KIT ИПСК D816V дифференцировались в неопластические гемопоэтические клетки-предшественники и ТК со специфическими для пациента фенотипическими признаками, тем самым отражая гетерогенность заболевания. CRISPR/Cas9n-инженерные KIT D816V эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) при дифференцировке в гемопоэтические клетки повторяли фенотип, наблюдаемый для гемопоэза иПСК KIT D816V. KIT D816V вызывает конститутивную активацию рецептора тирозинкиназы KIT, и мы использовали наши иПСК и ЭСК для исследования новых ингибиторов тирозинкиназы, нацеленных на KIT D816V.
Наше исследование выявило нинтеданиб, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ингибитор ангиокиназы, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов, рецептор фактора роста тромбоцитов и рецептор фактора роста фибробластов, в качестве нового ингибитора KIT D816V. Нинтеданиб избирательно снижал жизнеспособность полученных из иПСК KIT Кроветворные клетки-предшественники D816V и ТК в наномолярном диапазоне. Нинтеданиб также был активен в первичных образцах пациентов с KIT D816V SM. Исследования молекулярной стыковки показывают, что нинтеданиб связывается с карманом связывания аденозинтрифосфата неактивного KIT D816V. Наши результаты позволяют предположить, что нинтеданиб является новым лекарственным средством-кандидатом для направленной на KIT D816V терапии распространенного СМ.
1,2 Степень инфильтрации СК, количество пораженных тканей/органов и мутационная нагрузка определяют гетерогенную патологию и отдельные категории заболеваний при системном мастоцитозе (СМ): индолентный СМ, тлеющий СМ, агрессивный СМ (АСМ), МС лейкоз (MCL) и СМ с ассоциированным гематологическим заболеванием (SM-AHD). 1,3,4 ASM, MCL и SM-AHD представляют собой запущенные формы SM, которые характеризуются выраженной инфильтрацией MC, нарушающей функцию органа, быстрым прогрессированием заболевания и неблагоприятным прогнозом. Для этих пациентов доступно лишь несколько терапевтических вариантов. 4-6 
10-14 Однако KIT D816V придает устойчивость к некоторым из этих TKI, включая иматиниб. 11,15 Другие ИТК, такие как мидостаурин, подавляют рост неопластических ТК KIT D816V, а недавно мидостаурин был одобрен для лечения распространенного СМ. 16-18 Совсем недавно были идентифицированы два дополнительных соединения, нацеленных на KIT D816V, рипретиниб (DCC-2618) и авапритиниб (BLU-285), которые проходят клинические испытания при распространенном СМ. 19-21 Однако эффективность и переносимость этих ИТК могут варьироваться, поскольку СМ является гетерогенной патологией; поэтому необходимы дальнейшие усилия по созданию доклинических моделей и выявлению новых ИТК.
2 и РОСА Д816В , экспресс КОМПЛЕКТ Д816В. 8 Кроме того, сконструированные или установленные клеточные линии KIT D816V не полностью рекапитулируют KIT D816V SM из-за дополнительных мутаций в таких генах, как ASXL1 , CBL , RUNX1 , SRSF2 и TET2 обычно обнаруживаются у пациентов с KIT D816V ASM и MCL. 8,22-24 Эти одновременные мутации способствуют гетерогенности и прогрессированию заболевания. Следовательно, для изучения патологии СМ и скрининга соединений, нацеленных на клетки СМ, необходимы более аутентичные модели заболеваний, которые более точно повторяют генетические и функциональные особенности СМ.
25-27 Кроме того, иПСК и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) легко подвергаются геномной инженерии с помощью CRISPR/Cas9 для точного введения или восстановления онкогенных мутаций. 26,28,29 
29 Мутация KIT D816V была обнаружена с помощью аллель-специфической ПЦР (дополнительная таблица 2).
29 
Жизнеспособность клеток определяли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, планшетного ридера SpectraMAX i3 и программного обеспечения SoftMax Pro.
(A) KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью аллель-специфичной ПЦР (верхняя панель). KIT Мутация D816V в ИПСК с помощью секвенирования по Сэнгеру (нижние панели). Контроль 1-3, иПСК без мутации; D816V 1-3, иПСК с мутацией; М, маркер молекулярной массы; W, контроль воды; — клеточная линия НМС-1.1; +, клеточная линия НМС-1.2. (B) Протокол гемопоэтической дифференцировки. ЗТ были сформированы из ИПСК (Ba-b) и дифференцированы в сторону гемопоэтической линии (Bc-d). Масштабные линейки, 500 мкм. (C) Репрезентативный анализ проточной цитометрии KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из иПСК, от пациентов с 1 по 3. Графики представляют собой синхронизированные эксперименты по дифференцировке гемопоэза и показывают фенотипы, характерные для пациентов. Ворота 1, 2 и 3 предназначены для клеток CD45 + /KIT high , CD45 + /KIT + и CD235α + соответственно. (D) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT high для KIT D816V и контрольных клеток, полученных из ИПСК, от всех 3 пациентов (P1, P2 и P3).
Проточную цитометрию проводили между 15 и 31 днями гемопоэтической дифференцировки (n = 4-21). * P < .0001. (E) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P ≤ 0,0003. (F) Количественная оценка популяции CD235α + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P < .0001. (G) Анализ КОЕ для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК. Количество колоний и фенотип оценивали через 14 дней после посева. Столбцы показывают среднее количество колоний ± стандартное отклонение ≥3 независимых экспериментов, за исключением контрольных ИПСК пациента 2 (n = 2). * Р = 0,02. (H) Количественные данные RT-PCR для пациента 1, полученного из KIT D816V, и контрольных ИПСК и соответствующих HPC. Результаты получены из 2 и 4 независимых экспериментов по гемопоэтической дифференцировке для контроля и KIT D816V HPC соответственно.
Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной иерархической кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий представляют собой высокую и низкую экспрессию генов соответственно). Статистический анализ проводился с помощью шкалы Уэлча 9.0035 т тест.
Графики представляют собой синхронизированные эксперименты по дифференцировке гемопоэза и показывают фенотипы, характерные для пациентов. Ворота 1, 2 и 3 предназначены для клеток CD45 + /KIT high , CD45 + /KIT + и CD235α + соответственно. (D) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT high для KIT D816V и контрольных клеток, полученных из ИПСК, от всех 3 пациентов (P1, P2 и P3). Проточную цитометрию проводили между 15 и 31 днями гемопоэтической дифференцировки (n = 4-21). * P < .0001. (E) Количественная оценка популяций CD45 + /KIT + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P ≤ 0,0003. (F) Количественная оценка популяции CD235α + с помощью проточной цитометрии, как и в (D), между 15 и 49 днями дифференцировки (n = 4-30). * P < .0001. (G) Анализ КОЕ для KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК.
Количество колоний и фенотип оценивали через 14 дней после посева. Столбцы показывают среднее количество колоний ± стандартное отклонение ≥3 независимых экспериментов, за исключением контрольных ИПСК пациента 2 (n = 2). * Р = 0,02. (H) Количественные данные RT-PCR для пациента 1, полученного из KIT D816V, и контрольных ИПСК и соответствующих HPC. Результаты получены из 2 и 4 независимых экспериментов по гемопоэтической дифференцировке для контроля и KIT D816V HPC соответственно. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной иерархической кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий представляют собой высокую и низкую экспрессию генов соответственно). Статистический анализ проводился с помощью шкалы Уэлча 9.0035 т тест.
9 Кроме того, ИПСК KIT D816V показали сильное фосфорилирование гликозилированных и негликозилированных форм рецептора без стимуляции фактором стволовых клеток (SCF) (дополнительный рисунок 1F). Контрольные иПСК показали очень низкое фосфорилирование гликозилированного KIT; при стимуляции SCF наблюдалась интернализация рецептора и фосфорилирование немутировавших гликозилированных KIT, AKT и STAT3. Эти данные соответствуют KIT D816V, представляющему конститутивно активный рецептор в ИПСК.
0036 генотипа D816V (рис. 1C-D) и наблюдался в ранние моменты времени (> 14 дней; дополнительный рисунок 2A). KIT D816V придавал клеткам KIT + пролиферативное преимущество, независимо от стимуляции SCF, по сравнению с KIT — немутантными клетками KIT + (дополнительная фигура 2B). KIT D816V также сохранял жизнеспособность клеток после отмены цитокинов. Таким образом, KIT D816V способствует развитию тучных клеток in vitro в нашей модели иПСК и придает гемопоэтическим клеткам большую способность к пролиферации.
Цитоспиновые препараты клеток KIT D816V CD235α + выявили различные стадии созревания эритроидных клеток (дополнительная фигура 3C). ИПСК пациента 2 показали заметный CD45 9Популяция 0037 + /KIT + во время дифференцировки с морфологией миелоидных предшественников, сочетающейся с выраженным апоптозом (рис. 1C, E; дополнительная рис. 4). Анализы КОЕ показали сильное смещение в сторону гранулоцитов и макрофагов для KIT D816V и контрольных клеток, тогда как аномальные КОЕ-М небольшого размера наблюдались только в контроле (рис. 1G). Пациент 3 KIT D816V и контрольные гемопоэтические клетки, полученные из ИПСК, показали заметный CD45 + /KIT высокий 9Популяция 0038 MC (рис. 1C-D; дополнительная рис. 5A). Анализы КОЕ выявили сниженный колониеобразующий потенциал и смещение в сторону линии макрофагов, что согласуется с обилием макрофагов в препаратах цитоспина (рис. 1G; дополнительная рис. 5B).
1H).
В первичном образце от пациента 3 не было обнаружено KIT D816V или другой патогенной или вероятно патогенной мутации, что согласуется с низким числом 9Получено 0035 KIT ИПСК D816V (скринировано 1/129). Наличие различных одновременных мутаций отражает клональный состав и генетическую сложность патологии СМ и подчеркивает ценность линий ИПСК, полученных в этом исследовании, в качестве инструмента для моделирования заболеваний и скрининга соединений.
2447A>T 
5284a> G
Ser478Pro 
3781C>T 
0093
35G>A 
Pro72Arg 
>.0080
399G>A 
4393C>T 
2447A>T 
5284A>G 
Соответственно, цитоспиновые препараты показали большее количество ядерных эритроцитов в течение 9Клетки 0035 KIT D816V (рис. 2А). В анализах КОЕ эритроидная колониеобразующая единица (КОЕ-Э) и БОЕ-Э наблюдались только для мутировавших предшественников, и наблюдалась более высокая экспрессия генов гемоглобина HBB , HBE и HBZ (рис. 2А, CD). Для популяций KIT D816V и контрольных CD45 + /KIT high MC значимых различий не наблюдалось, что согласуется с сообщением о слабом онкогенном эффекте KIT D816V в отдельности. 33 В совокупности эти результаты демонстрируют, что ЭСК KIT D816V повторяют фенотипы, наблюдаемые в иПСК KIT D816V, полученных от пациентов, такие как конститутивное фосфорилирование KIT, снижение поверхностной экспрессии мутантного рецептора и смещение эритроидного ряда при гемопоэтической дифференцировке.
(A) Анализ методом проточной цитометрии KIT D816V и контрольных гемопоэтических клеток, полученных из ЭСК, через 11 дней после селекции CD34 + MACS (верхние панели). Заметные популяции CD235α + и CD45 + /KIT high наблюдаются в клетках, полученных из ЭСК KIT D816V. В цитоспиновых препаратах тех же образцов показаны ядерные эритроциты (красные стрелки) (нижние панели). Шкала баров, 50 мкм. (B) Количественная оценка популяций гемопоэтических клеток (n = 4), полученных из KIT D816V клон 1 и D816V клон 2 ЭСК и контрольные ЭСК. KIT D816V ESC демонстрируют заметные популяции CD45 + /KIT + и CD235 + . Популяции CD45 + /KIT high MC не отличались статистически значимо для KIT D816V и контроля. (C) Количественные данные RT-PCR для KIT D816V и контрольных ESC и соответствующих HPC через 11 дней после обогащения CD34 + с помощью MACS.
Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий, высокая и низкая экспрессия генов соответственно). (D) анализ КОЕ гемопоэтических клеток, полученных из КОМПЛЕКТ D816V и ESC управления. Столбики показывают среднее значение ± стандартное отклонение для 3 независимых экспериментов. * P < 0,05, тест Уэлча t . G, гранулоцит; ГМ, гранулоциты, макрофаги; М, макрофаги.
В цитоспиновых препаратах тех же образцов показаны ядерные эритроциты (красные стрелки) (нижние панели). Шкала баров, 50 мкм. (B) Количественная оценка популяций гемопоэтических клеток (n = 4), полученных из KIT D816V клон 1 и D816V клон 2 ESC и контрольных ESC. KIT D816V ESC демонстрируют заметные популяции CD45 + /KIT + и CD235 + . Популяции CD45 + /KIT high MC не отличались статистически значимо для KIT D816V и контроля. (C) Количественные данные RT-PCR для KIT D816V и контрольных ESC и соответствующих HPC через 11 дней после обогащения CD34 + с помощью MACS. Значения экспрессии генов были подвергнуты двунаправленной кластеризации и показаны в формате тепловой карты (красный и синий, высокая и низкая экспрессия генов соответственно). (D) анализ КОЕ гемопоэтических клеток, полученных из КОМПЛЕКТ D816V и ESC управления. Столбики показывают среднее значение ± стандартное отклонение для 3 независимых экспериментов.
* P < 0,05, тест Уэлча t . G, гранулоцит; ГМ, гранулоциты, макрофаги; М, макрофаги.
Мы также включили в наши исследования мидостаурин и иматиниб, поскольку мидостаурин используется для лечения пациентов с распространенным СМ, тогда как иматиниб неэффективен в 9 случаях.0035 КОМПЛЕКТ D816V СМ. 15-17,20 Нинтеданиб и мидостаурин показали схожую активность на клетках KIT D816V, и, как и ожидалось, иматиниб был практически неэффективен. Ригосертиб, миметик RAS, также был протестирован, поскольку онкогенные мутации RAS часто встречаются при гематологических злокачественных новообразованиях, включая SM. 2,34 Лечение ригосертибом клеток, полученных из иПСК, не показало специфичности в отношении клеток KIT D816V, и ответ у разных пациентов был разным (рис. 3В).
Значения IC50 рассчитывали на основании усредненных кривых титрования, полученных для клеток, полученных из разных линий ИПСК. Значения IC50 для нинтеданиба составляли от 27 до 105 нМ в течение KIT клеток D816V и от 262 до 542 нМ для контрольных клеток. (B) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных клеток KIT + , полученных из иПСК, обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина, иматиниба или ригосертиба в течение 66 часов. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля (0 нМ). Пациент 1: n = 6-12. Пациент 2: n = 3-9. Пациент 3: n = 6-9. * P ≤ 0,05, ** P < 0,001, *** P ≤ 0,0001, ответ на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными клетками KIT + при той же концентрации препарата, тест Уэлча t . (C) Репрезентативный Вестерн-блот анализ передачи сигналов рецептора KIT при обработке нинтеданибом или мидостаурином гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК KIT D816V.
Клетки обрабатывали 1 мкМ соединения в течение 4 часов перед анализом. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Указаны положения маркеров молекулярной массы. (D) Кривые ответа нинтеданиба (0–10 мкМ) для первичного образца SM (пациент 10) и здорового донора (HD; n = 2). МНК были подвергнуты MACS, и KIT 9Клетки 0037+ и KIT — обрабатывали нинтеданибом в течение 66 часов с последующим измерением жизнеспособности с помощью анализа CellTiter Glo. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Нинтеданиб проявляет цитотоксичность по отношению к здоровым донорским клеткам только при концентрациях, близких к 10 мкМ, тогда как жизнеспособность клеток серьезно снижается при концентрациях > 100 нМ. (E) Усредненный ответ от 7 до 11 первичных образцов SM и от 6 до 8 первичных образцов HD на обработку 1 мкМ нинтеданиба или мидостаурина. МНК обрабатывали, как описано в (D). Лечение нинтеданибом привело к значительному снижению жизнеспособности KIT 9.
0037 + SM MNC, тогда как мидостаурин одинаково нацелен на клетки KIT + и KIT — . Кроме того, нинтеданиб не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток HD, в отличие от мидостаурина, который приводил к значительному снижению жизнеспособности клеток KIT + и KIT — HD. * P ≤ 0,0003, тест Уэлча t .
(B) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольные клетки KIT + , полученные из ИПСК, обработанные 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина, иматиниба или ригосертиба в течение 66 часов. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля (0 нМ). Пациент 1: n = 6-12. Пациент 2: n = 3-9. Пациент 3: n = 6-9. * P ≤ 0,05, ** P < 0,001, *** P ≤ 0,0001, реакция клеток KIT D816V против контрольных клеток KIT + при той же концентрации препарата, критерий Welch’s t тест. (C) Репрезентативный вестерн-блот-анализ передачи сигналов рецептора KIT при лечении 9 нинтеданибом или мидостаурином.0035 KIT D816V Кроветворные клетки, полученные из иПСК. Клетки обрабатывали 1 мкМ соединения в течение 4 часов перед анализом. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Указаны положения маркеров молекулярной массы. (D) Кривые ответа нинтеданиба (0–10 мкМ) для первичного образца SM (пациент 10) и здорового донора (HD; n = 2).
МНК подвергали MACS, а клетки KIT + и KIT — обрабатывали нинтеданибом в течение 66 часов с последующим измерением жизнеспособности с использованием анализа CellTiter Glo. Клетки, обработанные растворителем (ДМСО), использовали в качестве контроля. Нинтеданиб проявляет цитотоксичность по отношению к здоровым донорским клеткам только при концентрациях, близких к 10 мкМ, тогда как жизнеспособность клеток серьезно снижается при концентрациях > 100 нМ. (E) Усредненный ответ от 7 до 11 первичных образцов SM и от 6 до 8 первичных образцов HD на обработку 1 мкМ нинтеданиба или мидостаурина. МНК обрабатывали, как описано в (D). Лечение нинтеданибом привело к значительному снижению жизнеспособности KIT 9.0037 + SM MNC, тогда как мидостаурин одинаково нацелен на клетки KIT + и KIT — . Кроме того, нинтеданиб не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток HD, в отличие от мидостаурина, который приводил к значительному снижению жизнеспособности клеток KIT + и KIT — HD.
* P ≤ 0,0003, тест Уэлча t .
Таким образом, клетки, полученные из ЭСК KIT D816V, полностью повторяют гемопоэтические фенотипы и реакции на лекарственные препараты, наблюдаемые для клеток, полученных из ИПСК KIT D816V, и дополнительно подтверждают, что KIT D816V является ценной мишенью при СМ.
19-21,35 Авапритиниб и рипретиниб эффективно снижали жизнеспособность клеточных линий HMC-1.1 и HMC-1.2 и фосфорилирование KIT, STAT5, AKT и ERK (дополнительная фигура 14), что согласуется с предыдущими исследованиями. 19,21,35 Наконец, как и в случае с нинтеданибом, авапритиниб и рипретиниб преимущественно снижали жизнеспособность полученных из ИПСК 9Ячейки 0035 KIT D816V (дополнительный рисунок 15). Эти результаты показывают селективность авапритиниба и рипретиниба в отношении KIT D816V и подтверждают надежность системы ИПСК KIT D816V, установленной в этом исследовании.
Напротив, мидостаурин показал меньшую селективность и воздействовал на первичные клетки KIT + и KIT — от пациентов со СМ и здоровых доноров (рис. 3D-E; дополнительная фигура 16B; дополнительная таблица 6). Лечение нинтеданибом привело к снижению аллельной нагрузки KIT D816V в SM MNC (дополнительная фигура 16C), а степень ответа на нинтеданиб положительно коррелировала с мутационной нагрузкой KIT D816V/H (дополнительная фигура 17A). Вестерн-блоттинг показал сильное снижение фосфорилирования KIT, STAT5 и ERK в первичном образце KIT D816H SM при обработке нинтеданибом (1 мкМ) (дополнительная фигура 17B), что согласуется с данными, полученными с использованием нашей модели на основе iPSC.
4А). KIT D816V MC показали более высокую поверхностную и генную экспрессию FCER1A, чем контрольные клетки, тогда как для CD45 и KIT различий не наблюдалось (рис. 4B, E). Флуоресцентно-активированные клеточные сортировки (FACS)-очищенные СК выявили гомогенную клеточную популяцию с многодольчатыми ядрами и некоторые более крупные клетки с метахроматическими и триптазо-положительными цитоплазматическими гранулами, признаками незрелых СК (рис. 4C-D; дополнительная фигура 18). Количественный анализ RT-PCR показал высокую экспрессию продуктов гена триптазы TPSAB1 и TPSB2, тогда как экспрессия мРНК карбоксипептидазы A3 и CMA1 была довольно низкой (рис. 4E).
(B) KIT D816V MC (красный) демонстрируют более высокую экспрессию FCER1A по сравнению с контрольными клетками (синий) (верхняя панель; пунктирная линия показана в качестве ссылки). Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) FCER1A (n = 6-9), KIT (n = 18–19) и CD45 (n = 15–17) на KIT D816V MC и элементах управления (нижние панели) * P = 0,017, тест Уэлча t . ( C ) Репрезентативные составные изображения цитоспинов, окрашенных кислым толуидиновым синим (левые панели) или мазков (правые панели) KIT D816V, отсортированных с помощью FACS, и контрольных MC (сборка изображений обозначена пунктирными линиями). Наблюдалась гомогенная популяция многодольчатых промастоцитов с метахроматическими гранулами (стрелки) или без них (стрелки). Шкала баров, 25 мкм. (D) То же, что и в (C), но окрашено на триптазу. Наблюдались клетки с высоким (стрелки) и низким (стрелки) количеством триптазоположительных гранул. Шкала баров, 25 мкм. Полные репрезентативные изображения (C) и (D) см.
на дополнительном рисунке 18. (E) Количественный анализ ОТ-ПЦР для KIT D816V и контрольные СК, отсортированные по FACS (n = 9–15 и n = 3–7 соответственно). Экспрессия мРНК MC-специфичной химазы 1 ( CMA1 ), триптазы α/β 1 ( TPSAB1 ), триптазы β2 ( TPSB2 ), карбоксипептидазы A3 ( CPA3 ), KIT 3 909 и FCER1A изображено. KIT D816V ТК демонстрируют более высокую экспрессию мРНК FCER1A по сравнению с немутировавшими клетками KIT . * P = 0,014, тест Уэлча t . (F) Кривые реакции на лекарство для FACS-сортированных KIT D816V и контрольные ТК (n = 5 и n = 4, соответственно, полученные из 2 линий иПСК KIT D816V и 1 контрольной линии иПСК), получавших нинтеданиб, мидостаурин или иматиниб. Значения IC50 нинтеданиба составляли 34 и 633 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. Значения IC50 мидостаурина составляли 48 и 570 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно.
(G) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных СК, полученных из ИПСК, отсортированных с помощью FACS (n = 9-15 и n = 12 соответственно), обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина или иматиниба. * P = 0,02, ** P ≤ 0,0006, реакция на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными MC при той же концентрации лекарства, тест Уэлча t . нс, не имеет значения.
( C ) Репрезентативные составные изображения цитоспинов, окрашенных кислым толуидиновым синим (левые панели) или мазков (правые панели) 9, отсортированных с помощью FACS.0035 KIT D816V и контрольные МК (изображение в сборе обозначено пунктиром). Наблюдалась гомогенная популяция многодольчатых промастоцитов с метахроматическими гранулами (стрелки) или без них (стрелки). Шкала баров, 25 мкм. (D) То же, что и в (C), но окрашено на триптазу. Наблюдались клетки с высоким (стрелки) и низким (стрелки) количеством триптазоположительных гранул. Шкала баров, 25 мкм. Полные репрезентативные изображения (C) и (D) см. на дополнительном рисунке 18. (E) Количественный анализ ОТ-ПЦР для KIT D816V и контрольные СК, отсортированные по FACS (n = 9–15 и n = 3–7 соответственно). Экспрессия мРНК MC-специфичной химазы 1 ( CMA1 ), триптазы α/β 1 ( TPSAB1 ), триптазы β2 ( TPSB2 ), карбоксипептидазы A3 ( CPA3 ), KIT 3 909 и FCER1A изображено. KIT D816V ТК демонстрируют более высокую экспрессию мРНК FCER1A по сравнению с немутировавшими клетками KIT .
* P = 0,014, тест Уэлча t . (F) Кривые реакции на лекарство для FACS-сортированных KIT D816V и контрольные ТК (n = 5 и n = 4, соответственно, полученные из 2 линий иПСК KIT D816V и 1 контрольной линии иПСК), получавших нинтеданиб, мидостаурин или иматиниб. Значения IC50 нинтеданиба составляли 34 и 633 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. Значения IC50 мидостаурина составляли 48 и 570 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (G) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение KIT D816V и контрольных СК, полученных из ИПСК, отсортированных с помощью FACS (n = 9-15 и n = 12 соответственно), обработанных 100 нМ или 1 мкМ нинтеданиба, мидостаурина или иматиниба. * P = 0,02, ** P ≤ 0,0006, реакция на лекарство KIT D816V по сравнению с контрольными MC при той же концентрации лекарства, тест Уэлча t . нс, не имеет значения.
5B-E). Нинтеданиб снижал жизнеспособность KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток, и значительные различия в реакции на лекарство наблюдались при 1 мкМ соединения (фиг. 5F). Активность нинтеданиба в отношении клеток, полученных из ИПСК, была сравнима с таковой, наблюдаемой в эндотелиальных клетках, полученных из костного мозга человека (дополнительная фигура 20). Важно отметить, что цитотоксические эффекты были в 20-100 раз более выраженными на гемопоэтических клетках-предшественниках и тучных клетках, полученных из иПСК, чем на эндотелиальных клетках, независимо от наличия мутации KIT D816V (рис. 5G).
(B) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, экспрессируют эндотелиальные маркеры CD34, CD31, CD105 и CD144, но не экспрессируют CD45 и CD43. (С) KIT Эндотелиальные клетки D816V (красные) имеют более низкую экспрессию рецептора KIT на поверхности по сравнению с контрольными клетками (синие), как показано на репрезентативных графиках; изотип-контроль показан серым цветом (n = 3) * P = 0,0005. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток показало гомогенную поверхностную экспрессию CD31 (левые панели) и CD144 (средние панели). Клетки эффективно поглощали ацетилированные ЛПНП, конъюгированные с Dil (правые панели). Ядра окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий). Масштабные линейки, 100 мкм. (E) Количественные данные ОТ-ПЦР показывают аналогичную экспрессию CD31, CD34 и CD144 в KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки. Экспрессия мРНК KIT была несколько выше в мутантных клетках (n = 4-5).
* P = 0,03. (F) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные от ИПСК пациентов 1 и 3, показали сходные кривые ответа на нинтеданиб (левая панель; n = 2-3). Пациент 1 (P1), IC50 D816V = 1632 нМ и IC50 контроля = 7003 нМ; пациент 3 (P3), IC50 D816V = 2073 нМ и IC50 контроля = 3803 нМ). 9Эндотелиальные клетки 0035 KIT D816V были более подвержены влиянию обработки 1 мкМ нинтеданиба, чем немутированные клетки (правая панель; n = 3-4). * P < 0,01, тест Уэлча t . (G) Сравнение кривых ответа на лекарство, полученных для KIT D816V (левая панель) или контрольных (правая панель) эндотелиальных клеток (n = 2-3), HPC (из рисунка 3) и MC (из рисунка 4), обработанных с помощью нинтеданиб (от 1 нМ до 10 мкМ). НД, не обнаружено.
(A) Эндотелиальная дифференцировка для KIT D816V или контрольных ИПСК. Показаны репрезентативные фазово-контрастные микроскопические изображения дней 1, 7, 11 и 14. Масштабные линейки, 500 мкм. (B) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, экспрессируют эндотелиальные маркеры CD34, CD31, CD105 и CD144, но не экспрессируют CD45 и CD43. (C) Эндотелиальные клетки KIT D816V (красные) имеют более низкую экспрессию рецептора KIT на поверхности по сравнению с контрольными клетками (синие), как показано на репрезентативных графиках; изотип-контроль показан серым цветом (n = 3) * Р = .0005. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание KIT D816V и контрольных эндотелиальных клеток показало гомогенную поверхностную экспрессию CD31 (левые панели) и CD144 (средние панели). Клетки эффективно поглощали ацетилированные ЛПНП, конъюгированные с Dil (правые панели). Ядра окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий).
Масштабные линейки, 100 мкм. (E) Количественные данные ОТ-ПЦР показывают аналогичную экспрессию CD31, CD34 и CD144 в KIT D816V и контрольных эндотелиальных клетках. КОМПЛЕКТ 9Экспрессия мРНК 0036 была несколько выше в мутантных клетках (n = 4-5). * P = 0,03. (F) KIT D816V и контрольные эндотелиальные клетки, полученные от ИПСК пациентов 1 и 3, показали сходные кривые ответа на нинтеданиб (левая панель; n = 2-3). Пациент 1 (P1), IC50 D816V = 1632 нМ и IC50 контроля = 7003 нМ; пациент 3 (P3), IC50 D816V = 2073 нМ и IC50 контроля = 3803 нМ). KIT Эндотелиальные клетки D816V были более подвержены воздействию 1 мкМ нинтеданиба, чем немутированные клетки (правая панель; n = 3–4). * P < 0,01, тест Уэлча t . (G) Сравнение кривых ответа на лекарство, полученных для KIT D816V (левая панель) или контрольных (правая панель) эндотелиальных клеток (n = 2-3), HPC (из рисунка 3) и MC (из рисунка 4), обработанных с помощью нинтеданиб (от 1 нМ до 10 мкМ).
НД, не обнаружено.
и 1PKG соответственно, дополнительная фигура 21B). Нинтеданиб предпочтительно связывается с KIT D816V, ориентируя индольную часть к А-петле, а метилпиперазиновую часть к С-концевой области (дополнительная фигура 22).
Соединения тестировали на KIT D816V и контрольных гемопоэтических клетках, полученных из иПСК; 7 из них преимущественно нацелены на клетки KIT D816V (рис. 6А). Четыре соединения (BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS и BIBE3316BS) были дополнительно оценены и показали значения IC50, аналогичные нинтеданибу (рис. 6B-C).
6ХХ или BIBE3316BS. Значения IC50 составляли от 96 до 203 нМ и от 849 до 917 нМ для KIT D816V и контрольных клеток соответственно. (C) Средний ответ на лекарство ± стандартное отклонение гемопоэтических клеток, полученных из ИПСК KIT D816V, обработанных 1 мкМ BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS или BIBE3316BS, демонстрирует значительное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с обработанными контрольными клетками (n = 6–9). ). * P < 0,0001, тест Уэлча t . (D) Структуры и взаимодействия, основанные на отпечатке взаимодействия белок-лиганд, как описано на дополнительной фигуре 24B. Лис593, Glu605, Lys623, Glu671 и Cys673 устанавливают взаимодействие Н-связей с лигандами. Val603/Gly676 и Phe811 устанавливают взаимодействия H-аренов и ароматические взаимодействия, соответственно, с ароматическими фрагментами лигандов. Эти взаимодействия представлены кружками, потому что они распространяются на все атомы ароматических колец. Цвета однозначно идентифицируют каждый остаток, но не относятся к типу установленного взаимодействия.
). * P < 0,0001, тест Уэлча t . (D) Структуры и взаимодействия, основанные на отпечатке взаимодействия белок-лиганд, как описано на дополнительной фигуре 24B. Лис593, Glu605, Lys623, Glu671 и Cys673 устанавливают взаимодействие Н-связей с лигандами. Val603/Gly676 и Phe811 устанавливают взаимодействия H-аренов и ароматические взаимодействия, соответственно, с ароматическими фрагментами лигандов. Эти взаимодействия представлены кружками, потому что они распространяются на все атомы ароматических колец. Цвета однозначно идентифицируют каждый остаток, но не относятся к типу установленного взаимодействия.
При связывании с KIT D816V, BIBG1724TF, BIBF1496XX, BIBE3315BS и BIBE3316BS располагали свою индолоподобную часть по направлению к А-петле в том же положении, что и индольная часть нинтеданиба, и они устанавливали аналогичные молекулярные контакты с теми же аминокислотными остатками в KIT. D186V (рис. 6D; дополнительная рис. 24B).
Это соответствует зарегистрированному случаю KIT D816V SM-AHD с ассоциированным острым эритроидным лейкозом. 41 Мутации в TET2 , RUNX1 и SRSF2 у пациента 2 ИПСК привели к миелоидному гематопоэзу и выраженному апоптозу, что согласуется с опубликованными данными и миелодиспластическим синдромом, диагностированным у этого пациента. 42-46 
17,19-21 Важно отметить, что нинтеданиб нарушал жизнеспособность клеток в образцах пациентов с СМ и блокировал фосфорилирование KIT D816V и передачу сигналов в первичных клетках пациентов.
Морфологических различий между KIT D816V и контрольными ТК не наблюдалось, но KIT D816V ТК демонстрировали более высокую экспрессию и поверхностные уровни FCER1A, отражая ускоренное развитие и созревание ТК. Самое главное KIT D816V ТК, полученные из иПСК, также были эффективно нацелены на нинтеданиб.
Таким образом, иПСК KIT D816V представляют собой моментальный снимок конкретного болезненного состояния, и их дифференцировка в гемопоэтические предшественники KIT D816V и ТК не отражает прогрессирования заболевания СМ. В этом контексте обсуждается вопрос о том, является ли мутация KIT D816V ранним или поздним событием в патогенезе СМ. Джавар и др. определили KIT D816V в качестве позднего события после мутаций TET2 , SRSF2 и ASXL1 . 23 Grootens et al., используя секвенирование одноклеточной РНК образцов пациентов с SM, идентифицировали KIT D816V в гемопоэтических стволовых клетках, а также в клетках-предшественниках, примированных по линии, и ТК. 50 Совсем недавно сообщалось, что лейкемические стволовые клетки для MCL находятся во фракции CD34 + /CD38 — злокачественного клона. 51 В свете этих сообщений наша модель заболевания SM на основе иПСК представляет собой мощный инструмент для систематической оценки влияния KIT D816V на различные стадии кроветворения.
Отделение высокопроизводительной биомедицины Института молекулярной медицины Финляндии, Хельсинки, Финляндия выражает признательность за помощь. Авторы также благодарят Майкла Хубера, Томаса Вильгельма и Маттиаса Бегеманна за обсуждения и советы, Мишеля Арока за клетки ROSA KIT D816V, Ананди Раджендирана и Стефана Дрешерса за предоставление образцов лейкоцитарной пленки здоровых доноров и Йорга Эшвайлера за предоставление образцов бедренной кости.
001703/2014-05) и пожертвование Ульриха Леманна. М.Г., Н.К. и М.З. финансировались IZKF Aachen. С.М.М. был поддержан финскими онкологическими организациями, Фондом Сигрид Юселиус и специальной государственной субсидией Финляндии на медицинские науки, исследования и обучение (Хельсинки, Финляндия). С.К. был поддержан грантом Немецкого фонда лейкемии Хосе Каррераса (DJCLS 16 R/2017). П.В. поддерживается Австрийским научным фондом — проект SFB F4704-B20.
предоставил поддержку для иммуногистохимических анализов; О.М.Дж.Д. и С.М.М. провел высокопроизводительные эксперименты по скринингу наркотиков и проанализировал данные; ЯВЛЯЮСЬ. выполнен анализ NGS; H.M.S. выполнили цитогенетические анализы; Р. Гетцке и В.В. выполнил анализ метилирования ДНК; Т.Б. выполнен гистологический анализ; Дж.П. и А.К. предоставил образцы пациентов и поддержку для анализа данных NGS; М.Дж. и А.Р. предоставленные образцы пациентов; Ф.Х. и П.Е. предоставил аналоги нинтеданиба и поддержку для анализа данных; С.К. и Т.Х.Б. предоставил образцы пациентов и поддержку для анализа данных; П.В. предоставил образцы пациентов, поддержку анализа данных и написал рукопись; NC разработала эксперименты, провела вестерн-блоттинг и обеспечила поддержку анализа данных; М.З. разработал эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись; и все авторы одобрили окончательную версию рукописи для представления.
В.В. является соучредителем Cygenia GmbH, которая предоставляет услуги по валидации ИПСК Epi-Pluri-Score. П.В. консультирует или является членом консультативных советов Novartis, Deciphera и Blueprint. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.