Флуоресцентного. Флуоресцентная микроскопия: принципы работы, компоненты и применение

Что такое флуоресцентная микроскопия. Как работают флуорофоры. Какие фильтры используются в флуоресцентном микроскопе. Чем отличается конфокальная флуоресцентная микроскопия. Где применяется флуоресцентная микроскопия.

Что такое флуоресцентная микроскопия и как она работает

Флуоресцентная микроскопия — это мощный метод визуализации биологических образцов, основанный на явлении флуоресценции. Но как именно работает этот метод?

Флуоресценция возникает, когда молекулы (флуорофоры) поглощают свет определенной длины волны и затем излучают свет с большей длиной волны. В флуоресцентном микроскопе образец освещается светом возбуждения, который поглощается флуорофорами. Затем флуорофоры излучают свет флуоресценции, который регистрируется детектором микроскопа.

Ключевое преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет визуализировать конкретные структуры или молекулы в клетках и тканях с высокой специфичностью и чувствительностью. Это достигается путем прикрепления флуорофоров к интересующим молекулам или использования генетически-кодируемых флуоресцентных белков.

Флуорофоры — ключевые компоненты флуоресцентной микроскопии

Флуорофоры играют центральную роль в флуоресцентной микроскопии. Но что именно представляют собой эти молекулы?

Флуорофор — это молекула, способная к флуоресценции. При поглощении света определенной длины волны электроны флуорофора переходят в возбужденное состояние. Затем, возвращаясь в основное состояние, они излучают свет с большей длиной волны.

Важные характеристики флуорофоров включают:

• Спектр поглощения и излучения
• Квантовый выход (эффективность флуоресценции)
• Фотостабильность (устойчивость к фотообесцвечиванию)
• Яркость

Выбор подходящего флуорофора критически важен для успеха флуоресцентного эксперимента. Исследователи могут использовать синтетические флуоресцентные красители или флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP).

Система фильтров во флуоресцентном микроскопе

Система фильтров — это сердце флуоресцентного микроскопа. Но как именно работают эти фильтры?

В типичном флуоресцентном микроскопе используются три основных типа фильтров:

1. Фильтр возбуждения: пропускает только свет, необходимый для возбуждения флуорофора.
2. Дихроичное зеркало: отражает свет возбуждения к образцу и пропускает излученный флуоресцентный свет.
3. Запирающий фильтр: пропускает только флуоресцентный свет от образца, блокируя свет возбуждения.

Эта система фильтров позволяет эффективно отделять слабый флуоресцентный сигнал от яркого света возбуждения. Правильный выбор фильтров критически важен для получения высококачественных флуоресцентных изображений с высоким отношением сигнал/шум.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия: повышение разрешения и контраста

Конфокальная флуоресцентная микроскопия представляет собой усовершенствованную версию обычной флуоресцентной микроскопии. Но в чем ее ключевые преимущества?

Основное отличие конфокальной микроскопии заключается в использовании пинхола — небольшой диафрагмы, которая блокирует свет не из фокальной плоскости. Это позволяет:

• Получать оптические срезы образца
• Значительно улучшить разрешение, особенно в Z-направлении
• Повысить контраст изображения
• Проводить трехмерную реконструкцию образцов

Конфокальная микроскопия особенно полезна при работе с толстыми образцами или при необходимости точной локализации флуоресцентных меток в трехмерном пространстве клетки или ткани.

Применение флуоресцентной микроскопии в биологии и медицине

Флуоресцентная микроскопия нашла широкое применение в различных областях биологии и медицины. Но где именно она используется?

Основные области применения включают:

• Визуализация клеточных структур и органелл
• Исследование динамики белков и других молекул в живых клетках
• Изучение межклеточных взаимодействий
• Анализ экспрессии генов с использованием флуоресцентных репортеров
• Диагностика заболеваний, включая некоторые виды рака
• Исследование нейронных сетей в мозге

Флуоресцентная микроскопия продолжает развиваться, и новые методы, такие как сверхразрешающая микроскопия, открывают новые возможности для исследований в области биологии и медицины.

Преимущества и ограничения флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия обладает рядом уникальных преимуществ, но также имеет некоторые ограничения. Каковы основные плюсы и минусы этого метода?

Преимущества:

• Высокая специфичность: можно визуализировать конкретные молекулы или структуры
• Высокая чувствительность: возможно обнаружение даже отдельных молекул
• Возможность работы с живыми образцами
• Многоцветная визуализация: одновременное наблюдение нескольких мишеней

Ограничения:

• Фотообесцвечивание флуорофоров
• Возможная фототоксичность при длительном освещении живых образцов
• Ограниченное проникновение света в толстые образцы
• Сложность количественного анализа из-за вариаций в интенсивности флуоресценции

Понимание этих преимуществ и ограничений критически важно для правильного планирования и интерпретации флуоресцентных экспериментов.

Новые тенденции и будущее флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия продолжает активно развиваться. Какие новые технологии и подходы формируют будущее этого метода?

Некоторые ключевые тенденции включают:

• Сверхразрешающая микроскопия: методы, преодолевающие дифракционный предел разрешения
• Светочувствительные методы: сочетание оптогенетики и флуоресцентной микроскопии
• Мультифотонная микроскопия: глубокая визуализация тканей с минимальным повреждением
• Адаптивная оптика: улучшение качества изображения в толстых образцах
• Искусственный интеллект: автоматизированный анализ флуоресцентных изображений

Эти инновации расширяют возможности флуоресцентной микроскопии, позволяя исследователям заглянуть еще глубже в тайны живых систем на молекулярном и клеточном уровнях.

Фильтры для флуоресцентной микроскопии — azimp-micro.ru

Микроскоп для визуализации флуоресценции использует 3 типа фильтров: запирающий, дихроичный и фильтр возбуждения. В статье описываются основные функции и особенности каждого типа фильтров, а также принцип работы флуорофоров.

Флуорофоры

Флуорофор — это молекула или часть молекулы, которая способна генерировать флуоресценцию. При воздействии света соответствующей частоты, необходимой для возбуждения молекулы из ее основного состояния в возбужденное состояние, происходит переход. Однако, находясь в возбужденном состоянии, молекула будет нестабильной. Через некоторое короткое время (обычно от 10^-15 до 10^-9 с) фотон высвобождается, что позволяет молекуле вернуться в состояние с более низкой энергией. Излучаемый свет будет иметь большую длину волны (более низкую энергию), чем поглощенное излучение, из-за потери энергии через различные механизмы, такие как вибрации, звук и тепловая энергия.

Один флуорофор может непрерывно возбуждаться, если он не разрушится фотообесцвечиванием (то есть необратимым разрушением флуорофора из-за вызванного фотоном химического повреждения или ковалентной модификации). Среднее число циклов возбуждения и эмиссии, которые конкретный флуорофор может пройти перед фотообесцвечиванием, зависит от его молекулярной структуры и среды; некоторые флуорофоры быстро обесцвечиваются, испуская лишь несколько фотонов, в то время как другие гораздо более устойчивы и могут пройти тысячи или даже миллионы циклов, прежде чем произойдет разрушение.

Фильтры для флуоресцентной микроскопии

Экспериментальная установка на рисунке показывает типичные фильтры, используемые для эпифлуоресцентной микроскопии, типа микроскопии, в которой как возбуждающий, так и свет от образца проходят через объектив микроскопа. Тщательно выбирая подходящие фильтры и зеркала для конкретного применения, можно максимально увеличить отношение сигнал / шум. Как показано на схеме, три типа фильтров используются для максимизации сигнала флуоресценции при минимизации нежелательного излучения. Особенности каждого оптического элемента обсуждается ниже.

Схема оптический путей флуоресцентного микроскопа

Фильтры возбуждения

Фильтр возбуждения пропускает только узкую полосу длин волн вокруг пиковой длины волны возбуждения флуорофора. Например, как показано на графике, полоса пропускания, соответствующая пропусканию более 90% для фильтра возбуждения желтого флуоресцентного белка (YFP) (MF497-16), составляет 489 — 505 нм; Падающее излучение за пределами этого диапазона либо частично (для областей вблизи области пропускания), либо полностью (для областей, расположенных дальше от полосы пропускания), блокируется фильтром.

Графики коэффициента пропускания набора фильтров MDF-YFP. Обратите внимание, что дихроичное зеркало (зеленый) отражает свет в диапазоне длин волн возбуждения (синий) и пропускает свет в диапазоне длин волн излучения (зеленый).

Дихроичный фильтр

Дихроичные зеркала предназначены для отражения света, длина волны которого ниже определенного значения (то есть длины волны отсечки), в то же время позволяя всем другим длинам волн проходить через него без изменений. В микроскопе дихроичное зеркало направляет нужный диапазон длин волн на образец, а также на систему формирования изображения. Значение длины волны отсечки, связанное с каждым зеркалом, определяется как длина волны, которая соответствует 50% пропускания. Например, как показано на графике, длина волны отсечки для дихроичного зеркала желтого флуоресцентного белка (YFP) (MD515) составляет ~ 515 нм.

Поместив одно из этих зеркал в экспериментальную установку под углом 45° относительно падающего излучения, возбуждающее излучение (показано синим на приведенном выше схематическом рисунке) отражается от поверхности дихроичного зеркала и направляется к образцу и объективу микроскопы, в то время как флуоресценция, исходящая от образца (показано красным на приведенной выше схеме), проходит через зеркало на систему детектирования.

Хотя дихроичные зеркала играют решающую роль в флуоресцентной микроскопии, они не идеальны, когда речь идет о блокировке нежелательного света; как правило, ~ 90% света на длинах волн ниже значения длины волны отсечки отражаются, и ~ 90% света на длинах волн выше этого значения передаются дихроичным зеркалом. Следовательно, часть возбуждающего света может проходить через дихроичное зеркало вместе с более длинноволновой флуоресценцией, испускаемой образцом. Чтобы предотвратить попадание этого нежелательного света в систему детектирования, в дополнение к дихроичному зеркалу используется запирающий фильтр.

Запирающий фильтр

Запирающий фильтр необходим для обеспечения того, чтобы флуоресценция от образца достигала детектора, а излучение возбуждения было заблокировано. Подобно фильтру возбуждения, этот фильтр пропускает только узкую полосу длин волн вокруг пиковой длины волны излучения флуорофора. Например, как показано на графике, полоса пропускания, соответствующая пропусканию более 90% для запирающего фильтра желтого флуоресцентного белка (YFP) (MF535-22), составляет 524 — 546 нм; Падающее излучение за пределами этого диапазона либо частично (для областей вблизи области пропускания), либо полностью (для областей, расположенных дальше от полосы пропускания), блокируется фильтром.

Флуоресцентная конфокальная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия представляет собой метод анализа различных биологических объектов за счет их способности излучать при облучении светом. Данное явление называется флуоресценцией, т.е. молекулы биологических образцов способны поглощать кванты возбуждающего излучения и переходить в электронно-возбужденное состояние (верхние энергетические уровни), а затем снова возвращаться в основное состояние (нижний энергетический уровень).

Но в данной ситуации есть два важных аспекта, которые негативно влияют на результаты измерений:

• Во-первых, биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо
• Во-вторых, при использовании обычных оптических флуоресцентных микроскопов при исследовании достаточно «толстых» образцов помимо излучения от точки, находящейся в фокусе, приемник/оптическая система будет регистрировать и фоновое излучение от областей, находящихся вне фокальной плоскости объектива

Данная проблема дала толчок развитию конфокальной флуоресцентной микроскопии и использованию специальных вспомогательных веществ (флюорофоры), отличающихся сильной флуоресценцией при облучении их светом. Таким образом, появилась возможность отсекать фоновое излучение с помощью специальных диафрагм (пинхол), используемых в конфокальных микроскопах и получать специфически контрастную окраску и делать снимки с высоким разрешением многих внутриклеточных белковых структур.

Таким образом, использование конфокального флуоресцентного микроскопа вместо обычного, а также большой выбор флюорофоров, позволяют получать четкие изображения различных биологических структур в разных плоскостях сканирования. Это открывает новые возможности для ученых и исследователей биологической, медицинской и подобных областей.

Стоит также отметить, что на сегодняшний день важной потребностью в данной области является исследование не только одного, а сразу нескольких биологических материалов с разными флуорофорами. Наш лазерный сканирующий конфокальный флуоресцентный микроскоп K1-Fluo предоставляет Вам такую возможность. В конфигурацию данного микроскопа может быть включено до 4 возбуждающих лазера (доступен широкий выбор длин волн для облучения необходимых флюорофоров), а излучение флуоресценции от каждого образца фокусируется отдельным детектором, что увеличивает общую производительность.

Дополнительно наш флуоресцентный микроскоп может быть интегрирован в любой из доступных коммерческих микроскопов (Zeiss, Nikon, Olympus, Leica), либо поставляться совместно с DMB-стойкой, если Вам необходимо компактное решение для конфокальной флуоресцентной микроскопии.

В данном микроскопе, как и в обычном конфокальном микроскопе NS-3500, также реализована технология использования пьезоэлектрических приводов для перемещения сканирующей головки в диапазоне 400 мкм с шагом в 0.1 нм в режиме точного сканирования, что позволяет получать изображения биологических образцов с еще более высоким разрешением и контрастом, чем у других аналогов. Эта особенность позволяет анализировать и получать трехмерные изображения мельчайших структур.

Другим важным аспектом для флуоресцентной микроскопии является необходимость наличия инструмента для управления сложной системой и анализа полученной информации. Наше простое и интуитивное программное обеспечение позволяет с легкостью анализировать управлять всеми компонентами микроскопа (лазеры, сканеры, детекторы, предметный столик) независимо.

Также оно предоставляет Вам возможность анализировать большие образцы за счет сканирования малых областей и их последующего сшивания; исследовать более мелкие области, представляющие наибольший интерес; проводить анализ отельных участков вдоль любых направлений в горизонтальной плоскости; получать трехмерные изображения биологических структур и т.д.

Дополнительная система автофокусировки и наличие ПЗС-камеры еще больше упрощают процедуру измерения и позволяют Вам полностью сосредоточиться на исследовании, не отвлекаясь на второстепенные действия, а широкий выбор аксессуаров позволить охватить более широкие области исследований.

В отличие от разрушающей флуоресценции, с помощью CLSM микроскопа можно изучать структуру клеток и их органелл, например, цитоскелета, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов.

Еще одна задача – это исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

CLSM также находит применение в обнаружении рака кожи и наблюдении подкожных тканей. Недавно была представлена система конфокального эндоскопа для субмикронных желудочно-кишечных исследований.

флуоресцентный — Викисловарь

Содержание

• 1 Английский
  • 1.1 Произношение
  • 1.2 Прилагательное
    • 1.2.1 Производные термины
    • 1.2.2 Связанные термины
    • 1.2.3 Переводы
    • 1.2.4 См. также
  • 1.3 Существительное
  • 1.4 См. также
• 2 Каталонский
  • 2.1 Прилагательное
    • 2.1.1 Связанные термины
  • 2.2 Дополнительная литература
• 3 Французский
  • 3. 1 Произношение
  • 3.2 Прилагательное
  • 3.3 Дополнительная литература
• 4 окситанский
  • 4.1 Произношение
  • 4.2 Прилагательное
    • 4.2.1 Связанные термины
• 5 Румынский
  • 5.1 Этимология
  • 5.2 Прилагательное
    • 5.2.1 Склонение

Английский[править]

Произношение[править]

• (Полученное произношение) IPA ^(ключ) : /ˌflʊəˈɹɛsənt/

• Аудио (Великобритания)

  (файл)

• (США) IPA ^(ключ) : /flɔˈɹɛsɨnt/
• Гомофон: флуоресцентный, в некоторых произношениях
• Рифмы: -ɛsənt

Прилагательное0115 самый флуоресцентный

)

1. Из флуоресценции или относящейся к ней.
2. Экспонируемые или полученные методом флуоресценции.

   флуоресцентных растений мерцали в темноте.

3. Излучение видимого света в результате возбуждения люминофоров ультрафиолетовыми фотонами, возникающими при пропускании электрического тока через инертный газ, наполненный ртутью.

   Качество флуоресцентный 9Технология освещения 0116 значительно улучшилась за последние годы.

4. Светящийся как флуоресцентный; яркий

   Ее рубашка была флуоресцентной оранжевой.

Производные термины[править]

• люминесцентная лампа
• флуоресцентная бирка
• люминесцентная лампа
• зеленый флуоресцентный белок
• вакуумный флуоресцентный дисплей

Связанные термины[править]

• флуорофор

Переводы

• Каталонский: флуоресцентный (ca)
• Чешский: флуоресцентный, светлый
• Датский: флуоресцеренде
• Финский: fluoresenssi-
• Французский: флуоресцентный (fr)
• Галисийский: флуоресцентный
• Немецкий: fluoreszierend (de)
• Итальянский: fluorescente (it)
• Японский: 蛍光 (ja) (けいこう, keikō)
• Окситан: флуоресцентный (oc)
• Португальский: флуоресцентный (pt)
• Испанский: флуоресцентный
• Шведский: fluorescerande (sv)
• Тагальский: магилав, гилавин

См.

также[править]

• переливчатый
• люминесцентный

Существительное

1. Люминесцентная лампа.

   флуоресцентные лампы гудели день и ночь.

See also[edit]

• incandescent

---

Catalan[edit]

Adjective[edit]

fluorescent ( masculine and feminine plural fluorescents )

1. флуоресцентный

Связанные термины0113 Diccionari de la llengua catalana, segona edició

, Institut d’Estudis Catalans.

«флуоресцентный», в Gran Diccionari de la Llengua Catalana , Grup Enciclopèdia Catalana, 2023

«флуоресцентный» в Diccionari normatiu valencià , Acadèmia Valenciana de la Llengua.

«флуоресцентный» в Diccionari català-valencià-balear , Antoni Maria Alcover и Francesc de Borja Moll, 1962.

---

Произношение[править]

• Аудио

  (файл)

• Audio (Switzerland)

  (file)

Adjective[edit]

fluorescent ( feminine fluorescente , masculine plural fluorescents , feminine множественное число флуоресцентные )

1. флуоресцентный

Дальнейшее чтение [Прайти]

• «Флуоресцентное», в Trésor de la Langue Française Informatisé [Оцифровано казначейство французского языка] , 2012.

---

occiTan [EDIT]

88888 888 888 8.

• Audio (Béarn)

  (файл)

Прилагательный [EDIT]

2 Meling 903NININININE 903ININININE 903INININININE 903ININININE 903INININE ININININE ININININE ININININE 903INININE 903INININE 903INININE .0114 флуоресцентные , мужской род множественного числа флуоресцентные , женский род множественного числа флуоресцентные )

1. флуоресцентный

Связанные термины

Прилагательное0114

флуоресцентный , мужской род множественного числа флуоресцентный , женский и средний род множественного числа флуоресцентный )

1. флуоресцентный

Склонение

единственное число множественное число мужской род средний женский мужской род средний женский именительный/
винительный неопределенный флуоресцентный флуоресцентный флуоресцентные флуоресцентный определенный флуоресцентный флуоресцентный флуоресцентные флуоресцентный родительный/
дательный неопределенный флуоресцентный флуоресцентный флуоресцентные флуоресцентный определенный флуоресцентный флуоресцентный флуоресцентный флуоресцентный цвет

Флуоресцентные лампы – определение, значение и синонимы

ПЕРЕЙТИ К СОДЕРЖАНИЮ

флуоресцентные лампы

Флуоресцентная лампа получает свет от ртутной лампы. Лампа накаливания, связанная с Томасом Эдисоном, имеет нить накаливания, которая светится при нагревании.

Вы также можете использовать флуоресцентный для описания чего-то настолько яркого и яркого, что кажется, что он излучает свет. Флуоресцентный связан со словом плавиковый шпат или флюорит , который представляет собой светящийся минерал. Обратите внимание на -u- в этих словах. Fluorescent происходит от латинского fluere «течь» — плавиковый шпат можно добавлять, например, в сварочные составы для облегчения их растекания. Флуоресцентный без -u- означает «цветущий» от латинского 9.0113 флор-, что является совершенно другим корнем.

Определения флуоресцентных

1. прилагательное

   испускание света при воздействии излучения внешнего источника

   Синонимы:

   свет

   характеризующиеся или излучающие свет

2. прилагательное

   ярко окрашенные и явно излучающие свет

   « флуоресцентный цветов»

   Синонимы:

   красочный, красочный

   яркий цвет

3. существительное

   светильник с люминесцентной лампой

   синонимы: люминесцентный светильник

ОТКАЗ ОТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ: Эти примеры предложений появляются в различных источниках новостей и книгах, чтобы отразить использование слова «флуоресцентный» .