Микроскоп в медицине: Использование микроскопа в медицине для биохимических исследований: виды, назначение, описание

Использование микроскопа в медицине для биохимических исследований: виды, назначение, описание

Развитие микроскопирования открыло новые горизонты для многих отраслей науки и техники, медицина также не стала исключением. Сейчас довольно трудно представить диагностические и лабораторные мероприятия, проведенные без применения микроскопа. Наиболее часто используют в медицинской практике такие врачи, как стоматологи, нейрохирурги, офтальмологи.

Использование микроскопа в медицине не только облегчает и делает работу докторов комфортной, но и открывает совершенно новые горизонты и перспективы для диагностики, как консервативного, так и оперативного лечения.

Что это означает?

Оперативное лечение на более мелком, микроскопическом уровне, дает возможность проводить малоинвазивные оперативные вмешательства, которые имеют максимум плюсов, и минимум осложнений. Медицинские исследования с использованием микроскопов помогают выявить и предупредить опасные инфекции и вирусные заболеваний человека.

И все эти преимущества стали возможными благодаря применению современного оптического инструмента – микроскопа.

Микроскоп медицинский: классификация

Микроскоп медицинский: классификация различных моделей встречающихся в лабораториях и учреждениях:

1. Оптические приборы – универсальные по своему предназначению, позволяющие проводить многочисленные виды микроскопирования.
2. Электронные модели – характеризуются высоким показателем увеличения.
3. Цифровые устройства – кроме повышенной мощности отличаются наличием экрана, который заменяет окуляр.
4. Оптико-цифровые аппараты – включают в себя функции двух видов микроскопов.

Микроскопы для медицинских исследований предназначены, прежде всего, для оценки мельчайших структур на уровне клетки. С такой информацией специалист окажет правильную помощь с наименьшими рисками для здоровья пациента.

Медицинские микроскопы разделяются по своему предназначению:

• Микроскопы лабораторные, например, микроскопы медицинские для биохимических исследований;
• Стоматологические микроскопы;
• Хирургические микроскопы;
• Офтальмологическая аппаратура;
• Оториноларингологические микроскопы.

Микроскопические системы для лабораторных исследований, например, для проведения биохимических, цитологических, гистологических и иных исследований имеют кардинальные отличия от микроскопов медицинского назначения. Тонкая организация такого оборудования может творить буквально чудеса по сравнению со временем без современного оптического оборудования. Одним из наиболее высокотехнологичных микроскопов считается офтальмологический микроскоп. С его помощью врачи проводят оперативные вмешательства на клеточном, микронном уровне, благодаря чему стали возможными высокоэффективные и в тоже время щадящие операции по поводу катаракты, близорукости и дальнозоркости. Благодаря 40-кратному увеличению у медиков есть возможность выполнять ювелирную работу на человеческих глазах. Помимо высокой эффективности такой оперативной техники время восстановления и реабилитации значительно сокращается по сравнению с обычными оперативными вмешательствами.

Стоматологические микроскопы имеют свои технологические характеристики, а их увеличение в среднем составляет около 25 крат. Без данного оборудования стоматологам было бы просто невозможно проводить прицельную терапию зубных каналов, что в принципе невозможно сделать без применения такого оптического инструментария. Стоматологические микроскопы не только позволяют качественно выполнить лечение и реставрацию зубов, но и сохранить их, не проводя удаление.

Микроскоп в медицине, которые используются в хирургической практике, имеют некоторые отличия от всего остального оптического оборудования, используемого в стоматологической либо офтальмологической, лабораторной практике. Такие приборы имеют расширенное поле зрения для более масштабной визуализации операционного поля, имеют увеличенную яркость и резкость. Также нюансом такого вида оборудования является то, что такие микроскоп имеют возможность плавного изменения увеличения для комфортной работы хирурга.

Новое поколение оптического оборудования, предназначенного для медицинской деятельности, весьма просты в эксплуатации и не требуют какой-либо дополнительной подготовки врачей для работы с ними. Анатомические формы окуляра с возможностью изменения межзрачкового расстояния, встроенная осветительная система – все это дает возможность комфортно работать врачам на данном оборудовании даже длительное время.

Виды медицинских микроскопов и их предназначение в медицине

фото с сайта scop-pro.fr

Технология микроскопирования открыла новые возможности в медицинской и лабораторной практике. Сегодня без специальной оптики не обходятся ни диагностические исследования, ни оперативные вмешательства. Наиболее значима роль микроскопов в стоматологии, офтальмологии, микрохирургии. Речь идёт не просто об улучшении видимости и облегчении работы, а о принципиально новом подходе к проведению исследований и операций.

Воздействие на тонкие структуры на клеточном уровне означает, что пациент легче перенесёт вмешательство, быстрее восстановится, не подвергнется повреждению здоровых тканей и осложнениям. За всеми этими преимуществами современной медицины нередко стоит микроскоп — мощное высокотехнологичное устройство, сконструированное с применением последних достижений оптики.

В зависимости от предназначения микроскопы подразделяются на:

• лабораторные;
• стоматологические;
• хирургические;
• офтальмологические;
• отоларингологические.

Оптические системы для проведения биохимических, гематологических, дерматологических, цитологических исследований функционально отличаются от медицинских. Самыми совершенными и мощными признаны офтальмологические микроскопы — с их помощью удалось совершить радикальный прорыв в лечении катаракты, дальнозоркости, близорукости, астигматизма. Операции на микронном уровне, проводимые под 40-кратным увеличением, по инвазивности сопоставимы с уколом, пациент восстанавливается после операции за считанные дни.

Не менее интересны стоматологические микроскопы, позволяющие под 25 кратным увеличением прицельно лечить зубные каналы и другие мельчайшие структуры, не различимые человеческим глазом. Применяя новейшую оптику, стоматологам почти всегда удаётся провести качественное лечение и сохранить зуб.

Увеличительные приборы для микрохирургии отличаются расширенным полем зрения, повышенной резкостью изображения, возможностью плавной или ступенчатой регулировки увеличения. Всё это обеспечивает наилучшие условия видимости для хирурга и ассистентов.

Важно, что новое поколение приборов для микроскопирования максимально удобно в применении: работа с увеличительной оптикой проста и не требует больших усилий или специальных навыков. За счёт встроенной системы освещения и удобной формы окуляра специалист не испытывает усталости и дискомфорта даже при долгой непрерывной работе.

Микроскоп — достаточно хрупкий прибор, требующий бережного отношения. Особенно это касается линз: к оптическим поверхностям нежелательно прикасаться руками, для чистки устройства используют специальную кисточку и мягкие салфетки, смоченные в этиловом спирте.

В помещениях, где находятся микроскопы, должна поддерживаться комнатная температура и низкая влажность (менее 60%).

Использование микроскопа в медицине — Медицинское оборудование, медтехника, медицинский инструмент, медицинские услуги, ремонт медицинской техники, техническое обслуживание

03 декабря 2018

Открытие микроскопа подарило миру новые, практически безграничные возможности в лабораторной и медицинской практике. Все существующие виды диагностического исследования и даже оперативное вмешательство проводится при помощи специальной медтехники, в том числе

медицинского микроскопа. Прибор активно используется в различных отраслях медицины. Большинство экспертов считают использование микроскопа – прорывов в лечении различных офтальмологических и хирургических заболеваний.

Преимущества микроскопического оборудования

Современные микроскопы обладают следующими достоинствами:

• многократное увеличение зоны;
• высокая резкость изображения;
• простое управление;
• наличие регулировки увеличения;
• наличие встроенной системы освещения;
• удобная для использования форма окуляра.

При помощи медицинского микроскопа специалист имеет возможность воздействовать на самые мельчайшие структуры на клеточном уровне не травмируя здоровые ткани. Такое лечение является максимально щадящим для пациента, помогает ему значительно быстрее реабилитироваться.

Сегодня, микроскопическое оборудование применяется в следующих отраслях медицины: хирургия, офтальмология, лечение зубов, ЛОР-заболевания, при различных лабораторных исследованиях. Каждый прибор имеет свои специфические особенности.

К самым мощным и функциональным микроскопическим приборам относят офтальмологические. Они позволяют увеличить обследуемую область до 40 раз. С их помощью удается лечить такие сложные заболевания глаза как катаракта или дальнозоркость. Такие вмешательства сравнимы лишь с уколом Организм человека восстанавливает гораздо быстрее, а риск развития осложнений – минимален.

Стоматологические микроскопы способны увеличить обследуемую зону до 25 раз, что позволяет эффективно проводить лечение зубных патологий, которые невооруженным глазом не рассмотреть.

Расширенное поле зрение, высокий уровень резкости картинки, а также возможность плавной регулировки увеличения – основные характеристики современных микрохирургических оптических приборов. Мощное оптическое оборудование обеспечивает наилучшие условия видимости для врача.

Отличительная особенность медицинских микроскопов – повышенная хрупкость. Прибор должен использоваться с особой осторожностью, в том числе недопустимо трогать линзы руками или чистить обычными салфетками или ветошью. Хранение должно проводится в сухих помещениях с влажностью не более 60%, и температурой – 18-200 С.

← другие новости

Медицинские микроскопы | altami.ru

Медицинские микроскопы используются в различных медицинских учреждениях для исследований биологических материалов при проведении лабораторных анализов и диагностики (гематология, цитология, дерматология и др.). Приборы помогают получить микроскопическую картину препаратов, анализируя которую специалисты ставят диагнозы и назначают лечение. При помощи специальных, операционных, микроскопов также проводят операции в таких областях медицины, как стоматология, офтальмология, оториноларингология, гинекология и нейрохирургия.

Самыми распространенными в медицине являются оптические микроскопы: полученные с помощью них изображения отличаются высоким качеством и четкостью даже при больших увеличениях. В отдельных областях медицины используются поляризационные, стереоскопические, люминесцентные оптические микроскопы, но чаще всего, а именно для лабораторных медицинских исследований прозрачных и полупрозрачных объектов в проходящем свете плоского поля, применяются биологические микроскопы. Реализуемые при этом методы контрастирования (за счет конденсоров для исследований по методу светлого и темного поля, наборов для работы по методу фазового контраста и поляризации) помогают улучшить процесс наблюдения и добиться самых точных результатов исследования.

Медицинские микроскопы «Альтами», как и любое другое медицинское оборудование, имеют Регистрационное удостоверение Министерства Здравоохранения Российской Федерации, подтверждающее факт регистрации микроскопов на территории РФ и внесения их в базу данных зарегистрированных изделий медицинского назначения. Из монокулярных (с одним окуляром) биологических микроскопов использоваться в медицине может Альтами 104.

Бинокулярные биологические медицинские микроскопы представлены моделями Альтами БИО 1 и Альтами БИО 2, Альтами БИО 6 и Альтами БИО 8. Они создают изображение исследуемого объекта и идеально подходят для длительной работы с прибором, обеспечивая комфорт и удобство для зрения исследователя.

 

Микроскопы с тринокулярной насадкой, такие как Альтами БИО 1 (Трино) и Альтами БИО 2 (Трино), Альтами БИО 6 (Трино) и Альтами БИО 8 (Трино), позволяют получать изображения с очень качественной цветопередачей и наблюдать исследуемый объект как визуально, так и при выводе изображения на экран монитора. С помощью тринокулярной насадки изображение также можно фотографировать.

Помимо оптических, в медицине все чаще используют цифровые биологические микроскопы (как например, Альтами БИО 1, Альтами БИО 2). Микроскоп, укомплектованный цифровой камерой со специальным адаптером и программным обеспечением для захвата и обработки изображения, расширяет возможности обычного прибора и позволяет получать качественные яркие снимки исследуемых объектов. Изображение, полученное в этом случае с микроскопа, можно выводить на экран монитора, анализировать, проводить измерения с помощью инструментов программы и редактировать.

Методы световой микроскопии — biocommerce.ru

Световая, или оптическая, микроскопия — это один из основных методов исследования частиц, неразличимых человеческим глазом. Данный метод имеет широкое распространение в медицине, фармакологии, биологии, металлографии, криминалистике и других сферах.

Увеличение изображения в световом микроскопе обеспечивается системой собирательных линз, расположенных в окуляре и объективе.

Световой микроскоп — оптический прибор, позволяющий рассмотреть мелкие детали.

Метод световой микроскопии

Предельная разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм. Это понятие отражает минимальное расстояние, на котором 2 соседние точки определяются как отдельные объекты. Микрочастицы, клеточные структуры и дефекты поверхности имеют размер менее 100 мкм, поэтому для их исследования требуется специальное оборудование.

Историческая справка

Первые оптические микроскопы были изобретены в XVI-XVII вв. Первым, кто заметил увеличительный эффект комбинации из нескольких линз, был венецианский врач Джироламо Фракасторо. В 1609 г. Галилео Галилей представил собственный вариант прибора с 2 стеклами: выпуклым и вогнутым. Первое устройство называлось оккиолино (occhiolino).

Через 10 лет после этого голландский ученый Корнелиус Дреббель усовершенствовал конструкцию, использовав для объектива 2 выпуклые линзы.

Практическое применение микроскопа началось с конца XVII в., когда Антони Ван Левенгук использовал собственное оптическое устройство для исследования биологических структур. Его микроскоп содержал всего одно мощное стекло, что уменьшало количество дефектов картинки.

Приборы Левенгука позволяли увеличить изображение в 275 раз и рассмотреть строение бактерий, дрожжей, эритроцитов, одноклеточных микроорганизмов и насекомых.

Популяризации микроскопии способствовала и книга английского исследователя Роберта Гука, которая вышла в 1664 г. В ней ученый ввел термин «клетка» и опубликовал гравюры некоторых микрообъектов.

Методы микроскопии выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

В течение следующих столетий конструкция оптического микроскопа непрерывно совершенствовалась. Несмотря на то, что в первой половине XX в. были изобретены электронные приборы, которые позволяли рассмотреть нанообъекты, световой метод не теряет своей популярности. В 2006 г. группа немецких ученых разработала оптическое устройство под названием наноскоп, которое обладает разрешающей способностью 10 нм.

Подробно о принципе действия

Принцип работы оптического микроскопа основывается на прохождении прямого или отраженного луча света через систему линз.

Объектив прибора содержит до 14 стекол. При прохождении светового пучка через эту часть устройства изображение увеличивается до 100 раз, а при прохождении окуляра — в 20-24 раза. Выпуклые и вогнутые стекла позволяют сфокусировать картинку на сетчатке или приспособлениях для документирования информации.

Видимое излучение, которое создает осветительная система прибора, ограничивают несколькими диафрагмами. Это повышает четкость изображения.

Увеличивающие линзы имеют 2 дефекта. Сферическая аберрация мешает фокусировать сразу все поле исследования, а хроническая приводит к появлению яркой каймы по контуру изображения. Чтобы компенсировать дефекты, окуляр и объектив оснащаются корригирующими стеклами.

Где применяется

Методы световой микроскопии применяют в следующих областях науки и промышленности:

• медицине и лабораторной диагностике;
• биологии;
• металлографии, неразрушающих методах контроля на производстве;
• микроэлектронике;
• минералогии, кристаллографии;
• археологии, геологии;
• криминалистике;
• пищевой промышленности;
• ювелирном деле и др.

Световая микроскопия применяется в медицине и биологии.

В целом об устройстве светового микроскопа

Оптический микроскоп состоит из следующих элементов:

• штатива;
• тубуса;
• окуляра;
• объектива;
• призмы;
• источника света;
• конденсора;
• апертурной и полевой диафрагм;
• фокусировочного механизма;
• светофильтра;
• зеркала;
• предметного столика.

Устройство светового микроскопа.

Некоторые модели прибора оборудованы дополнительными объективами, системами записи и передачи информации.

Виды световых микроскопов с описанием

Особенности конструкции зависят от предназначения микроскопа. Для увеличения четкости изображения используют методы флуоресценции, люминесценции, инверсии и др.

Биологическое оборудование

Биологические приборы позволяют исследовать прозрачные или полупрозрачные объекты. Принцип их работы основан на изучении светлого поля в потоке проходящего света. Такие микроскопы применяют в лабораторной диагностике, ботанике, цитологии, микроэлектронике, археологии и пищевой промышленности.

Биологическое оборудование позволяет исследовать прозрачные объекты.

Для повышения разрешающей способности используют иммерсионные оптические системы. В этом случае между образцом и первым стеклом вводится жидкость с высоким коэффициентом преломления (минеральное масло, раствор глицерина, дистиллированная вода и др.).

Криминалистическое оборудование

Главная особенность криминалистического микроскопа — это возможность сравнения 2 объектов. Такое исследование помогает найти сходство между компонентами взрывных устройств, гильзами, пулями, волосами, волокнами и другими уликами.

Приборы для криминалистики оснащают фото- и видеокамерами, а также программным обеспечением.

Это позволяет снизить вероятность ошибок, построить модели объектов и сравнить с данными из электронных источников.

Флуоресцентные микроскопы

Флуоресцентные, или люминесцентные, микроскопы позволяют исследовать объекты, которые испускают световой поток после облучения ультрафиолетом. Они оборудованы коротковолновым источником освещения, светофильтрами и интерференционной пластинкой.

Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки.

Флуоресцентные микроскопы активно применяют в лабораторной диагностике, в частности, при изучении клеток крови и антигенов. Для анализа предметов, которые не излучают свет, используют люминесцентные красители и порошки.

Поляризационные микроскопы

Поляризационный прибор является наиболее сложным из всех представленных видов микроскопов. Его используют для исследования анизотропных материалов, полимеров, некоторых клеток и микробиологических объектов.

Источник света со специальными фильтрами формирует поляризованный поток, который облучает образец.

Оптическая система интерпретирует двойное лучепреломление среды и позволяет изучить ее структуру.

Инвертированные с перевернутым положением объектива

В инвертированном микроскопе объектив располагается не над образцом, а под предметным столиком. Такие приборы применяют в биологии, медицине, промышленности, металлографии, криминалистике и других сферах.

Инвертированный микроскоп имеет особенную конструкцию.

Перевернутое положение оптической системы позволяет изучать более крупные образцы и работать со специальной посудой.

Микроскопы для металлографии

Металлографические микроскопы предназначены для исследования поверхности непрозрачных объектов. Изображение получают путем преломления отраженного светового луча.

Предметом изучения являются микродефекты поверхности и зерна сплавов. Помимо металлургии и промышленности, такие устройства применяют в геологии и археологии. Для обеспечения четкости используют специальные системы линз и зеркал.

Стереомикроскопы (дают объемное изображение)

Стереомикроскопы оснащены 2 объективами, что позволяет получать объемное изображение исследуемого образца. По сравнению с устройствами плоского поля они дают более резкую, четкую и контрастную картинку.

Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение.

Такие приборы используют в точном машиностроении, ювелирном деле и других областях промышленности.

Моновидеомикроскопы с возможностью получения видео

Видеомикроскопы предназначены для динамического наблюдения за образцом и фиксации изображения. Для повышения эффективности работы их оснащают специальными линзами, светофильтрами и адаптерами.

Разновидности методов световой микроскопии

Выбор метода оптической микроскопии определяется особенностями объектов и целью исследования.

Светлое поле в потоке проходящего света

Данный метод основан на принципе прохождения потока света через образец. Предмет частично поглощает и рассеивает попадающие на него лучи, что позволяет сформировать изображение.

Светлое поле в потоке — метод, который построен на принципе прохождения света.

Светлопольную микроскопию применяют для изучения окрашенных тканей животных и растений, тонких шлифов и др. Для прохождения светового пучка препарат должен быть прозрачным.

Косое освещение

Данный метод является разновидностью микроскопии светлого поля. Чтобы выявить рельеф и сделать изображение более контрастным, поток направляют под большим углом к образцу.

Светлое поле в отраженном свете

Светопольная микроскопия в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов (сплавов, покрытий, руд и др.). Свет падает на образец сверху, а основная оптическая система исполняет роль объектива и конденсора.

Светлое поле в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов.

Изображение формируется за счет того, что элементы поверхности по-разному отражают и рассеивают попадающие лучи. Травление дает возможность изучить не только дефекты, но и микроструктуру и фазовый состав образца.

Темное поле

Метод темного поля предназначен для изучения прозрачных образцов, которые не абсорбируют свет. Специальный конденсор направляет лучи так, что они формируют полый конус, в центре которого находится объектив. Таким образом, большая часть лучей не попадает в оптическую систему.

Изображение представляет собой темное поле с небольшими светлыми включениями, которые формируются за счет рассеяния света частицами препарата.

Ультрамикроскопия

Метод ультрамикроскопии является разновидностью темнопольного. Для исследования образцов используют сильные источники света, а лучи направляют перпендикулярно предметному столу. Эффект рассеяния волн позволяет обнаружить частицы менее 10 нм.

Ультрамикроскопия — метод наблюдения и анализа коллоидных частиц.

Фазовое контрастирование

Метод фазового контраста позволяет изучать прозрачные и неокрашенные образцы. При малом различии в коэффициенте преломления изображение нельзя получить ни на светлопольном, ни на темнопольном микроскопе, поскольку разница в поглощении и рассеянии света будет минимальной.

Однако при прохождении через образец волна приобретает фазовый рельеф, который фиксируется специальным объективом. В изображении он отображается как различие в яркости элементов.

Аноптральный контраст

Данная методика является подвидом фазовой микроскопии. На иммерсионную линзу наносят кольцо из сажи, которое пропускает 10% лучей и совпадает с контуром кольцевой диафрагмы конденсора. При отсутствии образца амплитуда световых волн уменьшается на 90%.

Проходя через среды разной плотности, лучи дифрагируют, в результате чего их амплитуда остается неизменной.

За счет этого поле исследования получается темным, а частицы образца — светлыми.

Поляризационный метод

Анализ анизотропных материалов проводят в свете, пропущенном через специальную фильтрующую пластинку. При прохождении через образец плоскость поляризации лучей меняется.

По разнице между начальными и конечными характеристиками волн определяют количество оптических осей, их ориентацию и др.

Интерференционная микроскопия

Интерференционный метод основан на параллельном прохождении 2 лучей через предметный столик и мимо него. В окуляре микроскопа когерентные волны соединяются и интерферируют между собой.

При прохождении через образец первый луч запаздывает по фазе, что влияет на результирующую амплитуду и яркость изображения.

Люминесценция или флуоресценция

Принцип люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые образцы испускают видимый свет после облучения ультрафиолетом. Перед исследованием препараты обрабатывают флуоресцирующими антисыворотками, порошками или маркерами.

Волны ультрафиолетового спектра применяют для повышения разрешающей способности микроскопа. Для изучения препаратов, которые не испускают видимый свет после воздействия УФ-лучей, используют фотокамеры и кварцевые линзы.

12 методов в картинках: микроскопия

Один из старейших научных приборов — микроскоп — появился практически одновременно с наукой в ее современном виде. Этот канонический инструмент биолога более 400 лет был важнейшим средством для познания живого, и дал львиную долю наших знаний об устройстве жизни. Все это время эволюция микроскопа продолжалась, расширяя возможности увидеть неразличимое глазом.

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

История микроскопии

На пороге микромира

Собирающие (увеличивающие) линзы были известны с XI века, и очки распространились по Европе уже в XIV веке. Традиционно изобретение первого составного микроскопа приписывают отцу и сыну — Хансу и Захарию Янсенам в 1595 году (рис. 1). Этот первый микроскоп мог увеличивать изображение всего в 3–9 раз. Есть версия, что первый микроскоп создал Корнелиус Дреббель. Среди изобретателей первых микроскопов был и Галилей, создавший свой микроскоп в 1609 году. Так или иначе, ни один из изобретателей не оставил подробных описаний микромира. Микроскопия как наука началась с Роберта Гука, который в 1665 году издал Micrographia — книгу, в которой подробно описывались устройство микроскопа, основы оптики и первые наблюдения за биологическими объектами, иллюстрированные подробными рисунками [1]. Микроскоп Гука (рис. 2) состоял из трех линз и источника света — эта основа сохраняется и в современной микроскопии. Однако достичь больших увеличений удалось с помощью более простой конструкции — Антони ван Левенгук использовал, казалось бы, примитивный микроскоп всего с одной линзой (рис. 2). Однако благодаря высочайшему качеству этой линзы ему удалось достичь 200-кратного увеличения и описать клетки простейших и даже крупные бактерии. Использование всего одной линзы не создавало оптических аберраций, которые только множились при конструировании более сложной оптической системы.

Генеральный партнер цикла «12 методов» — компания «Диаэм»

«Диаэм» — крупнейшая российская компания, специализирующаяся на поставке оборудования и реагентов ведущих мировых производителей в области микроскопии: от микроскопов начального уровня до исследовательских, конфокальных и мультифотонных систем, а также автоматизированных биоимиджинговых систем, способных поддерживать жизнеспособность клеток при постановке длительных экспериментов.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Рисунок 1. Микроскопия: этапы большого пути. 1590 г. — Захарий и Ханс Янсены создают первый микроскоп. 1665 г. — первое издание книги Роберта Гука Micrographia: описание и иллюстрации первых микроскопических исследований. 1674 г. — Антони ван Левенгук с помощью своего микроскопа описывает инфузории, а в дальнейшем — бактерии, сперматозоиды, вакуоли внутри клетки и т.п. 1858 г. — Йозеф фон Герлах разрабатывает окрашивание кармином — одной из первых гистологических красок. 1878 г. — Эрнст Аббе выводит формулу Аббе, позволяющую вычислить максимальное разрешение, исходя из длины волны. 1911 г. — Оскар Хеймштадт изобретает первый флуоресцентный микроскоп. 1929 г. — Филипп Эллингер и Август Хирт конструируют эпифлуоресцентный микроскоп, в котором эффективно отфильтровывалось излучение от источника света. 1932 г. — Фриц Цернике изобретает фазовый контраст, позволяя рассматривать живые неокрашенные объекты с большим контрастом. 1933 г. — Эрнст Руска совместно с Максом Кноллем создает первый электронный микроскоп. В 1939 году с его помощью выпустили первый коммерческий электронный микроскоп. 1934 г. — Джон Маррак получает первый конъюгат антитела с красителем. Первое практическое использование Альбертом Кунсом, усовершенствовавшим технику конъюгацией с флуоресцентной меткой. 1942 г. — Эрнст Руска создает сканирующий электронный микроскоп. 1962 г. — первое описание GFP Осамой Симомурой. 1967 г. — первое использование конфокальной микроскопии Моймиром Петраном, Дэвидом Эггером и Робертом Галамбосом. 1969 и 1971 гг. — первое описание конфокальной лазерной микроскопии. 1981 г. — Герд Бинниг и Генрих Рорер создают первый сканирующий туннельный микроскоп. 1986 г. — Герд Бинниг, Келвин Куэйт и Кристофер Гербер изобретают атомно-силовую микроскопию. 1990 г. — Винфрид Денки и Джеймс Стиклер разрабатывают первый двухфотонный микроскоп. 1994 г. — Штефан Хелл: суперразрешающая электронная микроскопия на основе подавления спонтанного испускания (STED). 2006 г. — изобретение PALM/STROM-микроскопии. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Рисунок 2а. Первые «ласточки». Микроскоп Гука (реконструкция).

Рисунок 2б. Первые «ласточки». Микроскоп Левенгука.

Улучшение оптики и преодоление аберраций

Оптические артефакты — аберрации — не позволяли рассматривать мелкие объекты, даже когда удавалось достичь больших увеличений. В XVIII веке некоторые мастера-оптики смогли устранить хроматические и сферические аберрации с помощью сложных оптических систем, состоящих из собирающей и рассеивающей линз из разного типа стекол с разными показателями преломления. Ахроматические линзы (то есть линзы, устраняющие хроматические аберрации) изобрел Честер Мур Халл в 1733 году. Первые ахроматические объективы для микроскопов создал Бенджамин Мартин (около 1775 г.) и значительно улучшил Йозеф Фраунгофер. Отец известного хирурга и отца антисептики Джозефа Листера — Джозеф Джексон Листер — обнаружил, что сочетание нескольких ахроматических линз позволяет исправить не только хроматические, но и сферические аберрации (1826 г.). Правда, несмотря на совершенство оптики, повышать увеличение до бесконечности нельзя: причиной тому дифракционный предел, о котором пойдет речь ниже.

Гистология

Рисунок 3. Гистология — дело тонкое: микротом нарезает препарат на слои, прозрачные для микроскопа.

Развитие оптики в XVIII веке позволяло исследовать микромир на больших увеличениях, однако исследование тканей и клеток было сопряжено со множеством трудностей — они же в основном не окрашены, малоконтрастны и быстро умирают вне организма. Очередной прорыв в микроскопии пришел со стороны химии. В XIX веке открыли огромное количество красителей, и биологи пробовали окрашивать ими объекты своих исследований. Одновременно изобрели микротом (рис. 3) — прибор для нарезания тонких срезов тканей определенной толщины. Для стабилизации структуры ткани выдерживали в растворах фиксаторов (например, формалина), после чего препараты хранились долгое время. Для удобства нарезания заформалиненные куски органов заключали в парафин, блоки которого удобно резать.

Ряд классических гистологических красителей, изобретенных в 19-м веке и начале 20-го, используется до сих пор: фиолетовый гематоксилин окрашивает ядра, розовый эозин — цитоплазму клеток, краситель Перлса — двухвалентное железо, реактив Шиффа — полисахариды, краситель Судан III выявляет жиры техникой Дадди, а нитрат серебра — клетки Пуркинье на срезах мозга по методу Рамон-и-Кахаля. Изобретение различных техник позволило описать тонкие структуры каждого органа, выявить входящие в них ткани и даже рассмотреть структуру клеток — ядро (с митотическими хромосомами), ядрышки и митохондрии. Микроскопические исследования того времени, хотя и были в большей степени описательными, сформировали базовые теории клеточной биологии, нейробиологии и иммунологии [2].

Математический аппарат

Дальнейшие улучшения в оптике сопровождались разработкой математического аппарата для ее описания. Джордж Биддель Эйри описал диск Эйри — дифракционный рисунок, образующийся в идеальной оптической линзе с круговой апертурой. Дифракция света ограничивает минимально возможное разрешение между двумя источниками света, и, соответственно, разрешение в оптической системе (то есть минимальное расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки). Эрнст Аббе предложил формулу дифракционного предела в 1873 году [3]. Формула определяет предельное разрешение как:

r = λ/2NA,

где λ — длина волны источника света (от 390 до 700 нм), а NA — числовая апертура объектива, определяемая как:

NA = n×sin(θ),

где n — индекс преломления среды между объективом и препаратом, а θ — апертурный угол между крайними лучами конического светового пучка, попадающего в объектив.

Из формулы видно, что разрешение тем выше (то есть значение r меньше), чем меньше длина волны (синий свет предпочтителен красному) и чем больше числовая апертура и индекс преломления среды. Поэтому для увеличения разрешения микроскопа используют масляные объективы, когда между препаратом и объективом добавляется иммерсионное масло с высоким показателем преломления. Более строгим является критерий Рэлея, в котором предел разрешения определяется как:

R=0,61×λ/NA

Разница с пределом Аббе вызвана отличием в том, как два оптика определяли разрешение между двумя точками (критерий Рэлея строже).

Устройство микроскопа

Рисунок 4. Под увеличительным стеклом: принципиальное устройство микроскопа. Оптический микроскоп создает огромные увеличения с помощью увеличивающих линз объектива и окуляра. Промежуточные линзы устраняют аберрации, а яркий источник света позволяет рассмотреть препарат даже при больших увеличениях.

Принципиальное устройство светового микроскопа мало менялось со времен Аббе, и основные улучшения касались уменьшения аберраций за счет усложнения состава и количества линз. Оптический микроскоп состоит из источника света, объектива и окуляров. Препарат, освещенный светом лампы, должен находиться немного дальше фокуса объектива, что создает увеличенное изображение, которое усиливается и проецируется линзой окуляра и хрусталиком глаза на сетчатку (или на матрицу камеры). В микроскопах с «бесконечной» оптикой (не ограниченной определенной длиной тубуса) препарат находится в фокусе объектива, и для построения промежуточного изображения необходима дополнительная тубулярная линза. В современных микроскопах каждый из этих компонентов включает в себя большое количество сложных линз для коррекции хроматических и сферических аберраций, а также диафрагмы, позволяющие регулировать размер поля зрения и интенсивность света. Исследовательские микроскопы оснащены несколькими объективами с разным увеличением (от 2,5—4× до 100×), которые имеют одинаковую фокусную длину и могут свободно меняться с помощью револьверной насадки. Таким образом можно найти интересный участок препарата, используя небольшое увеличение, позволяющее рассмотреть широкое поле зрение, и затем разглядеть подробности, сменив объектив на более мощный.

Рисунок 5а. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Эластичный хрящ уха (окраска: гематоксилин-эозин).

Рисунок 5б. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Срез придатка яичка (окраска: гематоксилин-эозин).

Рисунок 5в. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Толстая кишка крысы (пентахромная окраска по Мовату).

Линза окуляра дополнительно увеличивают промежуточное изображение в 10–25 раз, создавая огромные увеличения. Световая микроскопия позволяет хорошо рассмотреть тонкие препараты (например, срезы ткани или клетки, растущие на стекле), окрашенные цветными красителями (например, антителами с цветной меткой или гистологическими красителями) (рис. 5). Окраска препарата требует его химической фиксации, что не подходит для наблюдения за живыми объектами, а поэтому в большинстве современных микроскопов вводят дополнительные элементы, позволяющие наблюдать микроскопические объекты без фиксации — с помощью методов фазового контраста и его модификаций.

Фазовый контраст, видеомикроскопия и клеточные культуры

В то время как световая микроскопия подошла к своему физическому пределу, возникло два новых типа микроскопии, значительно расширяющих возможности метода. Одной из таких модификаций стал фазовый контраст.

Статичность классической гистологии не позволяла наблюдать процессы, происходящие в клетках, в реальном времени. Уже в 19 веке начались первые попытки наблюдать за тканями вне организма. Используя растворы соли и кровь или сыворотку животных, исследователи могли некоторое время поддерживать ткани в живом состоянии вне организма. В 1907 году Росс Гаррисон наблюдал развитие нервных волокон в течение недели. Использование асептических условий, протеолитических ферментов и культуральных сред позволяло выращивать отдельные клетки в течение долгого времени, проводить с ними эксперименты и, конечно, наблюдать с помощью микроскопа. В том же 1907 году Джулиус Риес снял первый микроскопический фильм — развитие эмбриона морского ежа (рис. 6) [4]. В 1913 и 1914 годах Жан Командон и Жустин Жолли снимали деление клеток в клеточной культуре. Изобретение фазового контраста Фрицем Цернике в 1941 году позволило наблюдать неокрашенные биологические объекты — прежде всего живые клетки в культуре. Фазовый контраст и его вариация — дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (оптика Номарского) — стали основой как для рутинного наблюдения за клеточной культурой, так и для изучения клеточной подвижности и динамики движения органелл.

Рисунок 6. Снято! Раскадровка первого микроскопического фильма: развитие эмбриона морского ежа.

Рисунок 7. Фазовый контраст — микроскопия контрастов. Использование интерференции позволяет увеличить контрастность и изучать неокрашенные препараты. Свет, не провзаимодействовавший с препаратом, попадает на фазовую пластинку, которая смещает его на +1/4 длины волны, в то время как биологические объекты рассеивают свет так, что он не попадает на фазовую пластинку, и смещают его фазу на −1/4 длины волны. Получающаяся разница в 1/2 длины волны в тех местах, где свет проходит через препарат, приводит к тому, что в этих местах волны прямого и дифрагированного света взаимно гасят друг друга, создавая темные, контрастные области на изображении.

Фазовый контраст основан на интерференции волн света — две световых волны, фазы колебаний которых совпадают, усиливаются, в то время как при отличии фазы на 1/2 длины волны происходит полное гашение. Проходя через материал с большим индексом отражения, свет замедляется, что приводит к смещению его фазы. Это и используется в методе фазового контраста для увеличения контрастности изображения (рис. 7). В оптический путь световой микроскопии вводятся два дополнительных элемента — обычный объектив заменяется на объектив с фазовой пластинкой, а в конденсор осветителя добавляется кольцевая диафрагма, в которой свет может пройти только через тонкое кольцо.

Кольцевая диафрагма блокирует бóльшую часть света, оставляя только полый конус света, сконцентрированный конденсором на препарате. Свет, не рассеянный и отраженный препаратом, точно попадает на фазовую пластинку объектива — напыленное полупрозрачное кольцо, которое смещает фазу света на +1/4 длины волны. Свет же, прошедший через биологические объекты, рассеивается и отражается, отклоняясь от оптического пути и не попадая на фазовое кольцо объектива. К тому же биологические объекты сами меняют фазу света за счет разницы в индексе отражения и толщины препарата, чаще всего приблизительно на −1/4 длины волны. Таким образом, между рассеянным препаратом светом и светом, не провзаимодействовавшим с препаратом, создается разница фаз в 1/2 длины волны. Рассеянный свет от препарата и свет, попавший на фазовую пластинку, снова совмещаются, приводя к ослабляющей интерференции, и, соответственно, затемнению мест препарата, отличающихся по толщине и индексу отражения.

Флуоресцентный микроскоп и иммунофлуоресценция

В 1911 году Оскар Хеймштадт разработал первый флуоресцентный микроскоп, в котором мощный источник света возбуждал свечение во флуоресцентных веществах. В 1929 году его конструкцию значительно улучшили Филипп Эллингер и Август Хирт, которые создали микроскоп, где с помощью светофильтров эффективно отсекался возбуждающий свет, что позволяло рассмотреть даже слабую флуоресценцию [5]. В это время биохимики и генетики уже начинали исследовать отдельные белки и гены, но в микроскопии не было инструмента, который бы позволил точно пометить отдельный белок. Таким инструментом удивительным образом оказались антитела — белки, которые иммунная система использует для выявления и нейтрализации возбудителей [6]. Джон Маррак одним из первых связал антибактериальное антитело с красителем (R-солью) и окрасил им бактериальный препарат. Изобретение флуоресцентного микроскопа и связывание антител с яркими флуоресцентными красителями позволило получать ярко окрашенные препараты. Меченые антитела помогали окрасить не только возбудителей болезней — иммунизируя животных с помощью различных белков, стало возможным получать антитела для выявления местоположения и количества этих белков внутри клеток и тканей (рис. 8) [7].

Рисунок 8а. Возможности флуоресцентной микроскопии. Клетки остеосаркомы человека (окраска на митохондрии, ДНК и актин).

Рисунок 8б. Возможности флуоресцентной микроскопии. Клетки бычьего эндотелия BPAEC (окраска на митохондрии, ДНК и актин).

Рисунок 8в. Возможности флуоресцентной микроскопии. Стадии митоза (синий — ДНК, зеленый — веретено деления, красный — центромеры).

Для того чтобы наблюдать за белками вживую, требовалось найти способ прикрепить к ним светящуюся молекулу — флуорофор. Первым таким флоурофором оказался знаменитый зеленый флуоресцентный белок (GFP). Впервые GFP выделил из медузы Aequorea victoria Осаму Симомура в 1962 году [8]. Затем зеленый флуоресцентный белок с помощью генетической инженерии научились вставлять в клетки и включать в состав белков-химер, где его «сшивали» с изучаемым белком (рис. 9). Помимо этого довольно быстро обнаружили белки всех цветов спектра [9], а их свойства усовершенствовали для лучшей флуоресценции и стабильности. За флуоресцентные и генетические технологии, связанные с GPF, в 2008 году вручена Нобелевская премия [10]. Сегодня есть флуоресцентные белки, которые светятся в присутствии определенных молекул (кальция [11], АТФ, глюкозы, глутамата и т.п.), начинают флуоресцировать при связывании двух белков друг с другом, активации определенных клеточных процессов (например, клеточной гибели) или изменении активности транскрипционных факторов.

Рисунок 9. «Да будет свет»: флуоресцентные белки помогают наблюдать процессы в живых клетках. С помощью генетической инженерии ген GFP совмещается с геном белка, за которым мы хотим «установить слежку», и получившийся химерный ген кодирует белок, помеченный с помощью GFP. С помощью этого подхода можно пометить клетки, экспрессирующие нужные нам гены, или наблюдать за биохимическими реакциями и взаимодействиями белков. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Система визуализации ZOE от компании «Диаэм»

Система визуализации ZOE производства Bio-Rad — это настольный компактный флуоресцентный микроскоп для рутинного мониторинга клеточных культур с возможностью детекции флуоресцентных меток! Незаменим в любой лаборатории, где необходимо регулярно наблюдать культуры клеток, очень прост в управлении и не требует регулярной настройки оптики.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Рисунок 10. Флуоресцентный микроскоп: лабиринт отражений. Дихроичное зеркало и объектив фокусируют возбуждающий свет на препарате и направляют флуоресцентный свет к окуляру по другому оптическому пути.

Флуоресцентная микроскопия позволяет получать красочные изображения, светящиеся собственным светом, и в то же время за счет использования светофильтров рассматривать свечение разных цветов отдельно. Так можно изучать распределение нескольких меток, например антител к разным белкам, каждое из которых окрашено своим флуоресцентным красителем. В основе метода лежит Стоксов сдвиг: при возбуждении электрона во флуоресцентном красителе (флуорофоре) источником света, испускаемый фотон обладает большей длиной волны за счет потери части колебательной энергии, что позволяет отфильтровать яркий свет, которым освещают образец для возбуждения, и наблюдать только свет от флуоресцентной метки (рис. 10).

Источник света во флуоресцентном микроскопе — яркая лампа (ртутная или галогеновая). Свет от лампы проходит через светофильтр, который оставляет оптимальные для возбуждения флуоресцентной метки длины волн. Прошедший через светофильтр свет отражается дихроичным зеркалом и фокусируется объективом на образце, возбуждая флуоресценцию метки. Такая схема микроскопа, в которой возбуждающий свет фокусируется не конденсором, а самим объективом, называется эпифлуоресцентной, и позволяет значительно уменьшить фоновую засветку от лампы. Флуоресцентный свет от препарата через объектив вновь попадает на дихроичное зеркало, которое уже прозрачно для смещенной длины волны света от флуоресцентной метки, и на второй светофильтр, который дополнительно отсекает фоновый свет от лампы. Микроскоп содержит несколько комплектов светофильтров и зеркал, которые можно быстро сменить в зависимости от метки, что позволяет снимать даже микроскопические фильмы с несколькими флуоресцентными метками одновременно.

Узнай больше

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Современные микроскопы позволяют изучать препарат всеми вышеописанными методами, быстро заменяя или совмещая компоненты оптического пути, например, фазового контраста и флуоресценции. Быстрое последовательное переключение между флуоресценцией и фазовым контрастом (например, за счет автоматического открытия диафрагмы) позволяет получить обоими методами фотографии одного и того же участка препарата, которые затем можно совместить для получения суммарного изображения. Такой микроскоп дает максимум информации на одном и том же препарате за небольшое время.

Реагенты для флуоресцентной микроскопии от компании Abcam:

• Широкий выбор первичных и вторичных антител.
• Флуоресцентные красители и наборы для конъюгации антител.
• Красители и наборы для ИЦХ- и ИГХ-окраски препаратов тканей и клеток.
• Срок поставки — 2 недели!

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Конфокальная микроскопия

Качество флуоресцентной микроскопии было ограничено из-за возбуждения флуоресценции вне оптического фокуса. Конфокальная микроскопия позволила рассматривать флуоресценцию только в фокусе объектива, и реконструировать трехмерные изображения из послойно снятых фокусных планов. Для этого используют точечный источник света, сканирующий образец, и точечную диафрагму, отсекающую свет вне оптического фокуса [12]. Первую такую конструкцию запатентовал Марвин Мински в 1961 году. Однако первый работающий микроскоп сконструировал в Чехословакии Моймир Петран (рис. 11), который в 1967 году вместе с Дэвидом Эггером и Робертом Галамбосом впервые применил его для изучения биологических образцов. В 1980-х годах в качестве источника света начали применять лазер, и конфокальная микроскопия быстро стала альтернативой обычному флуоресцентному микроскопу.

Рисунок 11. Моймир Петран. Чехословацкий ученый с коллегами создал первый работающий конфокальный микроскоп.

Рисунок 12. Конфокальная микроскопия: через замочную скважину. В конфокальной микроскопии свечение возбуждается лазером, ограниченным точечной диафрагмой. Вторая диафрагма, помещенная после дихроичного зеркала и светофильтра эмиссии в плоскости фокуса объектива (конфокальной плоскости), отсекает свет, находящийся не в фокусе объектива. Передвижение луча лазера по препарату достигается двумя зеркалами, контролируемыми точными гальванометрическими двигателями. Переход между оптическими плоскостями (ось Z) осуществляется с помощью движения объектива вверх или вниз. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия является модификацией флуоресцентной микроскопии, улучшающей качество изображения и позволяющей строить трехмерные реконструкции препарата, а также в некоторых модификациях манипулировать биологическими объектами с помощью лазера. В конфокальной микроскопии, в отличие от флуоресцентной, свечение возбуждается не во всём препарате, а точечно. Перемещение лазера сканирует препарат, подобно тому, как распечатывает изображение принтер.

Соответственно, по сравнению с флуоресцентной микроскопией, в конфокальном варианте появляется несколько новых компонентов (рис. 12): прежде всего это две точечные диафрагмы, отсекающие свет, который находится вне фокуса объектива. Возбуждение света происходит с помощью лазера, сканирующего препарат, а регистрация — чувствительным фотоумножителем. Конфокальный микроскоп позволяет получать тонкие оптические срезы, и так как флуоресценция от препарата вне фокуса не попадает на детектор, то им можно снимать объемные объекты — например, стадии эмбрионального развития (рис. 13). Так как интенсивность лазера можно регулировать, а точечная диафрагма концентрирует свечение в одной точке, конфокальный микроскоп позволяет использовать лазер для точного воздействия на объект исследования. Например, лазером можно выжечь свечение флуоресцентного белка в части клетки и замерить скорость его восстановления в этой области, то есть скорость, с которой происходит диффузия белка. Этот метод называется FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching). С помощью лазера можно повреждать клетку или только ее ядро, или активировать светочувствительные белки, запуская различные клеточные процессы.

Узнай больше

Видеолекции:

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия является модификацией конфокальной микроскопии, позволяющей отказаться от точечных апертур [13]. Возбуждение в таком микроскопе происходит за счет возбуждения флуорофора одновременным попаданием двух фотонов неоптимальной длины волны от мощного лазера. Вероятность такого события падает с квадратом расстояния, поэтому эффективное возбуждение происходит только в месте фокусировки лазера.

Рисунок 13а. Конфокальная микроскопия: не только срезы, но и сравнительно крупные объекты. Периферийные нервы в зародыше мыши.

Рисунок 13б. Конфокальная микроскопия: не только срезы, но и сравнительно крупные объекты. Гиппокампальные нейроны на срезе мозга крысы.

Рисунок 13в. Конфокальная микроскопия: не только срезы, но и сравнительно крупные объекты. Окраска мышиной сетчатки на маркер астроцитов (красный — GFAP) и кровеносные сосуды (зеленый — коллаген IV).

Система визуализации EVOS FL Auto 2 от компании «Диаэм»

Устали проводить много времени, получая и анализируя изображения клеток? Выберите другой путь. Система визуализации EVOS FL Auto 2 (производство Thermo Fisher Scientific) — передовое решение для работы с живыми клетками, получения изображений при разных фокусных расстояниях (Z-stacking) и сшивки изображений, обладающее функцией поддержания жизнеспособности клеточных культур для изучения процессов в динамике.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Электронная микроскопия

Дифракционный предел больше ста лет ограничивал оптическую микроскопию, пока не появились идеи, как его преодолеть. В 1930-х годах создали новую технику, позволяющую рассмотреть внутриклеточные структуры максимально близко: электронную микроскопию. Ее идея состоит в использовании электронов в качестве средства «освещения». Длина волны у электрона на 5 порядков (в 100 000 раз) меньше, чем у фотона, что дает разрешение до 50 пикометров! Электронная микроскопия позволяет рассматривать вирусы и структуру белковых комплексов.

В принципе, устройство электронного микроскопа очень похоже на микроскоп оптический. В качестве источника электронов (осветителя в обычном микроскопе) используется электронная пушка, в которой поток электронов от источника (например, вольфрамовой нити) фокусируется с помощью цилиндрического электрода (цилиндра Венельта). В качестве линз используют электромагнитные катушки, работающие как магнитные линзы. Для того чтобы электроны не задерживались молекулами воздуха, внутри микроскопа создают вакуум.

Рисунок 14. Принцип работы трансмиссионного электронного микроскопа. Электроны от пушки фокусируются магнитными линзами и, проходя через сверхтонкий образец, попадают на флуоресцентный экран.

Рисунок 15. Сканирующий электронный микроскоп позволяет изучать поверхность препарата за счет многих видов отраженного излучения.

В трансмиссионной электронной микроскопии (рис. 14) изучают очень тонкие срезы клеток: препараты вирусов и тому подобные неплотные образцы. Часть электронов рассеивается или поглощается образцом, в то время как прошедшие через образец электроны попадают на флуоресцентный экран, создавая «тень» от образца — где более плотные части образца будут более темными на изображении. Трансмиссионная электронная микроскопия требует предварительной фиксации и обезвоживания препарата, а также его очень тонкой нарезки, и часто для увеличения контрастности препарат необходимо окрасить соединениями тяжелых металлов. Все эти процедуры не дают возможности наблюдать живую клетку и часто искажают изображение препарата. К тому же подготовка препаратов крайне трудоемка по сравнению с оптической микроскопией.

Электронная микроскопия позволяет метить молекулы с помощью антител, используя металлические метки (например, коллоидное золото) вместо флуорофоров, однако количество меток, которое можно использовать, ограничено по сравнению с флуоресцентной микроскопией. Несмотря на то, что именно трансмиссионная электронная микроскопия позволила нам рассмотреть структуру органелл внутри клетки, ее ограничения и дороговизна не позволяют этому методу войти в широкий лабораторный обиход.

Используя пучок электронов, образец можно «сканировать» поточечно (рис. 15), как в конфокальной микроскопии. Такой метод называется сканирующей электронной микроскопией, и в ней обычно регистрируются вторичные электроны, испускаемые образцом при попадании электронного пучка, и электроны, отраженные образцом. Метод сканирующей электронной микроскопии обычно используют для изучения поверхности образца, хотя вариант сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии позволяет изучать тонкие срезы.

Именно сканирующая электронная микроскопия дает потрясающие объемные изображения клеток, бактерий, кристаллов, белковых матриксов и многих других объектов (рис. 16).

Рисунок 16а. Трансмисионная электронная микроскопия. Структура цитоскелета около ведущего края фибробласта.

Рисунок 16б. Сканирующая электронная микроскопия. Макрофаги и эндотелиоциты.

Рисунок 16в. Сканирующая электронная микроскопия. Фрагмент глаза дрозофилы.

Рисунок 16г. Сканирующая электронная микроскопия. Апоптотическая клетка.

Методы суперразрешения

Электронная микроскопия продвинула исследования далеко за предел разрешения оптической микроскопии, однако она не позволяет смотреть на живые объекты и использовать разноцветные метки или красители. Возможно ли преодолеть дифракционный предел в оптической микроскопии? Методы, преодолевающие предел Аббе, называются методами суперразрешения. Мы подробно остановимся на двух таких методах, за которые присудили Нобелевскую премию по химии 2014 года [14].

В 1990-х исследователи начали разрабатывать методы для преодоления дифракционного предела Аббэ. Центральную роль в разработке этих методов играл Штефан Хелль, который разработал STED-микроскопию [14–16]. В методике STED возбуждение флуорофора происходит с помощью двух лазеров — один возбуждает флуоресценцию в точке фокуса, в то время как другой тушит ее вокруг этой точки за счет смещения флуоресценции в более красную область. За достижением Хелля последовало изобретение других суперразрешающих методов — PALM/STORM, GSDIM и других.

Штефан Хелль одним из первых понял, что возможно преодолеть дифракционный предел, используя свойства самих флуорофоров. Идея Хелля состояла в том, что не обязательно ограничивать дифракцию света, который стимулирует флуоресценцию, если можно «запретить» флуоресцировать молекулам вне самого центра фокуса. Для этого он придумал использовать принцип стимулирования испускания: в нем флуорофор в возбужденном состоянии переводится в невозбужденное состояние вторым лазером. За счет использования «более красной» длины волны испускаемый при стимулированном переходе фотон имеет большую длину волны (такую же, как и лазер) и не регистрируется детектором.

Как же можно увидеть изображение, если мы подавили флуоресценцию во всем образце? Дело в форме луча света второго лазера — проходя через специальную фазовую пластинку, он приобретает форму кольца, и интенсивности подавляющего лазера в узкой центральной точке не хватает для подавления флуоресценции. Таким образом, флуоресценция возбуждается только в узкой фокусной точке, которая по размерам гораздо меньше предела дифракции. STED-микроскопия (рис. 17 и 18) позволяет получать изображения с разрешением меньше 20 нм в поперечном направлении, и около 40–50 нм в продольном направлении.

Рисунок 17. Принцип микроскопии суперразрешения. Для STED-микроскопии необходимы два лазера: флуоресценция возбуждается первым зеленым лучом, а второй, красный, лазер подавляет флуоресценцию за счет стимуляции испускания. Из-за фазовой пластинки в середине пути второй лазер имеет форму кольца, поэтому в центре его мощности не хватает для подавления флуоресценции. Таким образом флуоресценция возбуждается только в центре — в узкой фокусной точке, куда попадает свет только от первого лазера и которая по размерам гораздо меньше предела дифракции. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Рисунок 18а. Преимущества микроскопии суперразрешения. а — Ядерная пора («обычная» конфокальная микроскопия vs. STED). б — Цитоскелет («обычная» конфокальная микроскопия vs. STED).

Рисунок 18б. Преимущества микроскопии суперразрешения. STORM-микроскопия.

Другим подходом стало ограничение флуоресценции флуорофоров по времени. В PALM/STORM/FPALM-микроскопии используют специальные флуорофоры (флуоресцентные белки или синтетические флуорофоры), которые могут переключаться между возбужденным и невозбужденным состоянием (см. видео) [17], [18]. Низкочастотный возбуждающий лазер возбуждает лишь часть молекул, так чтобы статистически возбужденные молекулы были разделены расстоянием больше дифракционного предела. Высокочувствительная камера регистрирует флуоресценцию от этих молекул, позволяя точно определить их положение по испускаемым фотонам. Второй лазер подавляет флуоресценцию и возвращает молекулы обратно в невозбужденное состояние. После многократного повторения этого цикла (в каждом цикле случайно возбуждаются разные молекулы флуорофора), компьютер составляет цельную картину из изображений, снятых в отдельных циклах.

Видео. PALM-микроскопия

STED и PALM/STORM являются наиболее распространенными видами суперразрешающей микроскопии, однако существует множество методов на их основе или использующих сходные принципы: SIM, GSD, SSIM, dSTROM и другие — оптическая микроскопия продолжает развиваться, расширяя границы нашего познания о микромире.

Применение в биомедицине

Даже обычные световые микроскопы до сих пор активно используют для постановки диагнозов в медицине. Опухоли, воспалительные процессы, отложения железа или кальция, замещения нормальной ткани соединительной и многое, многое другое рутинно проверяется на препаратах, полученных с помощью биопсии, постоперационно или во время вскрытия. Широкое применение антител проникло и в рутинную диагностику — срезы окрашивают антителами к клеточным маркерам или возбудителям болезней, которые позволяют уточнить или подтвердить диагноз и лучше подобрать лечение. Особенно широкое применение световая микроскопия и иммуногистохимия нашла в онкологии, где присутствие специфических белков определяет применяемую химиотерапию (например, применение герцептина для опухолей с белком HER2 при раке молочной железы). Микроскопия необходима не только для постановки диагнозов, но и в процессе лечения: хирурги применяют микроскопы при операциях, требующих тонкого вмешательства, — в офтальмологии, нейрохирургии, сосудистой хирургии и многих других (рис. 19).

Рисунок 19а. Многообразие микроскопов в медицине. Хирургический микроскоп.

Рисунок 19б. Многообразие микроскопов в медицине. Микроскопическая платформа для высококонтентного скрининга.

Рисунок 19в. Многообразие микроскопов в медицине. Бумажный микроскоп.

Флуоресцентные микроскопы за счет развития флуоресцентных проб и белков позволяют «рассматривать» биохимические процессы в реальном времени. Флуоресцентные белки помогают увидеть увеличение внутриклеточной концентрации кальция и магния, концентрации важных метаболитов (NADH+, лактата, глутамата и многих других), изменения pH, потенциалов действия, развитие важнейших клеточных процессов —прохождение клетки по клеточному циклу, программируемую клеточную гибель, активацию сигнальных каскадов и много другого.

Огромные возможности микроскопии, естественно, нашли применение в разработке новых лекарств, в том числе и для скрининга огромных библиотек химических веществ, антисмысловых РНК, антител и т.п. Микроскопия позволяет идентифицировать комплексные фенотипы, не ограничиваясь, как в биохимических скринингах, лишь одной мишенью. Микроскопы для высококонтентного анализа (high-content screening/analysis) потеряли свои канонические окуляры и открытые объективы — эти приборы выглядят как закрытые ящики, подключенные к компьютеру, однако могут снимать тысячи экспериментальных точек в день (особенно если они интегрированы с роботами для автоматической подачи образцов). Результаты таких анализов также не обрабатываются вручную, а анализируются компьютером по заранее заданным исследователем правилам. Компьютерный анализ применяется все шире, и, безусловно, скоро распространится и на рутинные научные исследования, и на постановку диагнозов. Последнее преимущество позволяет уменьшить субъективность диагноста: если раньше диагноз выставляли лишь с помощью взгляда патолога, то сейчас возможно применять программы для анализа, которые не будут зависеть от неопытности или ошибок врача. Оцифровка микроскопических изображений позволит анализировать их массивы с помощью машинного обучения, и в особо сложных случаях получать консультации врачей из любой точки мира.

Развитие биологии все время демонстрировало сложность и неоднородность устройства биологических объектов — от клетки к органу в целом. Микроскоп позволяет сохранить часть этой сложности, рассматривая клетки и ткани как комплексные системы, а не просто множество реакций в пробирке. И потому этому старейшему биологическому инструменту можно спокойно предсказать еще долгие годы жизни.

Календарь

На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет сентябрь.

1. H. Gest. (2004). The discovery of microorganisms by Robert Hooke and Antoni van Leeuwenhoek, Fellows of The Royal Society. Notes and Records of the Royal Society. 58, 187-201;
2. Giuseppe Musumeci. (2014). Past, present and future: overview on histology and histopathology. J Histol Histopathol. 1, 5;
3. Abbe E. (1883). XV. The relation of aperture and power in the microscope. J. R. Microsc. Soc. 3, 790–812;
4. Hannah Landecker. (2009). Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Meth. 6, 707-709;
5. Rusk N. (2009). The fluorescence microscope. Nat. Methods;
6. Иммунитет: борьба с чужими и… своими;
7. Моноклональные антитела;
8. Osamu Shimomura, Frank H. Johnson, Yo Saiga. (1962). Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan,Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol.. 59, 223-239;
9. Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!;
10. Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии;
11. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M. et al. (1997). Fluorescent indicators for Ca²⁺ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882–887;
12. Sheppard C.J.R. and Wilson T. (1981). The theory of the direct-view confocal microscope. J. Microsc. 124, 107–117;
13. W Denk, J. Strickler, W. Webb. (1990). Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76;
14. По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014;
15. Лучше один раз увидеть, или Микроскопия сверхвысокого разрешения;
16. Stefan W. Hell, Jan Wichmann. (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett.. 19, 780;
17. Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи;
18. E. Betzig, G. H. Patterson, R. Sougrat, O. W. Lindwasser, S. Olenych, et. al.. (2006). Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645.

Лазерный микроскоп МИМ-340: увидеть живую клетку

История исследования микромира уходит в далекое прошлое, а первые сведения о микроскопах были зафиксированы в XVI веке. Ученым всегда хотелось узнать, из чего состоит окружающий мир, увидеть его в мельчайших деталях. Первые увеличительные аппараты были совсем простыми, но с их развитием знания о мире росли очень быстро, и сегодня сложно найти сферу естественных наук, в которой не применялись бы микроскопы.

Современные микроскопы по принципу работы бывают оптическими, электронными, зондовыми, рентгеновскими и лазерными. Микроскоп МИМ-340, разработанный «Швабе» (холдинг Госкорпорации Ростех) относится именно к лазерным аппаратам, и его работа основана на технологии модуляционно-интерференционной микроскопии.

 

Наноточность в работе

Микроскоп создан на базе Уральского оптико-механического завода имени Э. С. Яламова (УОМЗ), входящего в состав холдинга «Швабе». В 2014 году труд авторского коллектива получил высокую оценку − премию Правительства России.

Уникальность МИМ-340 заключается в том, что он позволяет рассматривать клетку при тысячекратном оптическом увеличении в максимальном разрешении до 0,1 нанометра по вертикали и до 10 нанометров в плоскости XY. При этом может вестись съемка исследуемого объекта в реальном времени со скоростью 3 кадра в секунду. Микроскоп позволяет рассматривать именно живую клетку, не прибегая к подкрашивающим веществам и не разрушая объект исследования. Таким образом можно, например, увидеть реакцию клетки на действие препарата.

Этот подход очень важен в медицине и биотехнологиях, позволяя наблюдать клеточные процессы некоторое время, причем в объеме. Исследование, проводимое на клетках крови и культурах опухолевых клеток, показало, что комплекс МИМ-340 расширяет набор объективных количественных параметров для диагностики различных патологий на ранних стадиях.

Необходимые измерения на МИМ-340 можно проводить бесконтактно. Процесс отличается простотой: продукт загружается в контейнер, запускается программное обеспечение, и на выходе получается точный результат. Результаты измерений отображаются на экране компьютера в виде топографических изображений (псевдоцветных карт), а также двумерных профилей с текстовой и цифровой информацией о структуре и статистических параметрах рельефа измеряемого микрообъекта.

 

Технологии плюс дизайн

Принцип действия микроскопа основан на совместном использовании оригинальных технологий лазерной микроскопии МИМ и аэромагнитных направляющих. Такое сочетание позволяет исследовать поверхность крупногабаритных (до 300х300 мм) объектов без потери координаты и фокуса. В основе работы микроскопа − интерференция световых пучков лазерного излучения, отраженных от опорного зеркала и поверхности измеряемого микрообъекта.

МИМ-340 оснащен сверхплоским длинноходовым координатным столом нанометрового разрешения. Важной особенностью МИМ является оригинальный алгоритм вычисления фазы отраженного от объекта волнового фронта, сочетающий в себе быстродействие шаговых методов и сверхразрешение фазометрических методов.

Управление микроскопом производится с помощью рабочей станции – компьютера с двумя мониторами и предустановленным программным обеспечением. Стоит отметить тот факт, что разработчики микроскопа уделили должное внимание дизайну изделия. МИМ-340 выглядит очень современно: панели со скошенными линиями, яркая подсветка. Приятно, что внешний вид микроскопа соответствует высокотехнологичной «начинке».

 

Проверка на практике

Микроскоп МИМ-340 обладает широким спектром применения: от медицины до точного машиностроения, оптической промышленности, материаловедения и авиационно-космической отрасли.

Сегодня он проходит апробацию в ведущих вузах и крупнейших научно-исследовательских центрах России, в том числе в МГУ, Институте механики сплошных сред УО РАН, Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Центре доклинических и трансляционных исследований им. В.А. Алмазова в Санкт-Петербурге и других.

С помощью МИМ-340 ученым Пермского федерального исследовательского института центра УрО РАН удалось подтвердить гипотезу о том, что монофрактальность сигналов колебаний оптической плотности клеток является признаком злокачественных образований.

На базе технологии лазерной интерференционной микроскопии, лежащей в основе МИМ-340, разработан оригинальный метод диагностики рака молочной железы. Метод сочетает динамическую фазовую микроскопию, при помощи которой выявляются характерные моды, присущие опухолевым клеткам, и инфракрасную термографию, позволяющую на ранней стадии локализовать опухоль для последующей биопсии.

В настоящее время ведутся работы по созданию настольной версии лазерного микроскопа МИМ-Н, адаптированного для биомедицинских исследований. Разработка МИМ-340 является ярким примером диверсификации производства и увеличения доли гражданской продукции Ростеха, которая согласно стратегии госкорпорации к 2025 году должна составить более 50%.

Для чего используются микроскопы в сфере здравоохранения

Несмотря на обширные исследования живых и неживых существ, человечество все еще едва касается поверхности науки, и многие вопросы все еще остаются без ответа. Чтобы ответить на эти вопросы, ученым жизненно важно внимательно присмотреться к вещам с бесконечно малых размеров. К счастью, микроскопы проливают свет на просмотр и анализ материи на крошечном уровне, недоступном для обычных человеческих глаз.

Что такое микроскоп?

Микроскоп — это оптический прибор, используемый для исследования небольших объектов, которые нельзя увидеть невооруженным глазом. В микроскопах в основном используются линзы для изгиба и преломления световых лучей, таким образом первоначально увеличивая объекты. Затем изображение можно просматривать через его линзу окуляра, что еще больше увеличивает изображение для просмотра. Этот оптический прибор на удивление полезен в нескольких областях дисциплины, особенно в науке, и если вы планируете их приобрести, вы можете купить микроскопы в MicroScopeInternational.com.

Микроскопы широко используются в школах и лабораториях. Во время своего академического путешествия вы, вероятно, хотя бы раз использовали микроскоп для научного эксперимента, в котором участвовали увеличивающие объекты. Наиболее распространенные применения микроскопов, о которых известно:

• Анализ клеток и тканей
• Наблюдение за вещественными доказательствами
• Изучение атомных структур и систем
• Исследования и разработки в области нанотехнологий

Однако вы будете удивлены, что эти приложения ничто по сравнению с тем, что они могут сделать, когда вы войдете в отрасль здравоохранения, которая является наиболее важной отраслью, которая извлекает наибольшую выгоду из использования микроскопов.

Микроскоп в здравоохранении

Из-за выдающихся возможностей микроскопов нет сомнений в том, что в каждой области здравоохранения есть разные типы микроскопов для повседневного использования. В этой статье вы собираетесь более подробно и более подробно изучить различные применения микроскопов в сфере здравоохранения:

Превосходные врачи, ученые и медицинские работники не приобрели бы специальных знаний в своих областях без микроскопов.Этот инструмент всегда использовался в их ежедневных уроках и практических экзаменах. Благодаря микроскопам специалисты в области здравоохранения могут изучать медицинские концепции, которые во многом основаны на исследованиях клеточной биологии, и применять их на практике.

Поскольку микроскопы важны для медицинского образования, школы и университеты должны гарантировать, что их микроскопы имеют первоклассное качество. Прежде чем покупать многочисленные устройства для академических и исследовательских целей, они изучают хорошие отзывы о микроскопах, чтобы убедиться, что они лучше всего подходят для своих студентов и преподавателей.

При определенных хирургических вмешательствах высококачественный микроскоп является незаменимым инструментом. Микроскоп становится глазами хирурга во время процедур, которые происходят в минутном масштабе. До этого врачи проводили операции с помощью простого увеличительного стекла. Но сегодня у них есть возможность использовать микроскоп для хирургических вмешательств.

Микроскопы обычно используются в хирургических областях, таких как стоматология, пластическая хирургия, офтальмологическая хирургия, которая включает хирургию глаз, ушей, носа и горла (ЛОР), а также нейрохирургию.

Без микроскопов невозможно идентифицировать некоторые болезни и недуги, особенно клеточные. Наблюдая за клетками в их природе с помощью микроскопа, специалисты могут наблюдать, как различные инородные тела атакуют клетки и как клетки им противодействуют, и все это через линзу.

Например, медицинские работники могут обнаруживать и диагностировать вирусы в вашем теле, взяв образцы жидкости вашего тела и изучив их под электронным микроскопом. Изучая образцы с помощью таких чувствительных микроскопов, врачи могут точно диагностировать типы микроорганизмов, живущих в вашем теле, или уровни определенных видов клеток в организме.Благодаря простоте доступа к микроскопам в лабораториях и больницах, а также их высокой точности, люди получают результаты и диагноз всего за часы или несколько дней.

• Фармацевтическая разработка

Человеческие болезни невозможно смягчить и вылечить без надлежащих лекарств и лекарств. Удивительно, но фармацевтические исследования и разработки также в значительной степени зависят от микроскопии, особенно при идентификации и исследовании фармацевтических материалов.Таким образом, исследователи-фармацевты могут исследовать, разрабатывать и производить новые лекарства.

Вот несколько реальных применений микроскопов в фармацевтических разработках:

• Анализировать атомный состав веществ с помощью оптической кристаллографии
• Контроль характеристик действующих веществ
• Использование сканирующих электронных микроскопов (СЭМ) для изготовления препаратов с низкой дозой
• Использование термической микроскопии для характеристики фармацевтических лекарственных форм по физико-химическому составу

На вынос

Благодаря повсеместному доступу и доступности микроскопов во всем мире, отрасли здравоохранения могут сделать много шагов вперед в улучшении здравоохранения и медицины для населения.Понимая использование и важность микроскопов в жизни человека, люди будут повышать осведомленность о том, как их можно использовать для более широких идей и практик в области здравоохранения.

Ross Person
Ross Person — успешный блоггер, который пишет статьи о здоровье и благополучии. Читатели смогут получить доступ к разному контенту в блоге Росса — от статей, которые помогут им похудеть, до видеороликов, показывающих, как правильно выполнять упражнения.

Росс также пишет о последних тенденциях в сфере здравоохранения.

Как микроскопы улучшают нашу жизнь сегодня?

Микроскоп позволяет пользователю увидеть мельчайшие части нашего мира: микробы, небольшие структуры внутри более крупных объектов и даже молекулы, которые являются строительными блоками всей материи. Способность видеть невидимые вещи обогащает нашу жизнь на многих уровнях. Врачи могут лучше диагностировать и лечить болезни, ученые могут обнаруживать связи, которые помогают сажать преступников за решетку и делать наш мир более безопасным, исследуя прочность мостов и других структур.Студенты также используют микроскопы для познания окружающего мира.

TL; DR (слишком долго; не читал)

Микроскопы играют решающую роль в медицинских исследованиях и испытаниях, а также помогают судебным экспертам расследовать преступления. Они также используются в образовании.

Микроскопы в медицине

Использование микроскопов в медицине началось в 1860-х годах, когда Луи Пастер сообщил, что микроскопические организмы, которые он видел в микроскоп, вызывают определенные заболевания.До этого времени люди думали, что болезни исходят от злых духов или Бога. Теория микробов Пастера произвела революцию в процессе выявления, лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Сегодня больничных лабораторий используют микроскопы , чтобы определить, какой микроб вызывает инфекцию, чтобы врачи могли прописать подходящий антибиотик. Они также используются для диагностики рака и других заболеваний.

Исследования с помощью микроскопов

Многие ученые, стремящиеся лучше понять естественный и физический мир, используют микроскоп в своей работе. Судмедэксперты исследуют кровь, пыль, волокна и другие следы на месте преступления, чтобы помочь привлечь к ответственности преступников. Ученые-экологи исследуют образцы почвы и воды, а генетиков изучают хромосомы на предмет дефектов. В инженеры-материаловеды используют микроскопы для осмотра компонентов конструкций, таких как здания, мосты и плотины, чтобы убедиться в их безопасности.

Микроскопы в образовании

В классе микроскопы используются для обучения студентов структуре вещей, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть одним человеческим глазом.Отдельные клетки растений, животных, бактерий и дрожжей можно увидеть с помощью сложного микроскопа. Сравнение этих организмов помогает учащимся узнать о разнообразии жизни на Земле. Кроме того, то, как работают микроскопы, можно использовать для обучения студентов свойствам света, физике линз и зеркал, а также методам окрашивания различных образцов. Кроме того, можно увидеть отдельные части клетки, когда учащиеся узнают об их конкретных функциях.

Как микроскопы повлияли на здравоохранение — AmScope

Микроскопы — фантастически универсальные инструменты.В детстве они открывают нам глаза на секретные миры в капле воды или обнаруживают инопланетную структуру глаза мухи. В университетских условиях они помогают студентам идентифицировать части клетки или исследовать образцы тканей. Любители и исследователи могут взять портативные цифровые микроскопы в поле для удобного анализа растений, животных или минералов на ходу. Микроскопы раскрывают широкую сеть их полезности, но один из наиболее важных способов, которыми они влияют на нашу жизнь, — это медицина.В этой статье мы исследуем, как микроскопы на протяжении веков сильно влияли на сферу здравоохранения.

Первые микроскопы

В 17 веке Антуан ван Левенгук усовершенствовал примитивные версии микроскопа, поместив небольшую сферическую стеклянную линзу в регулируемый стержень, которым можно было манипулировать для фокусировки на крошечных образцах. Он смог увидеть эритроциты и микроорганизмы, что привело к тому, что его признали «отцом микробиологии». Хотя микроскопы, безусловно, прошли долгий путь от устройства Левенгука до того, что мы используем сегодня, их важность в здравоохранении была очевидна почти с момента их появления.

Левенгук и другие ранние микроскописты зарегистрировали бактерии, простейшие, эпителиальные клетки и другие загадки человеческого тела, занесенные в медицинские справочники. Тем не менее, пройдет еще сто лет, прежде чем важность микроскопов в медицине будет общепризнана, и они станут незаменимыми как в клинических условиях, так и в университетах по всему миру.

Медицинское образование

Когда вы думаете о микроскопе, первое, что приходит на ум, может быть ученый в белом лабораторном халате, склонившийся над окуляром.Это не так уж и далеко от истины. Медицинское образование в значительной степени полагается на использование медицинских микроскопов, чтобы научить студентов определять множество заболеваний, которые можно обнаружить в образцах крови или тканей. Начиная с вашего первого базового курса биологии, который вы посещаете в своем университете, вплоть до курса подготовки к медикам, если вы встанете на образовательный путь, чтобы стать поставщиком медицинских услуг, вы на своем пути столкнетесь с микроскопами.

Обучение студентов тому, как пользоваться микроскопами в школе, может помочь им идентифицировать микробы, вызывающие инфекции, после того, как они попадают в сферу медицины.Но научиться пользоваться микроскопом — это только одна сторона медали. Педагоги могут использовать цифровые микроскопы с камерами для проецирования изображений на весь класс. Цифровые микроскопы используют оптику и цифровую камеру для передачи изображений на компьютер. Неподвижные изображения и видео можно проецировать в режиме реального времени, чтобы весь лекционный зал мог наблюдать за одним и тем же образцом. Учителя используют эти устройства, чтобы все видели одно и то же изображение, избегая вариаций, возникающих из-за того, что учащиеся по очереди смотрят в окуляр индивидуально.Такое использование USB-технологии, позволяющей сохранять изображения и обмениваться ими между пользователями, позволяет учащимся ссылаться на данные позже, когда они продолжают учебу.

Клинические учреждения

До того, как микроскопы нашли свое место в современной медицине, люди — даже врачи — верили, что Бог или злые духи посылают болезни, чтобы наказать людей. В 1860-х годах Луи Пастер разработал теорию о том, что «микробы» на самом деле являются виновниками наших болезней. Пастер заметил корреляцию между конкретными заболеваниями и объектами, которые он наблюдал в крови больных пациентов.Теперь мы знаем, что «микробы», о которых говорил Пастер, на самом деле были бактериями, вирусами и другими патогенами. Его наблюдения открыли путь современной медицине для выявления, лечения и даже предотвращения инфекционных заболеваний.

Бактерии и клетки крови выявляются в фазовых микроскопах, которые используются во многих клинических условиях. Если вы посещали уроки биологии в средней школе, вы, возможно, помните, как протирали внутреннюю часть щеки плоской зубочисткой и помещали ткань на предметное стекло. Клетки, которые появились под микроскопом, были эпителиальными клетками, выстилающими поверхность наших органов и кровеносных сосудов.Врачи и клиницисты до сих пор используют медицинские микроскопы для выявления этих типов клеток, которые часто могут сказать нам, когда что-то идет не так в нашем организме.

Типы микроскопов в клинических условиях

Есть много причин, по которым медицинским работникам может понадобиться использовать микроскоп. Кроме того, для выполнения каждой из этих функций может потребоваться больше, чем один тип микроскопа, поэтому в больницах и кабинетах врачей часто под рукой есть самые разные прицелы.Одним из самых распространенных микроскопов является световой микроскоп. Они используют свет для освещения изображения, в то время как одна или иногда несколько линз увеличивают образец. Они используются для исследования тканей или выявления одноклеточных организмов, таких как те, которые обнаруживаются в нашей крови и указывают на болезнь.

Флуоресцентные микроскопы используют ультрафиолетовый свет для освещения более мелких деталей клеток. Блокируя внешний свет, эти микроскопы могут увеличить разрешение изображения и показать образец в трех измерениях.Эти устройства отлично подходят для выявления бактерий в образце. Электронные микроскопы используют концентрированные пучки электронов и красителей для освещения своих образцов. Эти электронные лучи имеют очень короткие длины волн, что означает, что они могут создавать изображения исключительно высокого разрешения. Клиники могут использовать эти прицелы для выявления и исследования вирусов в кровотоке.

Где-то между световым и электронным микроскопами лежат рентгеновские микроскопы. Рентгеновские лучи — это очень компактные лучи, которые не могут быть обнаружены человеческим глазом.Они также не отражаются и не преломляются легко, что означает, что они могут создавать очень четкие и детализированные изображения. Они обладают чрезвычайно высоким разрешением — достаточным для того, чтобы наблюдатель мог сосредоточиться на отдельных атомах — и являются узкоспециализированными. Их преимуществом в клинических условиях является их способность отображать живые клетки, в отличие от других микроскопов, которые требуют окрашивания и фиксации образцов на предметном стекле.

Исследования

Медицинские школы и фармацевтические компании используют все типы микроскопов для своих исследований.В медицинских школах при университетах большое внимание уделяется преподаванию и построению карьеры, которые сопровождают исследования. Главные исследователи лаборатории часто практикуют медицину или иногда читают лекции, а также проводят исследования по инфекционным заболеваниям или другим вопросам, связанным со здоровьем. Лаборатории полностью оснащены научно-исследовательскими и учебными заведениями, способствующими открытию новых достижений в медицине, но при этом помогая доктору философии. студенты и постдокторанты делают следующий шаг в своей карьере.В этих лабораториях часто даже студенты бакалавриата работают в них неполный рабочий день, которые помогают докторантам в их исследованиях, а также получают опыт в области микроскопии и другие важные лабораторные навыки. Такой широкий спектр навыков, необходимости и опыта означает, что доступно множество различных типов микроскопов, в зависимости от типа проводимых исследований.

В отличие от академических кругов фармацевтические и другие исследовательские компании обычно не тратят много времени и ресурсов на обучение.Медицинские микроскопы, имеющиеся в этих учреждениях, которые часто предназначены для поиска лекарств от таких заболеваний, как рак, или для разработки методов лечения инфекционных патогенов, часто являются более совершенными. Стереомикроскопы часто используются для рассечения тканей. Например, исследовательские лаборатории, специализирующиеся на иммунологии и исследованиях рака, часто используют сотни мышей в ходе одного исследования. Этих мышей умерщвляют и анализируют, чтобы проанализировать, как они отреагировали на различные методы лечения, используемые для лечения опухолей.Стереомикроскопы позволяют исследователям рассматривать органы и опухоли при увеличении, что упрощает выполнение необходимых протоколов диссекции и анализа.

Хирургия

В хирургических условиях врачи также полагаются на стереомикроскопы, чтобы получить изображение человеческого тела крупным планом. Выполнение разрезов и наложение швов становится более легкой задачей, когда эти микроскопы увеличивают пациента. В операционной также можно использовать переносную камеру микроскопа. Эти камеры проецируют большие изображения участка тела, на котором оперирует врач, давая ей доступ к деталям, которые нельзя увидеть невооруженным глазом.

Микроскопия в диагностике

Электронная микроскопия стала бесценным инструментом диагностики. Электронные микроскопы намного превосходят световые микроскопы при оценке отдельных клеток и даже меньших структур. Органеллы, цитоскелеты и другие части клетки наиболее отчетливо видны под электронным лучом. Даже опухолевые клетки, которые иначе трудно идентифицировать, обнаруживаются с помощью электронного микроскопа. Биопсии почек и биопсии других органов также выигрывают от того, что их рассматривают под ясностью и точностью электронных микроскопов, а не световых микроскопов.

Сочетание электронных микроскопов с цифровой камерой микроскопа позволяет сохранять и совместно использовать максимальный объем данных. Сохраняя изображения и видео, снятые с помощью камер микроскопов, медицинские работники могут более легко отслеживать прогресс пациента с течением времени, сравнивая и противопоставляя набор изображений. Чем больше совершенствуются системы электронных медицинских карт, тем проще обмен данными между поставщиками первичной медико-санитарной помощи и специалистами. Это означает, что изображения с микроскопа могут использоваться всеми поставщиками услуг пациента в качестве справочной информации для отслеживания прогрессирования заболевания и принятия обоснованных решений о будущем лечении и уходе.

Публикация

Приглашаем исследователей как в академических, так и в промышленных кругах публиковать свои выводы. Фактически, фраза «опубликуй или исчезни» показывает, насколько публикация необходима для карьеры ученого-исследователя. Цифровые микроскопы, особенно в сочетании с мощной камерой микроскопа, позволяют исследователям беспрепятственно сотрудничать в проектах, даже если их лаборатории находятся на другом конце света. Поскольку отбор образцов у населения в разных регионах мира является важным аспектом открытия лекарств, сотрудничество на расстоянии является обычным явлением.Изображения с цифровых микроскопов могут быть загружены и опубликованы в течение нескольких секунд, чтобы их можно было добавить в публикацию исследования. Журналы с высоким импакт-фактором, такие как Nature, Cell и Science, теперь принимают (и даже предпочитают) цифровые формы всех изображений, даже данных, полученных с микроскопов.

Влияние микроскопа на здравоохранение с момента его создания очень велико. Скорость, с которой были сделаны улучшения в этой технологии за последнее столетие, ошеломляет и напрямую повлияла на то, как мы исследуем, диагностируем и лечим болезни.Наше понимание человеческого тела и того, как на него влияют внутренние и внешние силы, во многом можно объяснить тем, как мы научились использовать и улучшать микроскопы. Почти каждая отрасль здравоохранения и медицины в той или иной степени полагается на микроскоп, а новые технологии сделали использование микроскопа настолько доступным, портативным и универсальным, что понимание микроскопических изображений доступно каждому — даже вне области медицины. От нашего первого знакомства с микроскопами в классе начальной школы до каждого последующего посещения кабинета врача мы ощущаем влияние изобретения Левенгука на всю жизнь.

Microscopy — Medical Imaging Systems

Мы воспринимаем окружающий нас физический мир глазами, но только до определенного предела. Объекты диаметром менее 75 мкм невозможно распознать невооруженным глазом, и по этой причине они оставались неоткрытыми на протяжении большей части истории человечества.

Мы воспринимаем окружающий нас физический мир глазами, но только до определенного предела. Объекты диаметром менее 75 мкм нельзя распознать невооруженным глазом, и по этой причине они оставались неоткрытыми на протяжении большей части истории человечества.К этой категории относятся клетки (диаметр 10 мкм), бактерии (1 мкм), вирусы (100 нм), молекулы (2 нм) и атомы (0,3 нм) ¹ . Фактически, важность этих микро / нано-сущностей почти во всех аспектах нашей жизни не может быть оценена в достаточной степени. Микроскопы — это инструменты, которые позволяют нам расширить наше видение на микромир и, несмотря на приставку микро- в названии, на наномир. Эта глава знакомит читателя с основными принципами наиболее широко используемых методов световой микроскопии, их преимуществами и присущими им ограничениями.Другие типы микроскопов, такие как сканирующие туннельные микроскопы или атомно-силовые микроскопы, не рассматриваются в этом тексте. В отличие от предыдущей главы, модели проекции крошечного отверстия уже недостаточно для объяснения микроскопии. Поэтому мы представляем модель тонкой линзы, поскольку она объясняет как минимум две функции: сбор света и увеличение.

5.1. Формирование изображения в тонкой линзе

Рассмотрим объект высотой h , стоящий на расстоянии d перед собирающей линзой с фокусным расстоянием f .Естественно, объектив создает изображение этого объекта. Тогда возникает вопрос, как мы можем определить высоту изображения h ‘и его расстояние d ‘ до линзы. С точки зрения геометрической оптики процесс формирования изображения можно описать с помощью трех простых правил (см.):

1. Падающий световой луч, проходящий через оптический центр O , не преломляется.

2. Падающий световой луч, параллельный оптической оси, преломляется, проходя через точку фокусировки изображения F ‘.

3. Падающий световой луч, проходящий через точку фокусировки объекта F , преломляется параллельно оптической оси.

Как показано на, три луча пересекаются в точке, расположенной на расстоянии d ‘от линзы. Очевидно, что для геометрического построения этой точки пересечения достаточно двух лучей. Изображение, полученное на d ‘, определяется как в фокусе изображения. С другой стороны, изображение, полученное на большем или меньшем расстоянии, чем d ‘, называется расфокусированным изображением .В этом контексте изображение точечного источника (например, T дюймов) бесконечно мало в фокусе (абстрагируется как точка T ′ дюймов), но оно больше, чем точка для расфокусированных изображений.

Рис. 5.1.

Формирование изображения в собирающей линзе для объекта, расстояние до которого больше фокусного расстояния.

показывает результат применения правил формирования изображения, т.е. е., три упомянутых выше правила для случая, когда объект находится в пределах фокусного расстояния ( d ).Как видно на рисунке, лучи не сходятся. Однако расширения лучей пересекаются в точке T ‘, называемой виртуальным изображением , из которой лучи кажутся расходящимися. Напротив, изображения, сформированные при d> f , называются реальными , поскольку они являются реальными точками схождения световых лучей. Виртуальные изображения, сформированные собирающей линзой, имеют вид в вертикальном положении , а реальные изображения — в перевернутом виде . Еще одно важное отличие состоит в том, что виртуальные изображения нельзя проецировать на экран, микросхему камеры или любую другую поверхность.Тем не менее, они могут восприниматься человеческим глазом, потому что глаз ведет себя как собирающая линза, которая запоминает расходящиеся световые лучи на сетчатке.

Рис. 5.2

Формирование изображения в собирающей линзе для объекта, расстояние до которого меньше фокусного расстояния.

показывает результат применения правил формирования изображения в расходящейся линзе, когда d . Однако следует отметить, что: В отличие от случая собирающих линз, при применении этих правил к расходящимся линзам фокус изображения F ‘находится на стороне падающих световых лучей, а фокус объекта F находится на другая сторона линзы.Как и в случае, описанном в, изображение вертикальное и виртуальное. Однако, в отличие от, она уменьшена. Мы получаем этот результат с расходящейся линзой и при d> f .

До сих пор мы могли геометрически построить изображение объекта в расходящейся или собирающей линзе. На этом этапе мы можем спросить, существуют ли уравнения в замкнутой форме, которые связывают высоту объекта h с высотой изображения h ′ или расстояние объект-линза d с расстоянием изображение-линза d ′ .

Рассмотрим собирающую линзу с d> f (см.). Из аналогичных треугольников T OB и T ′ O B ′ можно прямо написать:

То же самое касается треугольников TFB и FOL : Комбинируя уравнение. (5.1) и уравнение. (5.2) дает:

fd − f = d′dfd = d′d − d′ffd + d′f = d′d

Деление на fdd ′ дает уравнение для тонкой линзы : Уравнение (5.3) было получено в этом тексте для реальных изображений в собирающей линзе.Тем не менее, его также можно использовать для виртуальных изображений и / или расходящихся линз в соответствии со следующими соглашениями о знаках: 1) d ′ отрицательное, когда изображение находится на стороне объектива линзы (аналогично случаю в), в противном случае положительный. 2) f отрицательно для расходящихся линз. Более того, если мы добавим соглашение о третьем знаке, гласящее, что h ′ положительно для вертикальных изображений и отрицательно в противном случае, тогда уравнение. (5.1) и уравнение. (5.2) можно обобщить к следующему виду:

M = h′h = −fd − f = −d′d

Исходя из вышеупомянутых условных обозначений, увеличение M является положительным для вертикальных изображений и отрицательным для перевернутых изображений.Это обобщение, т. Е. Уравнение. (5.3) и уравнение. Правильность (5.4) можно доказать, применив три правила формирования геометрического изображения и используя подобие треугольников для каждой конкретной установки. Кроме того, на основании уравнения. (5.4) можно сделать следующие выводы:

• Изображение объекта в собирающей линзе увеличивается (| M |> 1), когда d <2 f , имеет тот же размер объекта, когда d = 2 f , и уменьшено (| M | <1), когда d > 2 f .

• Увеличивается изображение объекта в расходящейся линзе ( f <0).

5.2. Составной микроскоп

Если вы посмотрите через увеличительное стекло на объект, расположенный в пределах фокусного расстояния линзы, вы увидите увеличенное вертикальное виртуальное изображение объекта. Концептуально это простой микроскоп. Составной микроскоп (см.) Расширяет этот основной принцип за счет использования как минимум двух собирающих линз. Линза, которая находится ближе к образцу, называется объективом , линзой .Он создает реальное увеличенное перевернутое изображение G _o образца. Для этого требуется, чтобы расстояние от образца до объектива d _o находилось в диапазоне f _o < d _o <2 f _o , где f _o — это фокусное расстояние объектива. Вторая линза называется окуляром , поскольку это компонент, через который пользователь микроскопа наблюдает за образцом.Расстояние от G _o до окуляра d _e по конструкции меньше фокусного расстояния окуляра ( d _e < f _e ). Следовательно, линза окуляра создает увеличенное виртуальное изображение G _e из G _o . Поскольку изображение первой линзы является объектом для второй, общее увеличение является произведением двух увеличений линзы.

Рисунок 5.4

Формирование изображения в сложном микроскопе. Символы F _o , F ′ _o , F _e и F ′ _e представляют точку фокусировки объекта объектива, точку фокусировки изображения объектива, точку фокусировки объекта окуляра и окуляр. фокус изображения соответственно. Человек-наблюдатель (подробнее …)

В современных микроскопах линза объектива характеризуется увеличением и числовой апертурой. Увеличение было определено выше в формуле.(5.4). Числовая апертура определяет способность линзы собирать свет. Это определяется следующим образом:

где n — показатель преломления среды между линзой объектива и образцом ( n _воздух ≈ 1), а θ — половина угла максимального светового конуса, который может собирать линза (см.). Поскольку изображение, формируемое линзой объектива, реально, его можно зафиксировать физическим детектором. Например, он может быть записан с помощью ПЗС-чипа, и, следовательно, увеличенное изображение может быть сохранено как цифровое изображение, которое может быть дополнительно обработано цифровым компьютером.

Рисунок 5.5

Числовая апертура определяется как θ , половину угла максимального светового конуса и n , показатель преломления среды между линзой и образцом.

Рис. 5.6

Основные схемы светлопольного микроскопа и флуоресцентного микроскопа. Оба были нарисованы после [1].

Принцип составного микроскопа моделирует механизм увеличения. Кроме того, в зависимости от того, как освещается образец и какая информация переносится световыми лучами, световые микроскопы можно разделить на подкатегории: яркое поле, флуоресценция, фазовый контраст, количественная фаза и другие.В следующих разделах будет дано больше подробностей о каждом из вышеупомянутых микроскопических модальностей.

5.3. Светлопольная микроскопия

Обычно плотность и толщина образца зависят от места. Следовательно, точки образца по-разному поглощают свет, т. Е. Энергия света после прохождения через образец также зависит от пространства. схематически показано, как этот факт можно использовать в микроскопической установке. Конденсор , показанный на рисунке, играет роль концентрации света, исходящего от источника света, на образце.Информация об образце закодирована в интенсивности световой волны, которая достигает цели. Фон или часть сцены, не содержащая плотных объектов, имеет тенденцию быть ярким на результирующем изображении. Это впечатление наблюдателя дало название технике. Настройка «светлого поля» — это выбор номер один, когда главными проблемами являются минимизация расходов или сложности с внедрением. Пример светлого поля изображения клеток показан на.

Рисунок 5.7

Микроскопическое изображение клеточной культуры: Изображение было получено с помощью микроскопа Nikon Eclipse TE2000U с объективом в светлом поле с увеличением 10 × и NA = 0.3.

Рисунок 5.8

Иллюстрация определения жизнеспособности клеток с помощью окрашивания PI.

В повседневной клинической практике суспензионные клетки исследуются нечасто. Вместо этого наиболее распространенными методами исследования для светлопольной микроскопии являются цитология, при которой исследуются клетки и их внутренняя структура, и гистология, при которой встраивание клеток в архитектуру окружающей ткани

Geek Box 5.1 Шторы для гистологии и цитологии

Чтобы выделить клеточные структуры, срезы биоптатов тканей, а также цитологические препараты часто окрашивают или окрашивают.Наиболее распространенная форма окрашивания в гистологии — смесь двух веществ, называемых гематоксилином и эозином, где цвет гематоксилина окрашивает ядра клеток в синий цвет, а цитоплазма и другие клеточные структуры окрашиваются в пурпурный цвет эозином. Кроме того, красители используются для оценки количества определенных веществ, например медь или железо, или биологические структуры, прилипающие к определенным биомаркерам. Помимо основного цвета, часто вторичный (или даже третий) цвет с сильно различающейся спектральной формой используется для окрашивания других клеточных компартментов и увеличения контраста. Этот процесс называется контрастным окрашиванием.Чтобы подготовить образец, его обычно фиксируют формальдегидом и заливают парафином. Фиксация останавливает большую часть биологических процессов и обеспечивает надлежащее качество слайда и медленный процесс деградации. Заливка блока воска является предварительным условием для разрезания тонких ломтиков постоянной толщины, которые затем помещаются на предметное стекло микроскопа и покрываются покровным стеклом.

Различные красители для гистологии и цитологии

Верхний ряд: гематоксилин-эозин, азан, мультицитокератин (AE1, AE3).Нижний ряд: Grocott, May-Grünwald-Giemsa, Turnbull Blue. Изображения любезно предоставлены FU Berlin, Германия.

описан. Для обоих методов окрашивание образца играет важную роль (см. Блок для компьютерщиков на стр. 77).

5.4. Флуоресцентная микроскопия

В то время как в светлопольном микроскопе используется поглощение света образцом, флуоресцентный микроскоп использует другое естественное явление, которое, что неудивительно, называется флуоресценцией. Некоторые специальные материалы при освещении светом определенной длины волны излучают свет с другой длиной волны.Как показано на фиг.3, требуется фильтр возбуждения, чтобы выбрать часть электромагнитного спектра для возбуждения флуоресцентных материалов в образце. Затем используется другой фильтр для отделения испускаемого света от того, который используется в процессе возбуждения.

Флуоресцентные микроскопы дают изображения с высокой контрастностью по сравнению с изображениями в светлом поле. Кроме того, благодаря тому факту, что флуоресценция может быть вызвана конкретными биологическими или физическими процессами, ученые смогли найти множество применений флуоресцентной микроскопии в материаловедении и клеточной биологии.Приведу лишь один пример: широко используемый метод определения жизнеспособности клеток (см.) Основан на визуализации флуоресцентного красителя, называемого йодидом пропидия (PI). Жизнеспособные клетки обычно избирательно проницаемы, т. Е. Не позволяют молекулам свободно пересекать клеточную мембрану. Когда клетка умирает, это свойство исключения теряется, позволяя PI просачиваться через клеточную мембрану внутрь клетки. PI связывается затем с РНК и ДНК внутри проникающей клетки, что резко усиливает флуоресценцию.Таким образом, мертвые клетки можно легко отличить от неокрашенных жизнеспособных клеток.

У флуоресцентной визуализации есть как минимум два недостатка: во-первых, окрашивание может вызвать некоторые нежелательные эффекты на исследуемый образец. Например, было показано, что красители, используемые для определения жизнеспособности клеток, влияют на их жесткость. Во-вторых, то, что мы видим под флуоресцентной микроскопией, — это активность флуоресцентных красителей, которая, как правило, не раскрывает структурную информацию. Более того, эти флуоресцентные красители не всегда покрывают весь отображаемый объект.Эти два фактора приводят к неполной информации о форме. Для конфокальной лазерной эндомикроскопии также используются флуоресцентные красители, но в другой установке, которая обсуждается в Geek Box 5.2.

5.5. Фазово-контрастная микроскопия

Как упоминалось ранее, в светлопольной микроскопии за формирование изображения отвечает поглощение света. Объекты, которые поглощают свет, называются объектами с амплитудой и , поскольку они влияют на амплитуду света. С другой стороны, прозрачные объекты практически не изменяют амплитуду света.Однако они задерживают световую волну, внося фазовый сдвиг, и поэтому им присвоено имя фазовые объекты . Мы визуально продемонстрируем этот эффект и представим лежащую в основе математику в Geek Box 5.3.

Рисунок 5.10

Если мы рассмотрим свет как волну с амплитудой A и длиной волны λ, мы увидим, что объекты с амплитудой уменьшают амплитуду волны на поглощения . Фазовые объекты вызывают сдвиг фазы из-за различий в показателе преломления внутри и снаружи объекта.(подробнее …)

Geek Box 5.2 Конфокальная лазерная эндомикроскопия

Недавно в исследованиях привлек внимание к новому методу флуоресцентной микроскопии: в конфокальной лазерной эндомикроскопии (CLE) пучок волокон, переносящий лазерный свет в голубом цветовом спектре. вводится в полости человеческого тела, обычно через дополнительный канал обычного эндоскопа. С большим коэффициентом увеличения он используется для структурного анализа тканей in vivo , то есть у живого пациента.Благодаря конфокальной конструкции одна фокальная плоскость определенной глубины может быть визуализирована как резкое изображение, поскольку изображение не искажается из-за рассеяния света. Перед обследованием пациенту внутривенно вводят флуоресцентный контрастный агент, обогащающий межклеточное пространство и, таким образом, позволяющий очертить клеточные структуры.

Конфокальная лазерная эндомикроскопия (адаптировано из [15])

CLE генерирует видеопоследовательности с частотой до 12 Гц [15] и клинически используется для диагностики желудочно-кишечного тракта [13].Но его применение не ограничивается этим: в области нейрохирургии было показано, что различение опухолей головного мозга можно проводить по CLE-изображениям [9], а также он был успешно использован для диагностики опухолей во рту и верхних дыхательных путях. [21, 10].

CLE Изображение здоровой эпителиальной ткани голосовых складок (слева) и плоскоклеточного рака (справа). Изображения любезно предоставлены Университетской клиникой Эрлангена, Германия

Рис. 5.9

Примеры амплитудных и фазовых объектов в биологии.

Типичные детекторы света, такие как ПЗС-чипы или сетчатка в наших глазах, могут распознавать изменения амплитуды, но они нечувствительны к фазовым искажениям. В 1930-х годах голландский физик Фриц Зернике придумал блестящий трюк для преобразования невидимого фазового сдвига в видимое изменение амплитуды с помощью оптического фильтра. Его вклад лежит в основе давно зарекомендовавшей себя в лабораториях техники, известной сегодня как фазовый контраст . показывает изображение образца в светлом поле, в котором преобладают объекты амплитуды.В данном конкретном примере это клетки во взвешенном состоянии. также показано изображение в светлом поле, но образца с преобладанием фазовых объектов. Образец содержит ультратонкие адгезивные клетки. В показан тот же образец, но под фазово-контрастным микроскопом. На фазово-контрастном изображении отчетливо видно значительное улучшение контраста и информативности.

5.6. Количественная фазовая микроскопия

В предыдущем разделе фаза использовалась для получения большего контраста прозрачных образцов.Здесь мы можем задать следующий вопрос: что численное значение фазы говорит нам о физических свойствах образца? Как обсуждалось в Geek Box 5.4, мы наблюдаем только разницу фаз двух волн и не можем наблюдать абсолютное значение.

Фазовый контраст (см. Раздел 5.5) удобен для качественных неокрашенных изображений прозрачных образцов. Однако он не подходит для получения количественных значений фазы по двум причинам: во-первых, информация о фазе искажается артефактами, называемыми фазовыми гало , в областях изображения, которые окружают фазовые объекты (см.). Во-вторых, подход Зернике, который связывает наблюдаемое значение интенсивности с соответствующим значением фазы, применим только для очень малых фазовых сдвигов.

Geek Box 5.3 Волновое уравнение

Неформально говоря, в точке пространства r = ( x , y , z ), мы можем представить световую активность как частицу, танцующую во времени согласно e ^iwt , где t — время, а ѡ = 2 πξ — угловая частота, определяющая цвет света.В общем, этот танец масштабируется по амплитуде и сдвигается по-разному в каждой точке пространства. Следовательно, функция волны / частицы ψ ( r , t ) может быть смоделирована следующим образом:

ψ (r, t) = A (r) ei (ωt + ϕ (r)) = A (r) eiϕ (r) eiωt = U (r) eiωt.

Член U ( r ) кодирует как изменение амплитуды A ( r ), так и фазовый сдвиг ϕ ( r ) как комплексное число, и поэтому называется комплексной амплитудой волны.Уравнение (5.6) недостаточно для описания волны, если ψ не удовлетворяет знаменитому волновому уравнению : где c — скорость света в среде распространения, а ∇2 = ∂2∂x2 + ∂2∂y2 + ∂2∂z2 — пространственный лапласиан. Предполагая, что ψ можно разложить на множители как ψ ( r , t ) = ψ _r ( r ) ψ _t ( t ) (что имеет место в уравнении (5.6)) , можно вывести не зависящее от времени волновое уравнение , также известное как уравнение Гельмгольца : где k определяется как k = ωc и называется волновым числом .Важный класс решений уравнения Гельмгольца дается следующей комплексной амплитудой: В этом решении амплитуда везде постоянна с действительным значением A _ℓ , тогда как фаза линейно зависит от положения ϕl = k⊤r = xkx + yky + zkz. Для уравнения. (5.9) чтобы удовлетворить уравнению Гельмгольца, k должно удовлетворять kx2 + ky2 + kz2 = k. Этот факт можно проверить, установив U ( r ) = U _ℓ ( r ) в уравнении.(5.8). Более того, геометрическое место точек в пространстве, для которых U _ℓ ( r ) = константа, представляет собой плоскость с вектором нормали k . Следовательно, волны, описываемые уравнением. (5.9) называются плоскими волнами .

Количественная фазовая микроскопия — это общий термин для набора методов, с помощью которых можно получить надежную количественную информацию о фазе. Во вставке 5.5 подробно обсуждается один из методов определения количественной фазы: уравнение переноса интенсивности (TIE).Благодаря количественному характеру результатов TIE, его можно использовать для вычисления физических дескрипторов образца, которые трудно получить с помощью фазового контраста. Например, его в принципе можно использовать для оценки толщины и объема клеток в биологических культурах клеток. В целом, TIE кажется привлекательным по сравнению с фазовым контрастом по крайней мере по двум причинам: 1) можно получить высококонтрастные фазовые изображения с помощью светлопольного микроскопа, который дешев и прост в реализации по сравнению с фазово-контрастным микроскопом. .2) TIE дает количественную, а не качественную фазовую информацию. Однако у каждой новой техники есть свои проблемы, и TIE ни в коем случае не является исключением из этого правила. Фактически, оценка производной по оси очень чувствительна к выбору расстояния расфокусировки Δz . Кроме того, решение TIE подвержено искажениям из-за низкочастотного поля смещения, которое необходимо скорректировать.

Geek Box 5.4 Phase Shift

Фактически, фазовый сдвиг, вносимый фазовым объектом, может быть задан следующим образом:

ϕdiff (x, y) = k∫z1 (x, y) z2 (x, y) Δn (x, y, z) dz,

где k — волновое число падающего света, Δn ( x , y , z ) — разница в показателях преломления между объектом и окружающей средой, z ₁ и z ₂ — координаты начала и конца пути света через объект.Если объект имеет однородный показатель преломления, уравнение. (5.10) сводится к:

ϕdiff hom (x, y) = k⋅Δn⋅q (x, y),

где q ( x , y ) — толщина объекта при ( x , y ). Произведение показателя преломления на геометрическую длину светового пути обычно называют длиной оптического пути. Кроме того, разница двух длин оптического пути называется разницей оптического пути. Следовательно, численное значение фазы интерпретируется как разность оптического пути между объектом и окружающей средой.Константа k обычно игнорируется.

5.7. Ограничение световой микроскопии

In, точечный источник создает точечное изображение в фокусе. Однако это результат геометрической оптики, которая не принимает во внимание волновую природу света. С точки зрения волновой оптики свет проявляет свойства волн и, следовательно, претерпевает дифракцию при встрече с барьером или щелью. В микроскопии эта щель представляет собой апертуру объектива конечного размера.Из-за процесса дифракции изображение точечного источника представляет собой узор, известный в честь сэра Джорджа Эйри как узор Эйри . Как показано на, он состоит из центрального пятна, известного как диск Эйри (в 2-D), окруженного множеством дифракционных колец. Радиус паттерна Эйри, когда изображение находится в наилучшем фокусе, составляет:

где λ = 2πk — длина волны падающего света. Следует отметить, что d _Эйри в уравнении. (5.14) дано в объектно-пространственных единицах.Следовательно, в плоскости изображения радиус диска Эйри составляет M · d _Airy , где M — это увеличение.

Разрешающая способность микроскопической системы определяется как минимальное расстояние между двумя точечными источниками в пространстве объектов, при котором они все еще различимы как две точки в плоскости изображения. Интуитивно две точки различимы, если сумма двух соответствующих паттернов Эйри содержит

Компьютерщик Коробка 5.5 Уравнение переноса интенсивности (TIE)

Тиг вывел TIE в 1983 году, исходя из уравнения Гельмгольца (см. Уравнение (5.8)) в приближении медленно меняющегося поля вдоль оси z :

−k∂I (x, y) ∂z = I (x, y) ⋅∇⊥2ϕ (x, y) + ∇⊥I (x, y) ⋅∇⊥ϕ (x, y),

где I ( x , y ) — изображение интенсивности в фокусе (связанное с комплексной амплитудой в уравнении (5.8) как I = | U | ₂ ), и Δ _⊥ — оператор градиента в боковых направлениях, т.е.е., в плоскости xy . Символ Φ обозначает разность фаз (см. Уравнение (5.10)), но Φ использовалось вместо Φ _diff , поскольку фаза появляется только в дифференциальных терминах в TIE. Другими словами, фаза в TIE определяется с точностью до аддитивной константы, которая не имеет никакого значения между Φ и Φ _diff . Это уравнение можно еще более упростить, если мы примем идеальные фазовые объекты, т.е. I ( x , y ) = constant = I ₀ , к следующей форме:

−k∂I (x, y) ∂z = I0∇⊥2ϕ (x, y).

Осевая производная в левой части уравнения. (5.12) или уравнение. (5.13) можно измерить: Во-первых, получите изображение в светлом поле в фокусе I ₀ . Расфокусируйте микроскоп на расстоянии Δz и получите другое изображение. I ( Δz ): конечно-разностная аппроксимация производной тогда определяется как I (Δz) -I0Δz. После оценки осевой производной в TIE остается только фаза. Следовательно, TIE может быть решен для Φ , давая количественную фазовую карту.

Ранее в этом тексте упоминалось, что идеальные фазовые объекты невидимы в светлопольной микроскопии. Фактически, как показано в, вышеупомянутое утверждение верно только при условии, что изображение получено в фокусе. Это явление, то есть возможность визуализации фазовых объектов в светлопольной микроскопии, можно интерпретировать в свете TIE. Контраст, полученный при расфокусировке, численно представлен левой частью уравнения. (5.13). Правая часть показывает, что этот контраст фактически является фазовой информацией.Использование расфокусировки для визуализации прозрачных образцов в светлопольной установке иногда называют дефокусирующей микроскопией .

два различных пика. Однако условие, при котором два пика считаются отдельными , можно определить несколькими способами. Это привело к разным, но похожим определениям разрешающей способности. Согласно Рэлею, он определяется радиусом диска Эйри d _min = d _Эйри (см.). Немного другое определение, известное как критерий Аббе , дается как dmin = 0.5λNA.

Рисунок 5.11

Иллюстрация количественной фазовой микроскопии с использованием TIE. На рисунках показана клеточная культура прилипших ультратонких клеток L929.

Для увеличения разрешения микроскопа необходимо использовать свет с более короткой длиной волны и / или объектив с большей числовой апертурой. Использование более коротких длин волн будет рассмотрено в следующем разделе. Числовая апертура, как показано формулой. (5.5) теоретически ограничено сверху единицей, когда воздух ( n _воздух ≈ 1) является средой между образцом и объективом.Чтобы выйти за этот предел, производители микроскопов разработали объективы, которые могут работать в среде с более высоким показателем преломления, такой как вода ( n _вода ≈ 1,33) или масло ( n _масло ≈ 1,51 ) вставляется между образцом и объективом. Это привело к разработке водяных иммерсионных объективов и масляных иммерсионных объективов .

Если мы установим длину волны в формуле. (5.14) к длине волны в центре видимого спектра λ _{, видимой} ≈ 550 нм и числовой апертуре к теоретической верхней границе числовых апертур масляной иммерсии NA ^{лучше всего} = 1.51, мы получаем разрешение Рэлея dminbest = 222нм≈0,2 мкм. Это значение ² часто называют пределом разрешения оптической микроскопии. Две отдельные точки в пространстве объекта на расстоянии менее 0,2 мкм будут отображены как сумма двух паттернов Эйри, в которых можно распознать только один отчетливый пик. Увеличение увеличения увеличит размер этой суммы паттернов Эйри на плоскости изображения, но увеличенное изображение останется паттерном с одним пиком. Другими словами, за пределами определенного предела увеличение увеличения не приводит к разрешению новых деталей.Это явление известно как пустое увеличение .

Рисунок 5.12

Дифракционный барьер: из-за дифракции изображение точечного источника представляет собой узор Эйри. Таким образом, разрешающая способность микроскопа d _min ограничена шириной этого рисунка.

5.8. За пределами световой микроскопии

Одним из очевидных способов увеличения разрешения микроскопа является использование длины волны, которая короче длины волны видимого света. Например, можно использовать ультрафиолетовое (УФ) излучение (длина волны в диапазоне 300-100 нм), мягкое рентгеновское излучение (10-1 нм), жесткое рентгеновское излучение (менее 1 нм) ³ или электронные лучи. (возможны длины волн ниже 17 часов).Каждый диапазон длин волн позволяет нам исследовать часть наномира, но также ставит новые задачи как для производителей микроскопов, так и для пользователей. В ультрафиолетовых длинах волн стекло сильно поглощает световое излучение, и, таким образом, в ультрафиолетовой микроскопии линзы изготовлены из прозрачных для ультрафиолета материалов, таких как кварц. Более того, на длинах волн рентгеновского излучения показатель преломления твердых веществ очень близок к показателю преломления воздуха. Поскольку фокусировка света, выполняемая линзой видимого света, по сути является процессом преломления, эти линзы не могут использоваться для фокусировки рентгеновских лучей.Фактически, в рентгеновской микроскопии , дорогие и непрактичные устройства, которые основаны на дифракции вместо преломления, используются для замены типичных оптических линз. Электронная микроскопия использует электромагнитные линзы и катодные лучи для достижения резкого улучшения разрешения по сравнению со световой микроскопией. В отличие от ультрафиолетового и рентгеновского излучения, катодные лучи, будучи электронными пучками измеримой массы и отрицательного заряда, не относятся к электромагнитному излучению.Следовательно, фотонно-волновой дуализм и, следовательно, концепция длины волны не применимы напрямую. Одним из основных вкладов, которые привели к развитию электронной микроскопии, является теория Луи де Бройля, который заявил в своей докторской диссертации, что дуальность частица-волна также применима для материи. Согласно де Бройлю, длина волны электрона с массой m _e и скоростью c _e определяется как:

где ρ — постоянная Планка. В качестве альтернативы отражению в оптических линзах, в электромагнитных линзах для фокусировки лучей использовалось отклонение электронных лучей магнитными полями.В электронном микроскопе, подобном электронно-лучевой трубке, электронный луч испускается в вакуум за счет нагрева катода, а затем ускоряется за счет приложения напряжения между катодом и анодом. Скорость электронов и, следовательно, длину волны (см. Уравнение (5.15)) можно контролировать, изменяя напряжение. Первые электронные микроскопы схематически были очень похожи на светлопольные микроскопы. Полученное изображение основано на поглощении образцом электронов при прохождении в образец, и поэтому они были названы просвечивающими электронными микроскопами .Просвечивающие электронные микроскопы достигают разрешения до 0,2 нм. Однако основным ограничением этой схемы является то, что можно отображать только очень тонкие образцы. Сканирующая электронная микроскопия была разработана для решения этой проблемы. Для этого первичный электронный пучок фокусируется электромагнитной линзой на очень небольшую часть образца. Этот первичный пучок вызывает испускание вторичного электронного пучка. Регистрируется интенсивность этого вторичного луча. После этого первичный луч перемещается к другой части образца, и применяется тот же процесс.Это повторяется так, что весь образец сканируется в виде растрового изображения, а окончательное изображение получается из записанных значений интенсивности вторичного луча. Сканирующую электронную микроскопию можно использовать для получения изображений толстых образцов, даже если она фиксирует только детали поверхности. Кроме того, вторичный луч сопровождается рентгеновским излучением, характерным для материала, из которого он испускается. Поэтому его используют для выявления химического состава образцов. И сканирующая электронная микроскопия, и просвечивающая электронная микроскопия работают в вакууме.Следовательно, их можно использовать только для мертвых экземпляров. С этой точки зрения рентгеновская и традиционная световая микроскопия предпочтительнее электронной микроскопии. Хотя рентгеновский и электронный микроскопы обеспечивают значительное улучшение разрешения по сравнению со световыми микроскопами, они чрезвычайно дороги, требуют большого оборудования и, как правило, требуют сложной подготовки образцов.

5.9. Световая микроскопия за пределами дифракционного предела

В последние несколько лет так называемая микроскопия сверхвысокого разрешения стала активным направлением исследований.Сегодня, основанные на этой технологии, существуют микроскопы с разрешающей способностью около 10 нм. Хотя это число уступает разрешающей способности электронной микроскопии, прорыв заключается в том, что это достигается с помощью видимого света. Как указывалось ранее в этом тексте (см. Раздел 5.7), достижимое разрешение при использовании видимого света ограничено 200 нм. Можем ли мы тогда сделать вывод, что теория, которая привела к дифракционному пределу в световой микроскопии, ошибочна? Фактически, микроскопия сверхвысокого разрешения основана на попеременном включении и выключении флуоресцентных молекул в образце.Две соседние флуоресцентные молекулы на расстоянии менее 200 нм не будут разрешены как две точки в микроскопе сверхвысокого разрешения, когда обе они включены одновременно. Однако это будет так, т. е., они будут решены как две точки, если только одна из них будет активирована в определенное время, и, кроме того, есть механизм для управления этим процессом активации. Методы микроскопии сверхвысокого разрешения различаются по способу включения / выключения. Основные технологии в этой области сегодня включают: истощение стимулированного излучения (STED), обратимые насыщаемые оптические флуоресцентные переходы (RESOLFT) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM).

1

Размеры диаметра, приведенные здесь, относятся к клетке крови, типичной бактерии, вирусу гриппа, молекуле ДНК и атому урана.

2

Или другие близкие его приближения в зависимости от рассматриваемого верхнего предела числовой апертуры и определения разрешающей способности.

3

Рентгеновское и УФ излучение, являясь частью электромагнитного спектра, относятся к невидимому свету .Однако термин световая микроскопия в этом тексте ограничивается видимым светом.

Дополнительная литература

[1]

B. Альбертс и другие. Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie . Вайли-ВЧ, 2005.

[2]

р. Али и другие. «Об использовании фильтров нижних частот для обработки изображений с обратными лапласовскими моделями». В: Journal of Mathematical Imaging and Vision (2010), стр. 1–10.

[3]

Марк Обревиль и другие.«Автоматическая классификация раковых тканей в изображениях полости рта при лазерной эндомикроскопии с использованием глубокого обучения». В: Научные отчеты 7.1 (2017), s41598–017. [Бесплатная статья PMC: PMC5607286] [PubMed: 28931888]

[4]

Douglas E Чендлер и Роберт В. Роберсон. Биоимиджинг: современные концепции световой и электронной микроскопии . Jones & Bartlett Publishers, 2009.

[5]

Гай Кокс. Оптические методы визуализации в клеточной биологии .CRC Press, 2012. isbn: 978-1-4398-4825-8.

[6]

Луи Де Бройль. «Волновая природа электрона». In: Нобелевские лекции 12. (1929), стр. 244–256.

[7]

Чарльз А. ДиМарцио. Оптика для инженеров . Crc Press, 2011.

[8]

Ричард Фейнман, Роберт Лейтон и Мэтью Пески. Лекции Фейнмана по физике . Второй. Vol. 1. Бостон: Аддисон-Уэсли, 1963.

[9]

[10]

Мигель Goncalves и другие. «Значение конфокальной лазерной эндомикроскопии в диагностике поражения голосовых связок». В: Европейский обзор медицинских и фармакологических наук 21 (2017), стр. 3990–3997. [PubMed: 205]

[11]

J.W. Хороший человек. Введение в фурье-оптику . Второй. MaGraw-Hill, 1996.

[12]

Стефан В. Ад. «Микроскопия и ее фокусный переключатель».In: Природные методы 6.1 (2008), стр. 24–32. [PubMed: 1

11]

[13]

A Хоффман и другие. «Конфокальная лазерная эндомикроскопия: техническое состояние и текущие показания». В: Эндоскопия 38.12 (декабрь 2006), стр. 1275–1283. [PubMed: 17163333]

[14]

Алан Лейси. Световая микроскопия в биологии: практический подход . Второй. Oxford University Press, 1999.

[15]

Элизабет Laemmel и другие. «Волоконная конфокальная флуоресцентная микроскопия (Cell-viZio) облегчает расширенную визуализацию в области микроциркуляции.Сравнение с прижизненной микроскопией ». В: Журнал сосудистых исследований 41,5 (сен. 2004), с. 400–411. [PubMed: 15467299]

[16]

A.E. Мирский и Дж. Brachet. Ячейка: биохимия, физиология, морфология . Под редакцией Жана Браше [и] Альфред Э. Мирский. Academic Press, 1959.

[17]

Firas Муалла и другие. «Автоматическое обнаружение клеток на изображениях под микроскопом в светлом поле с использованием SIFT, случайных лесов и иерархической кластеризации».In: IEEE Transactions on Medical Imaging 32.12 (2013), стр. 2274–2286. DOI: 10.1109 / TMI.2013.2280380. [PubMed: 24001988] [CrossRef]

[18]

Firas Муалла и другие. «Неконтролируемое обнаружение неокрашенных клеток с помощью кластеризации ключевых точек SIFT и алгоритма самомаркировки». В: Lecture Notes in Computer Science, Volume 8675, MICCAI 2014 Proceedings, Part III . Эд. автор: П. Голланд и другие. Бостон, Массачусетс, США, 2014 г., стр. 377–384. [PubMed: 25320822]

[19]

Фирас Муалла и другие.«Использование структуры низкочастотного моногенного сигнала для классификации клеток / фона на множественных линиях клеток на изображениях микроскопа в ярком поле». В: Международный журнал компьютерной радиологии и хирургии 9.3 (2014), стр. 379–386. DOI: 10.1007 / s11548-013-0969-5. [PubMed: 24327236] [CrossRef]

[20]

Дуглас Б. Мерфи. Основы световой микроскопии и электронной визуализации . John Wiley & Sons, Inc., 2002. ISBN: 9780471234296.

[21]

Николай Oetter и другие.«Разработка и проверка системы классификации и оценки для диагностики плоскоклеточного рака полости рта с помощью конфокальной лазерной эндомикроскопии». В: Журнал трансляционной медицины 14.1 (июль 2016), с. 1–11. [Бесплатная статья PMC: PMC4891821] [PubMed: 27255924]

[22]

Фрэнк Л. Педротти, Лено М. Педротти и Лено С. Педротти. Введение в оптику . 3-е изд. Бенджамин Каммингс, 2006. ISBN: 0131499335.

[23]

Габриэль Попеску. Количественная фазовая визуализация клеток и тканей . McGraw-Hill, 2011.

[24]

Саймон Schöll и другие. «Влияние фазового эффекта на градиентные и статистические измерения фокуса в светлопольной микроскопии». В: Журнал микроскопии 254.2 (2014), стр. 65–74. DOI: 10.1111 / jmi.12118. [PubMed: 24611652] [CrossRef]

[25]

Майкл Рид Тиг. «Детерминированное восстановление фазы: решение функции Грина». В: JOSA 73.11 (1983), стр. 1434–1441.

[26]

Лаура Уоллер, Лей Тиан и Джордж Барбастатис. «Транспорт интенсивности фазово-амплитудных изображений с производными интенсивности более высокого порядка». В: Опт. Экспресс 18.12 (июнь 2010), стр. 12552–12561. [PubMed: 20588381]

[27]

Цян Ву, Фатима А. Торговец и Кеннет Р. Castleman. Обработка изображений микроскопов . Burlington: Academic Press, 2008.

Увидеть маленькое: как микроскоп все изменил

Когда голландские производители очков впервые создали микроскоп около 1600 года, они открыли скрытый мир крошечных организмов! Кто мог представить себе, что такие монстры живут вне поля зрения? Но первые микроскопы предлагали только небольшое увеличение и размытые изображения; потребовались бы усовершенствования Роберта Хука, чтобы превратить новинку, которая пользовалась любопытными открытиями, в серьезный научный инструмент.

Кем был Роберт Гук?
Английский философ Роберт Гук опубликовал Micrographia : в 1665 году и сделал микроскопию сенсационным. Обильно иллюстрированная книга широко варьировалась от конструкции самих микроскопов до цветового спектра, кристаллической структуры объектов и анатомии насекомых. Здесь Гук описал и проиллюстрировал тонкий отрез пробки, который, по его словам, был «весь перфорированный и пористый, очень похожий на соты для меда».Его пористая структура напомнила ему небольшие монастырские комнаты, или целла (по-латыни), поэтому он назвал их «кельями», основной единицей жизни. Несмотря на некоторые ранние наблюдения за бактериями и клетками, микроскоп повлиял на другие науки, особенно на ботанику и зоологию, больше, чем на медицину. Важные технические усовершенствования 1830-х годов и позже исправили плохую оптику, превратив микроскоп в мощный инструмент для наблюдения за болезнетворными микроорганизмами.

Листер и ахроматический микроскоп
В 1830 году виноторговец и ученый-любитель Джозеф Джексон Листер * представил микроскопические линзы, которые устраняли размытость и искажение цвета, характерные для микроскопов с более высоким увеличением.Прорыв Листера — «ахроматическая» линза превратила микроскоп в мощный инструмент, способный к гораздо большему увеличению. Так уж получилось, что Dittrick демонстрирует то же самое время микроскопа! Огромные улучшения совпали с появлением бактериологии, движимой работами Пастера и Коха, и к 1880-м годам микроскоп стал важным инструментом врачей в повседневной практике выявления патогенов. Эта новаторская работа позволила легко идентифицировать эпидемические и эндемические заболевания; Как только врачи поймут, что вызывает болезнь, они смогут бороться с ее распространением с помощью карантина, дезинфекции, вакцин и антибиотиков.Так родилось общественное здоровье!

The Cleveland Connection
Дадли Питер Аллен (в честь которого названа Мемориальная медицинская библиотека Аллена) приобрел микроскоп типа Эдмунда Хартнака (около 1881 г.) в Берлине во время своего медицинского «большого турне» по Европе (1880–1882 гг.). Аллен из первых рук узнал о захватывающих достижениях в области антисептической хирургии и медицинских наук, в том числе о выдающейся работе в области бактериологии Роберта Коха (который также владел микроскопом Хартнака). Аллен использовал этот микроскоп для изучения подготовленных образцов патологии, в частности, в лаборатории Клеменса фон Кальдена, патолога и эксперта по микротехнике во Фрайбурге, Германия.Более того, он проследил образцы и вернулся в Кливленд с полноцветными записными книжками, иллюстрирующими различные образцы болезней, от инфекционных заболеваний, таких как туберкулез, до различных новообразований или рака.

Представьте себе мир, в котором мы не можем идентифицировать болезнетворные бактерии или раковые клетки? Патология, бактериология, даже судебная медицина и генетика — все в большом долгу перед скромным микроскопом. То, что начиналось как стеклянная бусина для увеличения, превратилось в сложные телескопы, которые позволяют нам видеть даже мельчайшие частицы нашего мира!

Что такое электронная микроскопия? — Медицинское училище УМАСС

Электронная микроскопия (ЭМ) — это метод получения изображений с высоким разрешением биологических и небиологических образцов.Он используется в биомедицинских исследованиях для детального изучения структуры тканей, клеток, органелл и макромолекулярных комплексов. Высокое разрешение ЭМ-изображений является результатом использования электронов (которые имеют очень короткие длины волн) в качестве источника освещающего излучения. Электронная микроскопия используется в сочетании с различными вспомогательными методами (например, тонкие срезы, иммуно-маркировка, отрицательное окрашивание) для ответа на конкретные вопросы. ЭМ-изображения предоставляют ключевую информацию о структурных основах функции клеток и клеточных заболеваний.

Существует два основных типа электронных микроскопов — просвечивающая ЭМ (ПЭМ) и сканирующая ЭМ (СЭМ). Просвечивающий электронный микроскоп используется для просмотра тонких образцов (срезов тканей, молекул и т. Д.), Через которые могут проходить электроны, создавая проекционное изображение. ТЕМ во многом аналогичен обычному (составному) световому микроскопу. ПЭМ используется, среди прочего, для изображения внутренней части клеток (в шлифах), структуры белковых молекул (контрастирующей с металлическими тенями), организации молекул в вирусах и филаментов цитоскелета (полученных методом отрицательного окрашивания), и расположение белковых молекул в клеточных мембранах (путем замораживания-разрушения).

Обычная сканирующая электронная микроскопия зависит от испускания вторичных электронов с поверхности образца. Из-за большой глубины резкости сканирующий электронный микроскоп является электромагнитным аналогом светового стереомикроскопа. Он обеспечивает подробные изображения поверхностей клеток и целых организмов, которые невозможно выполнить с помощью ПЭМ. Его также можно использовать для подсчета частиц и определения размера, а также для управления технологическим процессом. Он называется сканирующим электронным микроскопом, потому что изображение формируется путем сканирования сфокусированным электронным лучом на поверхность образца в виде растрового изображения.Взаимодействие первичного электронного пучка с атомами у поверхности вызывает испускание частиц в каждой точке растра (например, вторичных электронов низкой энергии, электронов обратного рассеяния высокой энергии, рентгеновских лучей и даже фотонов). Их можно собирать с помощью различных детекторов, а их относительное количество переводится в яркость в каждой эквивалентной точке электронно-лучевой трубки. Поскольку размер растра на образце намного меньше, чем размер экрана ЭЛТ, окончательное изображение представляет собой увеличенное изображение образца.Соответствующим образом оборудованные SEM (с детекторами вторичного рассеяния, обратного рассеяния и рентгеновского излучения) могут использоваться для изучения топографии и атомного состава образцов, а также, например, поверхностного распределения иммуно-меток.

Какие бывают 5 типов микроскопов и их применение

Вы когда-нибудь задумывались, как выглядят мельчайшие объекты вблизи? Из-за одной крупинки сахара в кофе, прядки волос или клеток щек вы не можете увидеть эти вещи и внимательно изучить их невооруженным глазом.Если эти предметы уже трудно осмотреть, что еще из более мелких частей организма и других вещей, которые кажутся почти невидимыми? Для этого и нужны микроскопы.

Что такое микроскоп?

Микроскоп (от древнегреческих слов mikrós или «маленький» и skopeîn или «смотреть или видеть») — это инструмент, который используется для просмотра более мелких объектов, которые может видеть человеческий глаз. Микроскопия — это научная область исследования, которая используется для изучения мельчайших структур и объектов под микроскопом.

Захариас Янссен открыл первый составной микроскоп в 16 веке. Поместив объект в конец трубки и поместив две линзы сверху и снизу трубки, Захария и его отец Ганс поняли, что объект стал увеличиваться. Благодаря этому открытию были сделаны новые прорывы и инновации, которые привели к микроскопам, которые мы используем сегодня.

Как работают микроскопы?

Самые простые микроскопы, используемые сегодня в различных учреждениях, используют серию линз, которые собирают, отражают и фокусируют свет на образец, который является исследуемым объектом.Без света микроскопы не работают. Такой микроскоп обычно используется в исследовательских центрах, школах и больницах.

Использование различных линз микроскопа способствует увеличению без изменения качества получаемого изображения. Помимо увеличения линзы, также важно определить поле зрения микроскопа, чтобы точно измерить размер вашего образца. Кроме того, у большинства микроскопов есть бинокулярные линзы, состоящие из двух линз и призмы для разделения изображения на оба окуляра, через которые вы будете смотреть.

На другом конце микроскопа расположены линзы объектива, которые отвечают за сбор и концентрацию света в образце. Эти линзы объектива имеют разную силу, и их можно использовать по одной, регулируя револьверную головку.

Инструмент, называемый окуляром, увеличивает объект, изменяя длину волны света, которая используется в инструменте для его функционирования. Существует множество типов окуляров, каждый из которых выполняет разные задачи. Наиболее распространены окуляры, в которых для подачи света используется технология газового вытеснения.Следующий распространенный окуляр — модель с газовой коррекцией. Третий распространенный окуляр — модель фотоэлемента.

Существуют и другие типы окуляров, которые используются в зависимости от потребностей проводимого эксперимента. Узнав, как работает микроскоп, исследователи смогут использовать эти окуляры в своих экспериментах, что позволит лучше изучить природу и ее работу.

Микроскопы обычно питаются от батареек или механических механизмов, что позволяет наблюдать объекты в 10 раз меньше их первоначального размера.Если с микроскопическим образцом обращаться неправильно или ненадлежащим образом, это может исказить изображение и дать неверные результаты. Поэтому использование микроскопа правильного типа и правильное обращение с ним важно для просмотра выбранного объекта.

Вот пять типов микроскопов, их особенности и применение:

1. Простой микроскоп

Простой микроскоп — это просто большое увеличительное стекло с более коротким фокусным расстоянием, которое имеет выпуклое зеркало с небольшой фокусной площадью .Наиболее распространенными примерами устройств этого типа являются переносной объектив и линза окуляра.

Когда материал находится близко к линзе микроскопа, создается его фокус, и исходный объект становится увеличенным и более прямым. Затем он фокусируется на части материала, сводя вместе два края линзы. Это создает меньшее, более сфокусированное изображение материала, чем большая область.

Поскольку это всего лишь простой микроскоп, у него есть только один уровень увеличения в зависимости от того, какой объектив используется.Поэтому простые микроскопы используются только для чтения и увеличения несложных предметов. Например, вы можете использовать увеличительное стекло для увеличения деталей карты.

2. Составной световой микроскоп

Составной микроскоп — это наиболее распространенный тип микроскопов, используемый сегодня, механизм которого описан ранее. По сути, это микроскоп с линзой или камера, между которыми находится составная среда. Эта составная среда позволяет увеличивать изображение в очень мелком масштабе.

В то время как простому микроскопу требуется только естественный свет, чтобы увидеть объект, сложному световому микроскопу требуется осветитель для просмотра образца. Это основные характеристики составного микроскопа:

• Увеличение: Это касается увеличения изображения образца в микроскоп за счет увеличения линз. Увеличение — это количественное свойство, которое варьируется от 40x, 100x, 400x и до 1000x.
• Разрешение: Это относится к тому, насколько хорошо изображение захватывается составной линзой микроскопа.Более высокое разрешение означает, что изображение будет более четким и детальным. Кроме того, он имеет улучшенную визуальную четкость, поскольку имеет больше слоев увеличения.
• Контраст: Как и в фотографии, темнота фона относительно фокуса или образца называется контрастом. Превосходный контраст обычно достигается путем окрашивания образца, чтобы его цвета выделялись при просмотре в микроскоп.

Составные микроскопы чрезвычайно полезны для исследований в различных областях.Это оказало большое влияние на науку и технологии в целом. Некоторые из его популярных применений — это просмотр научного образца в образовательных и исследовательских целях. Если вы собираетесь учиться в медицинском вузе, вы часто встречаетесь с микроскопом такого типа на уроках.

3. Стереомикроскоп

Стереомикроскоп, рассекающий или стереоскопический микроскоп, представляет собой версию оптической микроскопии, разработанную специально для получения изображений биологического образца с низким увеличением.Он работает через отражение света от поверхности образца, а не через его среду.

Этот тип микроскопа часто используется в химических лабораториях, где требуются более подробные трехмерные изображения, которые можно было бы получить с помощью электронного микроскопа или другого мощного микроскопа. Хотя технология стереомикроскопии существует уже более 100 лет, стереомикроскопы только недавно появились в лаборатории и могут производить изображения более высокого качества, чем когда-либо прежде.

Многие люди предпочитают стереоскопы другим моделям микроскопов, поскольку они позволяют получать изображения более высокого качества в зависимости от потребностей. Кроме того, эти модели микроскопов требуют меньше обслуживания и стоят недорого. Применение стереомикроскопов связано с менее тщательными требованиями к микроскопии, такими как просмотр производственных материалов, работа с печатными платами, рассечение и осмотр.

4. Растровый электронный микроскоп (SEM)

Растровый электронный микроскоп — очень популярный тип растрового электронного микроскопа, который создает изображения материала путем сканирования образца мощным пучком электронов.Электроны, взаимодействующие с атомами в образце, создают различные сигналы, которые содержат данные о структуре и топографии материала. Изображения, полученные с помощью этих микроскопов, отличаются высокой точностью, а также их можно просматривать с высоким разрешением с помощью окуляра микроскопа или лупы.

Чтобы получить соответствующие результаты с помощью SEM, образец или образец должен иметь электрическую проводимость, чтобы электроны отражались от его поверхности, создавая таким образом четкое изображение.Чтобы образец стал достаточно электропроводящим, его покрывают тонким слоем металла, например золота.

Для повышения качества изображения SEM можно использовать несколько методов, таких как: флуоресцентная визуализация, электронная микроскопия с наконечником, многолучевое сканирование и использование коллоидных кристаллов.

Кроме того, важно использовать микроскоп в хорошем рабочем состоянии, так как это снизит качество получаемых изображений. Имея все это на месте, у вас может быть отличный инструмент, который позволит вам просматривать и исследовать минимально возможный образец.

Ниже перечислены лучшие применения и применения сканирующего электронного микроскопа:

• Проверка полупроводников
• Материаловедение
• Медицина
• Судебно-медицинская экспертиза
• Отбор проб почвы и горных пород
• Нанопроволоки для обнаружения газов
• Art

5. Просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ)

Просвечивающая электронная микроскопия — это метод оптической микроскопии, при котором электрический луч электронов пропускается через неокрашенный образец для создания оптического изображения образца.Вместо того, чтобы посылать электроны для сканирования и отражения от образца, как это делают SEM, TEM позволяют электронам проходить через тонкий образец. Образец обычно представляет собой ультратонкий срез толщиной менее 50 микрометров или суспензию электролита, подвешенную на сетке из пластин в виде сетки.

В отличие от обычных составных микроскопов, ПЭМ имеют удивительное увеличение, которое, возможно, в 10 000 раз больше, чем у оптических микроскопов, что позволяет исследователям просматривать исключительно маленькие образцы.Он даже может проиллюстрировать расположение атомов в образце.

Из-за сложности ТЕА они чрезвычайно технически и дороги. У студентов обычно нет доступа к этому типу микроскопа, поскольку они предназначены для ученых, выполняющих сложную работу в области нанотехнологий, медицинских исследований, наук о жизни, биологических исследований, материаловедения, геммологии и металлургии.

Однако образцы требуют тщательной подготовки, когда они должны быть помещены в вакуумную камеру.