Виды электронной микроскопии: ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП | Энциклопедия Кругосвет

Электронный микроскоп — Википедия

Электронный микроскоп. Модель 1960-х годов

Электро́нный микроско́п (ЭМ) — прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 10⁶ раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока, пучка электронов с энергиями 200 эВ — 400 кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ).

Вследствие того, что длина волны де-Бройля электронов, ускоренных в электрическом поле c разностью потенциалов 1000 В, (0,4 Å)много меньше длины волн видимого света^[1], разрешающая способность электронного микроскопа в 1000—10000 раз превосходит разрешение традиционного светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи магнитного поля.

История развития электронного микроскопа

В 1931 году Р. Руденберг получил патент на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 году М. Кнолль и Э. Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Э. Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике, которую присудили ему и изобретателям сканирующего зондового микроскопа Герду Карлу Биннигу и Генриху Рореру. Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-х годов и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens.

В конце 1930-х — начале 1940-х годов появились первые растровые электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-х годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

Значительным скачком (в 1970-х годах) в развитии было использование вместо термоэмиссионных катодов — катодов Шоттки и катодов с холодной автоэмиссией, однако их применение требует значительно большего вакуума.

В конце 1990-х — начале 2000-х компьютеризация и использование ПЗС-детекторов значительно упростили получение изображений в цифровом виде.

В последнее десятилетие в современных передовых просвечивающих электронных микроскопах используются корректоры сферических и хроматических аберраций, вносящих основные искажения в получаемое изображение. Однако их применение может значительно усложнять использование прибора.

Виды приборов

Просвечивающая электронная микроскопия

В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB₆, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80—200 кэВ (используются различные напряжения от 20 кВ до 1 МВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет.

Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фотопластинке или ПЗС-камере.

Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100 нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.

Просвечивающая растровая (сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ)

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия

В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Окрашивание

В своих наиболее распространенных конфигурациях, электронные микроскопы дают изображения с отдельным значением яркости на каждый пиксель, с результатами, как правило, изображенными в оттенках серого. ^[2] Однако, часто эти изображения затем раскрашены посредством использования программного обеспечения, или просто ручным редактированием с помощью графического редактора. Это делается обычно для эстетического эффекта или для уточнения структуры и, как правило, не добавляет информацию об образце.

[3]

Ультраструктура неонатальных кардиомиоцитов после аноксии-реоксигенации

В некоторых конфигурациях о свойствах образца можно собрать больше информации на каждый пиксель, благодаря использованию нескольких детекторов. ^[4] В СЭМ, атрибуты топографии и рельефа материала могут быть получены с помощью пары электронных детекторов отражения и такие атрибуты могут быть наложены в единое цветное изображение, с присвоением разных первичных цветов для каждого атрибута. ^[5] По аналогии, сочетаниям отраженного и вторичного электронного сигнала могут быть присвоены различные цвета и наложены на один цветной микрограф, одновременно показывающий свойства образца. ^[6]

Изображение муравья в сканирующем электронном микроскопе

Некоторые типы детекторов, используемых в СЭМ, имеют аналитические возможности и могут обеспечить несколько элементов данных на каждом пикселе. Примерами являются детекторы, используемые в элементном анализе, и системы катодолюминесцентных микроскопов, которые анализируют интенсивность и спектр электронно-стимулированной Люминесценция в (например) геологических образцах. В системах СЭМ использование этих детекторов является общим для цветового кода сигналов и накладывают их в единое цветное изображение, так что различия в распределении различных компонентов образца можно ясно видеть и сравнивать. Дополнительно, стандарт вторичных электронных изображений может быть объединен с одним или более композиционными каналами, так что можно сравнить структуру и состав образца.

Такие изображения могут быть сделаны с сохранением полной целостности исходного сигнала, который не изменяется в любом случае.

Недостатки

Электронные микроскопы дороги в производстве и обслуживании, но общая и эксплуатационная стоимость конфокального оптического микроскопа сравнима с базовыми электронными микроскопами. Микроскопы, направленные на достижение высоких разрешений, должны быть размещены в устойчивых зданиях (иногда под землей) и без внешних электромагнитных полей. Образцы в основном должны рассматриваться в вакууме, так как молекулы, составляющие воздух, будут рассеивать электроны. Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном высоковакуумном режиме, как правило, изображают проводящий образец; Поэтому непроводящие материалы требуют проводящее покрытие (золото / палладий, сплав углерода, осмий, и т.д.). Режим низкого напряжения современных микроскопов делает возможным наблюдение непроводящих образцов без покрытия. Непроводящие материалы могут быть изображены также переменным давлением (или окружающей средой) сканирующего электронного микроскопа.

Сферы применения

Полупроводники и хранение данных Редактирование схем Метрология 3D Анализ дефектов Анализ неисправностей Биология и биологические науки

Научные исследования Квалификация материалов Подготовка материалов и образцов Создание нанопрототипов Нанометрология Тестирование и снятие характеристик устройств Исследования микроструктуры металлов Промышленность

Основные мировые производители электронных микроскопов

Delong Group — Чехия KYKY — Китай Nion Company — США FOCUS GmbH — Германия ОАО «SELMI» — Украина

См. также

Примечания

Ссылки

Виды электронных микроскопов.

Многообразие явлений, требующих изучения при помощи элек­тронной микроскопии, определяет разнообразие и специфику ее методов и соответствующих устройств. Мы уже знакомы с принципом действия просвечивающего электронного микроскопа. С его помощью можно исследовать тонкие образцы, пропускающие падающий на них пучок электронов.

В ряде случаев и в первую очередь для исследования массивных объектов применяются электронные микроскопы других типов.

Эмиссионный электронный микроскоп формирует изображение с помощью электронов, испускаемых самим объектом. Такое испускание достигается путем нагревания объекта (термоэлектронная эмиссия), освещения его (фотоэлектронная эмиссия), бомбардировки электро­нами или ионами (вторичная электронная эмиссия), а также помещением его в сильное электрическое поле (автоэлектронная эмиссия). Увеличенное изображение формируется подобно тому, как это делается в микроскопе просвечивающего типа. Образование изо­бражения в эмиссионном электронном микроскопе происходит в основном за счет различного испускания электронов микроучастками объекта. При эмиссионных исследованиях объектов разрешающая спо­собность микроскопов составляет 300А.

Эмиссионная электронная микроскопия нашла широкое приме­нение в исследованиях и разработках катодов электровакуумных приборов различного, в том числе радиолокационного применения, а также в физических исследованиях металлов и полупроводников.

В отражательном электронном микроскопе изображение созда­ется с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта. Образование изображения в нем обусловлено разли­чием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от материала и микрорельефа. Обычно образцы получаются под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности.

Практиче­ски на электронных микроскопах такого типа достигнуто разрешение порядка 100 ангстрем.

Одна из особенностей отражательного электронного микро­скопа — различие увеличений в различных направления вдоль плоскости объекта связано с наклонным положением объекта по от­ношению к оптической оси микроскопа. Поэтому увеличение такого микроскопа характеризуют обычно двумя величинами: увеличением в плоскости падения пучка электронов и увеличением в плоскости, пер­пендикулярной плоскости падения.

Растровый электронный микроскоп основан на использовании предварительно сформированного тонкого электронного луча (зонда), положением которого управляют с помощью электромагнитных полей. Это управление (сканирование) во многом аналогично процессу раз­вертки в телевизионных кинескопах. Электронный зонд последовательно проходит по поверхности исследуемого образца. Под воздействием электронов пучка происходит ряд процессов, характер­ных для данного материала и его структуры. К их числу относятся рассеяние первичных электронов, испускание (эмиссия) вторичных электронов, появление электронов, прошедших сквозь объект (в слу­чае тонких объектов), возникновение рентгеновского излучения. В ряде специальных случаев (люминесцирующие материалы, полупро­водники) возникает также световое излучение. Регистрация электронов, выходящих из объекта, а также других видов излучения (рентгеновского, светового) дает информацию о различных свойствах микроучастков изучаемого объекта. Соответственно этому системы индикации и другие элементы растровых микроскопов различаются в зависимости от вида регистрируемого излучения.

Синхронно с разверткой электронного зонда осуществляется развертка луча большого кинескопа. Рассмотрим работу растрового электронного микроскопа в режиме индикации тока вторичных элек­тронов. В этом случае величина вторичного электронного тока определяет глубину модуляции яркости на экране кинескопа. Растро­вый электронный микроскоп такого типа позволяет получить увеличение 100 100 000 при достаточной контрастности изобра­жения. Разрешающая способность растровых электронных микроскопов определяется диаметром электронного зонда и в случае получения изображения в электронных лучах составляет 300À. Растровые элек­тронные микроскопы позволяют изучать, например, так называемые p-n переходы в полупроводниках.

Из электронных микроскопов упомянем зеркальный электронный микроскоп, основной особенностью которого является чувствитель­ность к микроскопическим электрическим и магнитным полям на отражающем массивном объекте. При этом достигается разрешение деталей порядка 1000А и увеличение почти в 2000*. Работа такого микроскопа основана на действии микроскопических электрических и магнитных полей на электронный поток. Зеркальный электронный мик­роскоп позволяет изучать, например, доменную структуру ферромагнитных материалов, структуру сегнетоэлектриков.

В теневом электронном микроскопе, так же как и в растровом, формируется электронный зонд, однако положение его остается неиз­менным. Электронные лучи зонда служат для получения увеличенного теневого изображения объекта, помещенного в непосредственной бли­зости от зонда. Образование изображения обусловлено рассеянием и поглощением электронов различными участками объекта. Следует от­метить, что интенсивность конечного изображения в теневом электронном микроскопе незначительна, поэтому обычно в них исполь­зуются усилители света типа электронно-оптических преобразо­вателей.

Важной разновидностью электронных микроскопов растрового типа является микрорентгеноспектральный анализатор. Прибор осно­ван на возбуждении так называемого характеристического рентгеновского излучения атомов малого участка поверхности — об­разца с помощью тонкого высокоскоростного электронного зонда. Электронный зонд с помощью системы развертки обегает исследуе­мую поверхность. При торможении электронов на поверхности возникает наряду с так называемым тормозным излучением характери­стическое рентгеновское излучение, свойства которого существенно определяются строением электронных оболочек в атомах вещества. Это излучение обязано своим возникновением энергетическим перехо­дом между глубокими энергетическими уровнями атомов.

Возникающее характеристическое излучение регистрируется с помощью рентгеноспектральной аппаратуры. Диаметр электронного зонда может изменяться от 360 до 0,5 мкм, а размер просматриваемой площадки представляет собой квадрат со стороной 360, 180, 90 или 45 мкм. В одном из приборов такого типа скорость анализа по одному хи­мическому элементу соответствует движению зонда 8 или 96 мкм/мин (при механическом перемещении объекта). Анализировать можно все элементы периодической системы элементов Менделеева, легких (от атомного номера 11 — натрия).минимальный объем вещества, поддаю­щегося количественному анализу, составляет 0,1 мкг. С помощью микрорентгеновского анализатора получают распределение физико-химического состава вдоль исследуемой поверхности.

В СССР серийно выпускается (выпускался) микрорентгеновский анализатор типа МАР-1 (диаметр зонда около 1 мкм, наименьшая ана­лизируемая площадь 1мкм2). Приборы такого вида находят применение в электронной промышленности и в других областях науки и техники.

Читатель, видимо, обратил внимание на тот факт, что в элек­тронных микроскопах не достигается разрешающая способность, предсказываемая теорией. В чем же дело? Вспомним, что в формиро­вании изображения в электронных микроскопах важную роль играют элементы электронной оптики, позволяющие осуществлять управле­ние электронными пучками. Этим элементам — электронным линзам свойственны различного рода отклонения от идеального (требуемого расчетом) распределения электрических и магнитных полей. Положе­ние здесь во многом аналогично ограничениям в оптической микроскопии, связанным с неточностью изготовления оптических линз, зеркал и других элементов. Кроме того, ряд трудностей связан с осо­бенностями изготовления и работы источников электронных потоков (катодов), а также с проблемой создания потоков, в которых электроны мало отличаются по скоростям. В соответствии с этими фактами, дей­ствующими в реальных условиях, различают определённые виды искажений в электронных микроскопах, используя при этом терминоло­гию, заимствованную из световой оптики.

Основными видами искажений электронных линз в просвечи­вающих микроскопах являются сферическая и хроматическая аберрации, а также дифракция и приосевой астигматизм. Не останав­ливаясь на происхождении различных видов искажений, связанных с нарушениями симметрии полей и взаимным расположением элементов электронной оптики, упомянем лишь о хроматической аберрации. По­следний вид искажений аналогичен возникновению окрашенных изображений в простых биноклях и лупах. Использование спектрально чистого монохроматического света в оптике (вместо белого) устраняет этот вид искажений. Аналогично этому в электронной микроскопии ис­пользуют по возможности пучки электронов, скорости которых отличаются мало (вспомним соотношение =h/(mv) для электрона!). Этого достигают применением высокостабильных источников элек­трического питания.

Близким “родственником” электронного микроскопа является электронограф прибор, использующий явление дифракции элек­тронов, той самой дифракции, которая в своё время подтвердила наличие волновых свойств у электронов и ставит в наши дни предел разрешения в электронном микроскопе. В случае электронов объек­тами, в которых может происходить дифракция на периодической структуре (аналогичной объёмной дифракционной решётке в оптике), служат кристаллические структуры. Известно, что в кристаллах атомы расположены в строгом геометрическом порядке на расстояниях по­рядка единиц ангстрем. Особенно правильно это расположение в так называемых монокристаллах. При взаимодействии электронов с та­кими структурами возникает рассеяние электронов в преимуществен­ных направлениях в соответствии с предсказываемыми теорией соотношениями. Регистрируя рассеянные электроны (например, фотографируя их), можно получать информацию об атом­ной структуре вещества. В современных условиях электронография широко применяется при исследованиях не только твёрдых, но и жид­ких, газообразных тел. О виде получаемых электронограмм можно судить по фотографиям (см. рис.6).

Рис. 6. Электорнограмма высокого разрешения (окись цинка):

вверху электронограмма; внизу увеличенное изображение участка А.

В нашей стране и за рубежом применяются специализированные электронографы промышленного типа. Кроме того, в некоторых элек­тронных микроскопах предусмотрена возможность работы в режиме электронографии.

Следует заметить, что с точки зрения физики получение элек­тронограмм представляет собой процесс, во многом близкий процессу получению рентгенограмм в рентгеноструктурном анализе. Действи­тельно, если в электрографии используется дифракция электронов, то в рентгеноструктурном анализе происходит дифракция рентгенов­ских лучей на атомных структурах. Естественно, что каждый из этих методов имеет свою область применения.

Глава 2

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ

И ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Гистология, цитология и эмбриология имеют собственные методы ис­следования, как классические, так и современные. Эти методы исследова­ния используются не только для изучения строения и функций клеток, тканей и органов, но и находят все более широкое применение в клиничес­кой практике. Все они базируются на микроскопии гистологических объек­тов, обработанных специальными способами. Поэтому условно гистологи­ческие методы исследования можно разделить на микроскопические (мик­роскопическая техника) и методы обработки гистологического препарата, подготовки его к микроскопированию(гистологическая техника).

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Для гистологических исследований используется прибор МИКРО­СКОП. В зависимости от того, что используется для просвечивания гис­тологического объекта, различают две основные группы микроскопов: све­товые иэлектронные. В световых микроскопах для просвечивания объекта используется световой поток. Для электронной микроскопии в этих целях применяется пучок электронов.

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Подробно устройство светового микроскопа изучается на кафедре био­логической и медицинской физики. Общий вид светового микроскопа по­казан на рис. 2.1.

Световая микроскопия подразделяется на стандартную световую микроскопию испециальные методы световой микроскопии. В обо­их случаях световой поток, проходя черезконденсор микроскопа, концент­рируется, далее проходит через гистопрепарат, изменяясь за счет различий пре­ломления гистоструктур препарата. Затем пучок света идет черезобъектив, в котором формируется изображение. Далее изображение увеличивается систе­мой линз окуляра, после чего воспринимается глазом (Рис. 2.2)

Любой микроскоп имеет два основных показателя, характеризующих его возможности:

1. Общее увеличение микроскопа — соотношение между линейными размерами полученного в микроскопе изображения объекта и истинными размерами этого объекта. Оно определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра микроскопа. Общее увеличение светово­го микроскопа может теоретически достигать 2500 раз, нополезное увели­чение, т.е. увеличение, позволяющее выявить детали строения гистологи­ческого объекта, составляет не более 1500 раз.

2. Разрешающая способность — наименьшее расстояние между двумя точками объекта, на котором они видны раздельно. Разреша­ющая способность является более важным показателем микроскопа, чем его увеличение. Повышая разрешающую способность, т.е. уменьшая расстояние раздельного восприятия двух точек гистологического объекта, исследователь будет видеть все более мелкие детали.

Разрешающая способность микро­скопа определяется по формуле: d= Х/2, гдеel— расстояние раздельного видения точек объекта,~к — длина волны.

Из формулы следует, что для повышения разрешающей способности микроскопа нужно использовать источник света с очень малой длиной волны. Это подтолкнуло ученых к поиску способов увеличить разрешаю­щую способность микроскопа через уменьшение длины волны источника света (ультрафиолетовая и люминесцентная микроскопия), а также к от­крытию электронного микроскопа, в котором вместо видимого света стали использовать пучок электронов, имеющий очень короткую длину волны.

ВИДЫ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

1. Стандартный световой микроскоп. В стандартном световом микро­скопе для просвечивания гистологических объектов используется видимая часть спектра света. Длина ее волны в среднем равна 0,4 мкм. Следова­тельно, разрешающая способность светового микроскопа равна примерно 0,2 мкм, а его общее увеличение составляет около 2500 раз (полезное —1500 раз).

2. Ультрафиолетовая микроскопия. В данном случае для просвечива­ния объекта используется ультрафиолетовая часть спектра, имеющая дли­ну волны 0,2 мкм. Таким образом, разрешающая способность этого мик­роскопа равна 0,1 мкм, что в 2 раза выше, чем у обычного микроскопа. Так как полученное изображение невидимо для глаза, то оно регистрируется на фотопластинке или люминесцентном экране.

3. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Это метод микроскопии, в котором используется явлениелюминесценции, или све­чения некоторых веществ при воздействии на них коротковолновых лучей. Поглощая коротковолновое излучение, молекулы этих веществ переходят в возбужденное состояние и сами начинают излучать свет, который имеет длину волны большую, чем длина волны возбуждающего света. Такой свет и регистрируется в люминесцентном микроскопе. Коротковолновое излуче­ние и свет люминесценции разделяются при помовш светофильтров. Раз­личаютаутолюминесценцию (первичную люминесценцию) инаведенную (вторичную) люминесценцию. При аутолюминесценции гистологический объект испускает свет люминесценции без предварительной обработки. Любая клетка живого организма обладает собственной люминесценцией, которая, однако, в большинстве случаев очень слабая и трудно регистри­руется. При наведенной люминесценции объект обрабатывается специ­альными люминесцирующими красителями, которые связываются с клет­ками и тканями организма, делая их видимыми. Примером такого краси­теля являетсяакридиновый оранжевый. Он достаточно прочно связывается с нуклеиновыми кислотами и вызывает красное свечение РНК и зеленое — ДНК. В комплект современных люминесцентных микроскопов включают­ся фотометрические насадки, позволяющие измерять интенсивность люми­несценции, что дает возможность количественного определения связываю­щего люмииесцирующии краситель вещества.

4. Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроско­пе падающий на объект световой поток раздваивается. При этом одна его часть идет на объект, а другая — минуя его. Затем два пучка вновь соеди­няются, и при этом возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно определить точ­ную концентрацию вещества в клетке. Таким образом, интерференцион­ный микроскоп также позволяет осуществлять количественные морфоло­гические исследования.

5. Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок при пом.ощи специальных призм(призмы Николя) разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры со строгой ориентацией молекул, световые лучи запаздывают относительно друг друга в результате неодинакового их пре­ломления. Далее пучок света пропускается через анализатор, который оп­ределяет степень отклонения поляризации света при прохождении через объект. Это позволяет определить характер расположения молекул, на­пример, в миофибриллах, а также наблюдать спиральные или не видимые при других методах исследования структуры.

6. Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, который имеет фазово-контрастное устройство. В нем использо­ван принцип неодинакового изменения фаз световых лучей при прохождении их через разные по плотности структуры изучаемого объекта (рис. 2.3). При этом происходит смещение фаз световых волн, что приводит к повыше­нию контрастности структур объекта и позволяет рассматривать неокра­шенные и живые клетки. Разновидностью фазово-контрастного микро­скопа является темнопольный микроскоп, который дает негативное изображение по сравнению с позитивным фазовоконтрастным изобра­жением.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ И ЕЕ ВИДЫ

Электронная микроскопия использует для «просвечивания» морфологи­ческих объектов пучок электронов. Пучок электронов испускается электрон­ной пушкой в условиях высокого вакуума и ускоряющего напряжения. Да­лее этот пучок фокусируется при помощи электромагнитов (электромаг­нитные линзы). Сфокусированный пучок направляется на изучаемый объект, имеющий структуры с различной электронной плотностью. Прой­дя через объект, пучок электронов падает на люмииесцирующий экран, на котором и создает плоскостное изображение структур объекта. Это изобра­жение может быть сфотографировано. Общий вид электронного микроско­па показан на рис. 2.4.

Разрешающая способность современных электронных микроскопов равна 0,1 нм (в 200 000 раз выше, чем световых микроскопов), а увеличе­ние — 1 миллион раз. Описанная разновидность электронной микроско­пии называется просвечивающей (трансмиссионной). Используя ее, можно изучить тонкое внутреннее строение клеток и межклеточных структур.Сканирующие, или растровые, микроскопы позволяют увидеть трехмерное изображение объекта, его поверхность. Принцип работы растрового элект­ронного микроскопа заключается в том, что пучок электронов последова­тельно движется по поверхности гистологического объекта, на которую предварительно напылено твердое вещество. Под действием пучка элект­ронов выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются телеви­зионным экраном. Так последовательно «высвечивается» (сканируется) вся поверхность гистологического объекта. Рис. 2.5 демонстрирует изображе­ния объектов, получаемые с помощью трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов.

Высоковольтная трансмиссионная электронная микроскопия за счет увеличения ускоряющего напряжения обеспечивает огромную скорость движения электронов. Благодаря этому они значительно глубже, чем при обычной трансмиссионной микроскопии, проникают в изучаемый объект. Высоковольтный микроскоп (рис. 2.6) дает высокую разрешаю­щую способность и позволяет изучать срезы до нескольких микромет­ров толщиной.

ГИСТОХИМИЯ

В основе гистохимических ме­тодов исследования лежит использование химических реакций для изучения различных химических компонентов клеток и тканей. Со­временные гистохимические мето­ды позволяют выявлять в клетках аминокислоты, белки, жиры, угле­воды, минеральные вещества и другие продукты. Принцип гисто­химических реакций состоит в том, что используются красители, которые избирательно связывают­ся только с теми химическими со­единениями клетки, которые необ­ходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми. Важный раз­дел гистохимии — гистохимия ферментов. При помощи гисто­химии ферментов можно опреде­лить активность многих фермен­тов, изучать обмен веществ в клет­ках и тканях. Активность фермен­тов при этом определяется по окра­шиванию конечного продукта реакции. Поскольку гистохимические методы позволяют оценивать функции клеток и тканей, их относят к морфофункциоиальным методам (рис 2.7).

Разновидностью гистохимии является также иммуногистохимия (иммуноцитохимия). Иммуногистохимические методы основаны на реакцияхан­тиген-антитело. Каждая клетка организма имеет свой разнообразный спе­цифический антигенный состав. К любому антигену можно путем имму­низации выработать специфические(моноклональные) антитела, которые затем соединяются с флуорохромом (например,флуоресцеинизотиоциона-том, или сокращенно ФИТЦ). Нанесенные на гистологический объект, та­кие антитела специфически метят только клетки, несущие антигены, на которые они выработались. Методы иммуногистохимии используются для определения степени дифферепцировки клеток (в процессе дифференцировки происходит последовательная смена поверхностных клеточных ан­тигенов), а также для выявления различных веществ в клетке. В последнее время принципы светомикроскопической гистохимии ус­пешно перенесены в электронную микроскопию. Это привело к возникновение электронномикроскопической цито- и гистохимии и электронной им-муноцитохимии (иммуногистохимии). Эти методы основаны на получении высокоэлектронноплотных продуктов цито- (гисто)химических реакций. Светомикроскопическая и электронномикроскопическая цито- (гисто- имму­нохимия также являются морфофункциональными методами, позволяю­щими изучать не только структуру, но и функции клеток и тканей.

ГИСТОАВТОРАДИОГРАФИЯ — метод, основанный на использова­нии радиоизотопов — веществ, излучающих поток электронов. Для этого изотопами метят различные предшественники синтеза веществ в клетке: нуклеотиды, аминокислоты и другие. Затем эти меченые вещества вводят в клетку (в организм), и они включаются в синтетические процессы. Далее из ткани делают срезы и наносят на них фотоэмульсию, которая под влиянием излучаемых электронов засвечивается. Чем больше засвечивание, тем интен­сивнее идет процесс включения изотопов в ткани, тем интенсивнее обмен в клетке. В последнее время разработаны методы электронной цито-(гисто-) ауторадиографии. Так же, как и гистохимические методы, гистоавторадиог-рафия является морфофункциональным методом исследования.

ПРИЖИЗНЕННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Для прижизненной (витальной) микроскопии можно использовать метод куль­туры тканей, когда клетки помещаются на искусственную питательную среду и затем на ней культивируются. На такой среде они растут в виде монослоя. Эти клетки можно затем окрашивать и микроскопировать. Для прижизненного исследования клеток используются также методы виталь­ного (прижизненного) окрашивания клеток нетоксичными красителями (метиленовый синий, трипаповый синий, кармин). Эти красители дают не растворы, а эмульсии, которые активно фагоцитируются клетками и визу-

ализируют их. Суправитальная микроскопия основана на связывании кра­сителя живыми тканями, изъятыми из организма. Например, так окрашивают нерные клетки при помощи метиленовОго синего. Таким образом, разница между витальной и суправиталыюй микроскопией заключается в том, что в первом случае окрашивание клеток и тканей идет в живом организме до изъятия из него органа или его части, тогда как во втором случае оно про­водится в живом, но изъятом из организма органе (части органа, ткани).

Для изучения живых клеток используют также метод цейтраферной съемки (киносъемки). При этом клетки в культуре тканей фотографируют с интервалами в 5 минут. Снятый таким образом фильм демонстрируют с частотой 24 кадра в секунду. При этом за короткое время можно увидеть все изменения, произошедшие с клетками в течение длительного времени. Цейтраферная съемка позволяет, например, проследить изменения, проис­ходящие в клетке при митотическом делении и др.

ЦИТОМИКРОХИРУРГИЯ — метод, позволяющий производить на клетке микрооперации — удаление частей клетки, пересадку ядра из одной клетки в другую и т.д. С этой целью используют специальный прибор микроманипулятор.

В гистологии широко используют также метод трансплантации тканей. Для этого кусочки органов или тканей пересаживают в различные участки тела животных-реципиентов. Далее изучают поведение трансплантатов, процессы жизнедеятельности в них и взаимоотношения их с тканями ре­ципиента.

МЕТОД ГИБРИДИЗАЦИИ. Этот метод основывается на специфи­ческом связывании участков ДНК с комплементарными им маркирован­ными фрагментами РНК или ДНК (так называемые зонды). Метод позво­ляет выявлять последовательность нуклеотидов в РНК и ДНК и, следова­тельно, локализацию определенных генов и продуктов их деятельности.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ГИСТОЛОГИИ (МОРФОМЕТРИЯ)

В современной гистологии значительный дополнительный объем ин­формации о гистологическом объекте можно получить при помощи коли­чественных методов. Наиболее простым количественным гистологическим исследованием является подсчет гистологических структур в поле зрения микроскопа или на единицу площади среза. К морфометрическим методам относится также определение размеров гистологических объектов с помо­щью окуляр-микрометра — специальной микролинейки, вставленной в окуляр микроскопа. С морфометрической целью используются иморфо-метрические сетки. На этих сетках имеются точки (узлы). Так, например, наиболее часто используемая морфометрическая сетка Г.Г. Антандилова представляет собой прямоугольник, разделенный на два квадрата. Один из квадратов разделен на 4 более мелких квадрата. В каждом из этих малых квадратов имеется по 25 точек (всего 100 точек). Неразделенный большой квадрат содержит 25 точек. При помощи морфометрической сетки можно определить объемные доли различных структур в гистологическом объекте. Для этого случайным образом накладывают сетку определенное число раз на срез ткани или органа в гистопрепарате и подсчитывают количество точек, выпадающих на различные структуры. Предположим, в препарате соедини­тельной ткани 10 точек выпало на клетки, а на межклеточное вещество при­шлось 90 точек. Следовательно, объемная доля межклеточного вещества 90%, а клеток — 10%. Все эти виды морфометрии называютсяручной морфометрией.

В настоящее время существуют достаточно сложные приборы, которые позволяют автоматически производит!) количественные гистологические и гистохимические исследования. Это так называемые автоматизированные системы анализа изображений (АСАИз). В их состав входят: сканирующий световой или электронный микроскоп; видеокамера, которая осуществляет просмотр объекта по двум координатам, а затем следует преобразование его в цифровую форму; ЭВМ, которая обрабатывает полученную цифро­вую информацию и представляет данные о характеристиках исследуемого объекта. С помощью светового дисплея исследователь имеет возможность выделить только интересующие его структуры и получить о них цифро­вую информацию в виде гистограмм и т.д.

ЦИТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Это метод изучения химического состава клетки. Он основан на изби­рательном поглощении теми или иными веществами лучей с определен­ной длиной волны. По интенсивности поглощения (она зависит от кон­центрации вещества в клетке) определяют содержание этого вещества.

ЦИТОСПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЯ — это метод количественного изучения веществ в клетке по спектрам их флуоресценции.

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

1. Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготав­ливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток.

2. Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата.

3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в ка­честве своеобразного документа.

Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники.

Гистологическая техника включает в себя несколько этапов: 1. Взятие материала:

— во время операции;

— от трупов;

— от экспериментальных животных;

— путем пункционной биопсии;

— взятие крови, красного костного мозга путем пункции;

— приготовление отпечатков (с полости рта, влагалища и др.). 2. Фиксация материала.

Фиксация полученного гистологического материала — это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Физические фиксирующие факторы — замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой тем­пературы, рентгеновское облучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя со­хранению гистологического материала.Химические фиксаторы также вы­зывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различаютпростые исложные химические фиксаторы. Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота и др.). Эти фиксаторы, однако, приво­дят к определенным нарушениям структуры гистологического материала. Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксус­ная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксато­ров нивелируется. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей форма­лина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызы­вает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно мно­жество и других сложных фиксаторов.

Световая микроскопия и электронная микроскопия: суть метода

Световая микроскопия

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль.

Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.

Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Виды световой микроскопии

1. Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа.
2. Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.
3. Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.
4. Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом).
5. Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).
6. Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами

Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света.

При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета.

Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.).

Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом.

Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи.

В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом.

Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам.

По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки.

Темнопольная микроскопия

При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив.

В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы.

Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.

Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Фазово-контрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона.

При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.

Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света.

Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный.

Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы.

Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды.

Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.

Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).

Электронная микроскопия

Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию.

Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете.

Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной).

При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными.

Электронные микроскопы: системы

В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом.

Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца.

Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран.

Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование.

Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов

1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране.

Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров).

Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ.STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем.

При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме.

Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами.

Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа

• 1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;
• 2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;
• 3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;
• 4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера.

Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.

Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа.

Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Лекция 2. Устройство электронных микроскопов.

1 Лекция. Устройство электронных микроскопов. Основываясь на базовых знаниях о процессах взаимодействия электронов с веществом (материал первой лекции) можно предполагать, что все виды электромагнитных излучений, возникающих в процессах такого взаимодействия, несут информацию о свойствах вещества. И, на первый взгляд, принципиальная конструкция микроскопов не сложна, а основной задачей производителей микроскопов является создание устройств для выделения и уверенной регистрации определенного вида излучения и трансформации интенсивности этого излучения (сигнала) в полезную аналитическую информацию. Однако, количество факторов «мешающих» уверенной регистрации фактически приводит к тому, что производители электронных микроскопов не в силах создать одновременно и качественные электронные микроскопы и качественные детекторы сигналов, поэтому производством детекторов сложных конструкций занимаются совершенно другие компании. Этот нюанс следует учитывать и при рассмотрении принципиальных конструкций прибора. Так, в настоящей лекции более подробно рассматриваются конструкционные особенности электронных микроскопов и схемы установки детекторов на микроскоп, а описание конструкций детекторов будет рассмотрено более детально при описании методов анализа в следующих лекциях. Вначале рассмотрим схему просвечивающего электронного микроскопа, которое функционально аналогично оптическому микроскопу, работающему в проходящем свете (Рис..1.): осветительная система, состоящая из электронной пушки 1 и конденсора, формирующего форму падающего на образец пучка; исследуемый образец; объективная линза, формирующая изображение; система из промежуточных и проекционной линз, обеспечивающих требуемое увеличение и проецирующих изображения на флуоресцентный экран для наблюдения или на фотопленку (или матрицу цифровой фотокамеры) для регистрации. Схема растрового микроскопа заметно более проста и может быть описана как урезанная до образца схема просвечивающего микроскопа. Только пушка просвечивающего электронного микроскопа, в режиме работы, подходящем для исследования, разгоняет электроны до энергий от 80 до кэв, а для работы на растровом микроскопе такие энергии не требуются. Более того, для применения некоторых методик в растровой 1 Следует отметить, что электронная пушка классически располагается в верхней части микроскопа, но производились также серийные просвечивающие электронные микроскопы с нижним расположением пушки. Такие микроскопы производила компания Vacuum Generator (США) в 80-х — 90-х годах прошлого века. Несмотря на очень приличные для своего времени параметры микроскопа VG HB-501 ( компания обанкротилась в тех же 90-х годах. Микроскопы VG до сих пор успешно работают в некоторых университетах США, Англии и Германии.

2 микроскопии необходимы электроны очень малых энергий. Поэтому пушка растрового микроскопа разгоняет электроны от 5 до кэв. Более подробно устройство просвечивающего микроскопа показано на рис… В электронной пушке микроскопа установлен анод и там же, в устройстве Венельта, установлен катод. Катод является источником электронов, а анод, «разгоняет» электроны до требуемой энергии (анод разделен на несколько динодов, закрепленных в трубке ускорения электронов). Колонной микроскопа принято называть часть прибора от пушки до камеры. Рис..1. Аналогия в схеме оптического и электронного микроскопов. В колонне находятся несколько магнитных линз (формирующих падающий на образец пучок и изображение) и диафрагм, монтируются детекторы вторичных и обратно рассеянных электронов, детекторы микроанализа, гониометр и шлюз. Последний находится внутри гониометра и предназначен для перемещения образца из условий атмосферного давления в высоковакуумную часть электронного микроскопа. Кроме перечисленных на рисунке элементов, современный электронный микроскоп содержит магнитные системы отклонения пучка, и изменения его формы. Изменение формы пучка до достижения им круговой симметрии необходимо для получения неискаженного изображения, соответствующие устройства называются стигматорами и устанавливаются в просвечивающих электронных Компания JEOL выпускает единственную в своем роде серийную модель просвечивающих микроскопов, позволяющих работать с электронами очень высоких энергий до 1000 кэв. Количество динодов в этом микроскопе более 10. В этой модели высоковольтный трансформатор находится непосредственно над пушкой микроскопа. Высота такого микроскопа около двух этажей. Однако, вариант стыковки трансформатора с микроскопом, в последние 10-0 лет, применяется этой компанией и для более простых моделей.

3 микроскопах после конденсора (перед попаданием пучка на образец) и после объективной линзы. Рис… Основные узлы просвечивающего электронного микроскопа. Все узлы микроскопа находятся под вакуумом различной глубины. В зависимости от устройства прибора, давление в пушке поддерживается от 10-7 до 10-4 Па, в колонне от 10-6 до 10-3 Па, а в камере от 10 — до 0,1 Па. Относительно высокий вакуум в пушке и колонне электронного микроскопа достигается использованием последовательно установленными насосами: форвакуумный насос, каскад из диффузионных или турбомолекулярных и ионных насосов. Давление в различных частях микроскопа измеряется термопарными лампами (от атмосферного давления до 0,1 Па), магнитными датчиками давления (от 10 — до 10-4 Па) и ионизационными лампами (включая сам ионный насос) — от 10-4 до 10-7 Па. При включении микроскопа происходит последовательное, автоматическое вакуумирование частей микроскопа. Процедура занимает от нескольких часов до 1-1,5 суток, поэтому регулярно используемые приборы постоянно поддерживаются в откачанном состоянии. В целях дегазации после длительного пребывания в выключенном состоянии иногда требуется провести отжиг колонны микроскопа, который осуществляется подачей тока на магнитные линзы микроскопа (такой режим предусмотрен всеми современными моделями микроскопов).

4 После краткого описания основных узлов микроскопа, более рассмотрим некоторые его узлы более подробно. Начнем с устройства катодов, основные характеристики которых представлены в таблице.1. Наиболее простым источником электронов в электронных микроскопах является термоэмиссионный катод из вольфрама, рабочим элементом в котором служит V-образная вольфрамовая проволока. Интенсивность потока электронов в таком источнике изменяется посредством увеличения/уменьшения тока накала катода и изменения напряжения смещения 3. Этот источник наименее прихотлив к вакууму (давление в пушке должно поддерживаться не выше Па) и его может сменить любой опытный пользователь. Однако вольфрамовый катод не долговечен, его срок работы обычно не превышает месяцев и обладает недостаточной (для многих случаев) электронной яркостью (количество электронов приходящихся на единицу телесного угла). Таблица.1. Сравнение характеристик различных источников электронов Термоэлектронная эмиссия Полевая эмиссия Холодная Характеристика Термополевая W LaB 6 полевая эмиссия, эмиссия, W (100) W (310) Диаметр мнимого источника 30 мкм 5-10 мкм ~ 10 нм ~ 10 нм Яркость, измеренная при напряжении кв, А/(см ср) Разброс энергий электронов, эв,3 1,5 0,3 0,8 0,3 0,5 Стабильность тока эмиссии 1% 1% % 5-10% Более интенсивный поток электронов обеспечивается термоэмиссионным катодом из LaB 6, рабочим элементом в нем является монокристалл гексаборида лантана. Электронная пушка с таким катодом должна поддерживаться при давлении не выше Па. При квалифицированном использовании источника, замена осуществляется один раз в,5-3 года опытным пользователем. Схема питания термоэмиссионных катодов представлена на рис..3. Третий источник электронов катод с полевой эмиссией. Он состоит из холодной 3 За изменением тока пучка можно интерактивно проследить меняя установки в симуляторе электронной пушки, представленном на сайте в разделе C: Electron Gun C3: Gun Simulation.

5 или подогреваемой иглы, с острия которой приложенным потенциалом «стягиваются электроны» (используется эффект туннелирования электронов). Схема питания катодов с термополевой эмиссией приведена на рис..4. Этот источник эксплуатируется при давлении не выше Па, пушка микроскопа с таким катодом может откачиваться с использованием нескольких ионных насосов. Замена катода с полевой эмиссией производится только сервисным инженером, а в некоторых моделях ПЭМ она может быть произведена лишь на заводе-изготовителе. Сложности в эксплуатировании катодов с полевой эмиссией компенсируются узким распределением по энергии ускоренных электронов и сроком службы более -х лет. Следует отметить, что литературные данные о яркости, абсолютном токе эмиссии и стабильности эмиссии всех видов катодов сильно разняться, и в основном, эта ситуация касается источников с полевой эмиссией. Возможно, это связано с сильной зависимостью абсолютного тока эмиссии от конструкции катодного узла. Некоторыми производителями заявляется о значительном увеличении тока эмиссии для катодов с полевой эмиссией и достижения токов мка. Рис..3. Схема питания термоэмиссионных катодов. Для исследователя, проводящего анализ образцов, важен совершенно другой параметр ток зонда на образце, а он зависит от многих параметров, в том числе и свойств образца. Измерение тока зонда производится с использованием специального устройства — цилиндра Фарадея. Для примера, в растровых микроскопах с термоэлектронным источником ток зонда составляет 10-0 мка, с термополевыми до 0 на, а с холодной полевой эмиссией до,5 на.

6 Рис..4. Схема питания катодов с термополевой эмиссией. Тип источника электронов, несомненно, очень сильно влияет на возможность достижения высокого разрешения или проведения анализа объектов. Однако, следующим не менее важным фактором, влияющим на функциональные возможности микроскопа, является качество изготовления магнитных линз. Для магнитных линз применимы те же понятия, что и для оптических. На рис..5 изображена схема основных параметров толстой линзы и проиллюстрирован ход лучей, для описания которого, в идеальном случае, будет применимо уравнение Ньютона: y y 1 = f 1 x 1 = f x. F1 и F называются соответственно передним фокусом (фокус в пространстве объекта) и задним фокусом (фокус в пространстве изображения), а h2 и H главными плоскостями в пространстве объекта и пространстве изображения. Рис..4. Ход лучей в толстой линзе (иллюстрация уравнения Ньютона). N1, N узловые плоскости, h2, H главные плоскости, F1, F фокальные плоскости, f 1, f фокальные расстояния линзы, а z 1 координата переднего фокуса.

7 Специфика конструкции электромагнитных линз в микроскопе позволяет применять приближение для тонких линз: f U + f V 1. А так как показатели преломления в 1 = пространстве объекта и изображения равны между собой, то это уравнение можно записать в виде: 1 U + 1V = 1 f. Используя это уравнение можно выделить три случая формирования изображения: 1) U < f изображение мнимое, прямое и увеличенное; ) f < U < f изображение действительное, перевернутое и увеличенное; 3) U > f изображение действительное, перевернутое и уменьшенное. Для описания параметров оптической линзы применяются также следующие понятия: поперечное увеличение, угловое увеличение, входной и выходной зрачок системы линз, опорная сфера Гаусса, продольное увеличение, глубина фокуса (область значений фокусных расстояний), — в качестве одного из заданий для самостоятельной работы предлагается найти в литературе и сформулировать определения этих терминов. Следует все же не забывать, что мы имеем дело не с видимым светом, а с потоком электронов. На рис..6 проиллюстрировано взаимодействие магнитной линзы с ускоренными электронами. Рис..6. Принцип работы магнитной линзы: а) взаимодействие электронов с магнитным полем линзы, б) идеальная траектория электронов, в) реальная траектория электронов (спираль). В основе принципа работы магнитной линзы лежит свойство взаимодействия движущихся электронов и магнитного поля, при этом на электроны летящие параллельно оптической оси действует сила Лоренца — F:

8 d r F = ev B = m, (.1) dt где B магнитное поле сконцентрированное в зазоре, e — заряд электрона, v — скорость электрона. Направление силы F задается правилом левой руки (направление тока противоположно направлению электронов), на рис..6 сила направлена на читателя. Сила F обуславливает движение электрона по спирали. Однако, электроны летят не параллельно оптической оси, с ненулевой вращательной скоростью, взаимодействие которой с компонентой поля B z приводит к возникновению силы, толкающей электрон к оптической оси, создавая тем самым фокусирующий эффект магнитной линзы. Таким образом, траектория движения электронов изменяется, и в магнитном поле линзы электронный пучок будет фокусироваться по спирали, а радиальное расстояние r от электрона до оптической оси может быть получена численным решением уравнения: d r e + B ( z ) r = 0 z, (.) dz 8mE где E ускоряющее напряжение с учетом релятивистской поправки. Аналогичным образом можно определить и θ — угол поворота меридиональных лучей в пучке электронов: 1 z e θ = ( ) = 0 8 B z z dz, (.3) me z 1 Зависимость B z (z) зачастую очень сложна, поэтому решение уравнений (.) и (.3) возможно лишь в численном виде. Но уравнение (.) относительно легко решается, если применить приближение постоянного поля, при котором постулируется следующая зависимость B z (z): B S, для S z S B z ( z ) =, (.4) 0, для z < S, и z > S где B S напряженность магнитного поля в зазоре, S величина магнитного зазора (расстояние от верхнего до нижнего полюсного наконечника), за начало координат взята точка на оптической оси отстоящая на равные расстояния от полюсных наконечников. Тогда решение уравнения (.) можно записать в виде: 1 e r = r0 cos B S ( z S ), (.5) 8mE Напряженность поля в линзе регулируется изменением пропускаемого через электромагниты тока, а его стабильность поддерживается посредством водяного охлаждения линз и силовой частей электропитания линз микроскопа. Значение B S можно рассчитать зная ток I и количество витков N в электромагните:

9 NI NI = μ 0 = 4π 10, (.6) S S B S 7 где значение B S получается в теслах, если взять S в метрах, а I в амперах. Примененные нами условия (.4) достаточно грубы, однако, используя их, мы получили вывод о зависимости траектории электрона от магнитного зазора в линзе, но в дальнейшем не сможем объяснить появление сферических (коэффициент C S ) и хроматических (коэффициентc С ) аберраций в линзе. Рассмотрим явление сферических аберраций, которое заключается в слишком сильном преломлении лучей, выходящих из осевой точки под большим углом. Явление проиллюстрировано на рис..7. Плоскость гауссова изображения — плоскость для которой выполняется уравнение 1 U + 1V = 1 f. Рис..7. Сферическая аберрация. 3 Для сильных увеличений экспериментально выявлено, что Δr 1 пропорционально θ 1, коэффициент в этой зависимости принято называть коэффициентом сферических аберраций C S : 3 Δ r 1 = C S θ 1. (.7) Строгая математическая зависимость C S от B z (z) выглядит достаточно сложно (в общем случае C S будет зависеть от 5 ( z ) ), и может быть найдена исключительно численными B z методами. Сферическая аберрация является наиболее существенным дефектом, влияющим на качество изображений при высоком разрешении, в микроскопах без специальной коррекции она составляет от 0,5 до,5 мм. Хроматическая аберрация является следствием чувствительности фокусного расстояния линзы к длине волны, а следовательно флуктуациям ΔE энергии электронов. Для случая магнитных линз хроматические аберрации будут появляться также вследствие колебаний тока ΔI, которые отвечают за колебания ΔB магнитного поля линз, а в просвечивающем микроскопе возможна также потеря энергии электрона при взаимодействии

10 с образцом. Тогда, дифференцируя уравнение, предложенное Либманом для описания фокусирующих свойств всех «тонких» магнитных линз: 1 A 0 ( NI ) =, (.9) f E ( S + D ) (A 0 обычно принимают равной константе, D диаметр отверстия полюсного наконечника) получаем зависимость Δf от ΔE и ΔI: Δf f ΔE = E ΔI. (.10) I Коэффициент хроматической аберрации C C определяется как C C = a f, где а численный коэффициент близкий к единице. Тогда, уравнение (.10) можно записать в виде: ΔE ΔI Δf = C C E I. (.10) Используя эту формулу, можно получить значение смещения Δr 1, для случая хроматических аберраций (Рис..8): ( ΔE ΔI Δr1 = C Cθ 1 ). (.10) E I Рис..8. Хроматическая аберрация. Более быстрые электроны отклоняются слабее в поле магнитной линзы, чем медленные электроны. Таким образом, более быстрые электроны фокусируются за плоскостью гауссова изображения. Характерные значения C С для линз 1 1,5 мм. На рис..9 приведены экспериментально полученные зависимости C S и C С от положения образца относительно вершины нижнего полюсного наконечника. Из представленных графиков видно, что существует оптимальное положение образца для достижения минимальных значений C С, а C S монотонно уменьшается с приближением образца к нижнему полюсному наконечнику.

11 Рис..9. Характерные зависимости C С и C S от положения образца в объективной линзе, b 1 диаметр отверстия верхнего полюсного наконечника в мм, диаметр отверстия нижнего полюсного наконечника равен мм. Следует отметить, что существует также возможность появления в линзе астигматизма, который связан с асимметрией магнитного поля линзы. Астигматизм характеризуется коэффициентом астигматизма C а, который равен разности в фокусных расстояний линзы для лучей, лежащих во взаимно перпендикулярных плоскостях (Рис..10.). Рис..10. Астигматизм магнитной линзы. В отличие от описанных выше эффектов сферических и хроматических аберраций, астигматизм может быть убран оператором прибора. В электронных микроскопах корректировка астигматизма осуществляется изменением тока 4-х дополнительных, слабых, цилиндрических линз. Система таких линз называется стигматором. Описанные выше отклонения от идеальности, присущи всем магнитным линзам электронных микроскопов. Фактически можно выделить всего два типа магнитных линз в

12 микроскопах: проекционные и объективные. Проекционные линзы линзы, которые проецируют изображение, созданное предыдущей линзой. Причем, фокус проекционных линз пространственно может находится как внутри линзы, так и за ее пределами. Объективная линза линза формирующая изображение реального объекта. Вследствие того, что угловое увеличение обратно пропорционально поперечному увеличению, увеличение изображения происходит в проекционных линзах при распространении лучей под очень малыми углами к оптической оси. Но в случае объективной линзы эти углы заметно выше, вследствие чего, аберрации этой линзы будут определяющими для достижения высоких разрешений. Для уменьшения влияния аберраций объективной линзы, образец в просвечивающем микроскопе размещен в поле объективной линзы (такие линзы называются иммерсионными). В таком случае, положение главных плоскостей линзы и значения коэффициентов аберраций будут зависеть от положения образца в линзе. В последнее 10 лет активно развивается электронная оптика, применяемая для корректировки аберраций это так называемые корректоры сферических аберраций и монохроматоры. По своей сути корректоры и монохроматоры являются электромагнитами специальной конструкции, устанавливаемыми в просвечивающие 4 микроскопы до или после объективной линзы. На рис..11. проиллюстрирован принцип работы корректоров и представлен внешний вид их элементов. Корректоры аберраций позволяют снизить сферические аберрации в микроскопах оснащенных катодами с полевой эмиссией до 1-10 мкм. Таким образом устраняется определяющее влияние значения C S на разрешающую способность электронных микроскопов, а информационный предел улучшается до значений менее 0,1 нм. Применение монохроматоров позволяет улучшить аналитические свойства микроскопа, в частности появляется возможность определения ширины запрещенной зоны материала и степеней окисления химических элементов по спектрам характеристических потерь энергии электронов. На рис..1 показан принцип работы и вид монохроматора, применяемого в микроскопах компании FEI Company. 4 Применение корректоров и монохроматоров в растровых микроскопах лишено смысла, вследствие особенностей решаемых на этих приборах задач.

13 Рис..11. Внешний вид двенадцатиполюсного магнита и принцип работы гексаполюсного магнита в корректоре (сверху) и схема траекторий лучей в корректоре (снизу), S1 и S — гексаполи. Рис..1. Внешний вид и принцип работы монохроматора. В колоннах микроскопов или после них также устанавливаются фильтры, являющиеся еще и аналитическим прибором. Как вы помните из первой лекции, взаимодействие ускоренных электронов с веществом происходит упруго (без изменения энергии) либо с изменением энергии. Современные фильтры и спектрометры предназначаются для регистрации электронов прошедших через образец и имеющих энергию отличную от

14 первоначальной, а также регистрации вторичных электронов и характеристического рентгеновского излучения. Все они позволяют получать информацию об элементном составе образца и отличаются конструкцией и расположением в микроскопе, в настоящее время выпускаются коммерческие фильтры внутриколонного и постколонного типа (Рис..13). Рис..13. Типы фильтров: а) внутриколонного типа 5, б) поcтколонного типа 6. Назначения спектрометра характеристических потерь энергии электрона (EELS) элементный анализ, определение степеней окисления элементов, теоретически возможно определение энергии Ферми в материале. Последние две функции спектрометра возможны только на самых современных микроскопах, оснащенных катодом монохроматором. Спектрометр потерь энергий электронов устанавливается под камерой микроскопа и позволяет получать зависимость количества электронов от энергии связи электрон ион. Энергодисперсионный спектрометр для рентгеноспектрального микроанализа позволяет проводить полуколичественный анализ состава образцов методом регистрации характеристического рентгеновского излучения. Устанавливается этот спектрометр на колонну микроскопа непосредственно у образца, а для проведения анализа часто требуется повернуть образец на некоторый угол (обычно 45º), который определяется конструкциями микроскопа и спектрометра (Рис..14.). 5 Владельцем патента на внутриколонный Ω-фильтр является компания Carl Zeiss (Германия). 6 Владельцем патента на параллельный спектрометров характеристических потерь (PEELS) является компания Gatan (США).

15 Рис..14. Расположение энергодисперсионного спектрометра в ПЭМ. Наблюдение изображений в просвечивающем микроскопе первоначально осуществляется с использованием флуоресцентного экрана, изображение на котором можно наблюдать невооруженным глазом или через оптический бинокуляр. Для фиксирования изображений долгое время применялись фотопленки и фотопластинки, которые в настоящее время активно заменяются на полупроводниковые камеры и цифровые фотопластинки. Следует отметить, что камеры высокого разрешения (от 50 до 100 мкм) часто не устойчивы к воздействию ускоренных электронов и рентгеновского излучения, и защита камеры либо ухудшает разрешение либо значительно увеличивает ее стоимость. Изображения, получаемые с использованием таких камер зачастую по разрешению хуже регистрируемых на высококачественную пленку, которая обеспечивает разрешение около 10 мкм (причем, в этом случае возможно еще и дополнительное увеличение снимков при фотопечати). В то же время, регистрация изображений в электронном виде может позволить очень существенно сократить время получения конечного изображения по сравнению с методом фотографической регистрации, требующим химической обработки фотопленок. Это, в свою очередь, позволяет проводить на просвечивающем электронном микроскопе тщательные исследования на наноразмерном уровне микроструктуры материалов, склонных к превращениям под действием электронно-лучевого нагрева в условиях высокого вакуума (в колонне электронного микроскопа), таких, как значительная часть биологически активных нанокомпозитов — заменителей костной ткани, строительных материалов, содержащих связанную воду; а также объектов, способных отклонять электронный пучок в ходе исследования — материалов с высокой диэлектрической проницаемостью и ферромагнетиков. Кроме того, конструктивные особенности устанавливаемых на просвечивающие электронные микроскопы систем регистрации изображения в электронной форме часто позволяют

16 применять при их использовании программную коррекцию дрейфа изображения, что также исключительно важно исследования упомянутых типов образцов. При регистрации интегральных (собираемых со всей освещенной электронами области) аналитических сигналов (например, при регистрации спектров EELS, характеристического рентгеновского излучения или при работе режиме растровой просвечивающей электронной микроскопии) в просвечивающем микроскопе применяются фотоумножители и энергодисперсионные детекторы. Как уже отмечалось ранее, устройство растровых электронных микроскопов значительно проще и схематично конструкция растрового микроскопа схожа с конструкцией просвечивающего микроскопа до уровня образца. Основные отличия растрового электронного микроскопа от просвечивающего заключается методе получения изображения, и детекторах, которые устанавливают на эти микроскопы, а также в расположении этих детекторов. Следует отметить, что большинство просвечивающих микроскопов может быть оснащено приставками для работы в растровом режиме. Детекторы вторичных и обратно рассеянных электронов устанавливаются в такой просвечивающий микроскоп в районе объективной линзы. Контрольные вопросы 1. Каковы основные различия источников электронов, применяемых в электронных микроскопах?. По каким причинам установка монохроматора на приборы с термоэмиссионным катодом будет вредна для экспериментатора? 3. Чем вызваны сферические и хроматические аберрации магнитных линз, сформулируйте определение коэффициентов аберраций? 4. Можно ли осуществить поворот изображения, получаемого в магнитной линзе от объекта, без поворота самого объекта? Если можно, то каким образом? Задания для самостоятельной работы 1. Нарисуйте схему формирования мнимого изображения в идеальной толстой линзе.. Сформулируйте понятия поперечное увеличение, угловое увеличение, входной и выходной зрачок системы линз, опорная сфера Гаусса, продольное увеличение, глубина фокуса (область значений фокусных расстояний).

17 3. Оцените расфокусировку изображения объекта в магнитной линзе вследствие хроматических аберраций, если: f = 1,5 мм, стаби

Введение в электронную микроскопию — ТЕМ

Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) состоит из четырех основных компонентов: электронно-оптическая колонка, вакуумная система, необходимая электроника (линзы для фокусировки и отклонения луча и высоковольтный генератор для источника электронов) и управляющее программное обеспечение. . Современный ПЭМ обычно состоит из пульта управления, увенчанного вертикальной колонной и содержащего вакуумную систему, и панелей управления, удобно расположенных для оператора.Микроскоп может быть полностью закрыт, чтобы уменьшить помехи от источников окружающей среды, и им можно управлять дистанционно.

Электронная колонка включает элементы, аналогичные элементам светового микроскопа. Источник света оптического микроскопа заменен электронной пушкой, встроенной в колонну. Стеклянные линзы заменены электромагнитными линзами. В отличие от стеклянных линз, мощность (фокусное расстояние) магнитных линз можно изменять, изменяя ток через катушку линзы. Окуляр или окуляр заменяется флуоресцентным экраном и / или цифровой камерой.Электронный луч выходит из электронной пушки и проходит через тонкий образец, передавая электроны, которые собираются, фокусируются и проецируются на смотровое устройство в нижней части колонны. Весь путь электронов от пушки до камеры должен проходить под вакуумом.

Просвечивающая электронная микроскопия с коррекцией аберраций

Недавняя разработка специализированного коммерческого ПЭМ с коррекцией аберраций позволила существенно улучшить возможности ПЭМ. Без коррекции разрешение ПЭМ ограничено в первую очередь сферической аберрацией, что приводит к общему размытию изображения, но также и к явлению, называемому делокализацией, при котором периодические структуры выходят за пределы своих реальных физических границ.Возможность корректировать сферическую аберрацию оставляет уменьшение или коррекцию эффектов хроматической аберрации в качестве следующей серьезной проблемы в улучшении характеристик ПЭМ. Корректоры хроматической аберрации были успешно включены в платформу ТЕМ Thermo Scientific ™ Titan ™, но их конструкция и работа значительно сложнее, чем корректоры сферической аберрации.

Просвечивающая электронная микроскопия в окружающей среде

В ПЭМ окружающей среды (ETEM), таком как Thermo Scientific ™ Titan ETEM, используется специально разработанная вакуумная система, позволяющая исследователям наблюдать за образцами в ряде условий, приближающихся к более «естественным» средам, с давлением газа в в камере для образцов давление составляет несколько процентов от атмосферного.Это важно для наблюдения за взаимодействием между образцом и окружающей средой. ETEM опирается на отверстия для ограничения давления и дифференциальную откачку вакуума, чтобы обеспечить менее строгие условия вакуума вблизи образца при поддержании высокого вакуума в остальной части электронного столба.

Далее: Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)

Введение в электронную микроскопию — STEM: объединяет принципы просвечивающей электронной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии и может выполняться на любом типе инструмента.

Сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (STEM) сочетает в себе принципы просвечивающей электронной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии и может выполняться на любом типе прибора. Как и ПЭМ, СТЭМ требует очень тонких образцов и в первую очередь рассматривает электроны пучка, прошедшие через образец. Одно из его основных преимуществ перед ПЭМ заключается в возможности использования других сигналов, которые не могут быть пространственно коррелированы в ПЭМ, включая вторичные электроны, рассеянные электроны пучка, характеристическое рентгеновское излучение и потерю энергии электронов.

Как и SEM, метод STEM сканирует очень точно сфокусированный пучок электронов через образец в виде растрового изображения. Взаимодействие между электронами пучка и атомами образца генерирует последовательный поток сигналов, который коррелирует с положением пучка для построения виртуального изображения, в котором уровень сигнала в любом месте образца представлен серым уровнем в соответствующем месте изображения. Его основным преимуществом по сравнению с обычными изображениями с помощью SEM является улучшение пространственного разрешения.

Рассеянные пучки электронов. Электроны пучка могут упруго рассеиваться ядрами атомов образца. В массивном образце в СЭМ упруго рассеянные электроны пучка, которые были направлены обратно из образца, составляют сигнал обратно рассеянных электронов (BSE). В STEM электроны прошедшего пучка, которые были рассеяны на относительно большой угол, обнаруживаются с помощью детектора кольцевого темного поля под большим углом (HAADF).

Рентгеновский микроанализ. Электроны, бомбардирующие образец, вызывают испускание рентгеновских лучей, энергия которых характерна для элементного состава образца.В рентгеновском микроанализе используется энергодисперсионный рентгеновский спектрометр (EDX) для подсчета и сортировки характеристических рентгеновских лучей в соответствии с их энергией.

Спектрометрия рентгеновского излучения с дисперсией по длине волны (WDX) измеряет и подсчитывает рентгеновские лучи по их длине волны (коррелят энергии). Спектрометр длины волны использует кристалл или решетку с известным расстоянием для дифракции характеристических рентгеновских лучей.

Спектрометрия потерь энергии электронов (EELS) анализирует прошедшие электроны, чтобы определить количество энергии, которую они потеряли при взаимодействии с образцом.Он предоставляет информацию о взаимодействующих атомах, включая идентичность элементов, химическую связь, электронные свойства валентной зоны и зоны проводимости, свойства поверхности и функции распределения парных расстояний для конкретных элементов.

Далее: сфокусированные ионные пучки (FIB) и системы DualBeam

Электронная микроскопия, 2-е издание — скачать PDF бесплатно

Страница iii

Принципы и методы электронной микроскопии для биологов, второе издание Джон Дж.Боццола, M.S., Ph.D. Центр электронной микроскопии Университет Южного Иллинойса Карбондейл, Иллинойс Лонни Д. Рассел, магистр медицины, доктор философии Лаборатория структурной биологии Медицинский факультет Университета Южного Иллинойса Карбондейл, Иллинойс

Page iv

Мировая штаб-квартира Jones and Bartlett Publishers 40 Tall Pine Drive Sudbury, MA 01776 9784435000 [адрес электронной почты защищен] www.jbpub.com Jones и Bartlett Publishers Canada PO Box 19020 Toronto, ON M5S 1X1 CANADA Jones and Bartlett Publishers International Barb House, Barb Mews London W6 7PA UK Главный исполнительный директор: Клейтон Джонс Главный операционный директор: Дон Джонс-младший.Издатель: Том Уокер В. П., Продажи и маркетинг: Том Мэннинг Директор по маркетингу: Рич Пироцци Директор по производству: Энн Спенсер Редактор по производству: Ребекка С. Маркс Директор по производству: Тереза ​​Бройер Исполнительный редактор: Брайан Л. Маккин Дизайн: Carlisle Publishers Services Редакция Производственные услуги: Carlisle Publishers Services Набор текста: Carlisle Communications, Ltd. Дизайн обложки: Энн Спенсер Печать и переплет: Quebecor Printing / Kingsport Печать обложек: John Pow Company

Copyright © 1999, 1992, Jones and Bartlett Publishers, Inc.Все права защищены. Никакая часть материала, защищенного этим уведомлением об авторских правах, не может быть воспроизведена или использована в любой форме, электронной или механической, включая фотокопирование, запись или любую систему хранения и поиска информации, без письменного разрешения владельца авторских прав. Каталогизация Библиотеки Конгресса в данных публикаций Боззола, Джон Дж. Электронная микроскопия: принципы и методы для биологов / Джон Дж. Боззола, Лонни Д. Рассел. — [2-е изд.] С. см. Включает библиографические ссылки и указатель.ISBN 0763701920 (жесткий) 1. Электронная микроскопия. И. Рассел. Лонни Ди. II. Заглавие. Qh312.E4B69 1998 570 ‘.28’25 — DC21 9840315 CIP О обложке: Электронная микроскопия, второе издание, единственная книга такого рода, которая охватывает все практические аспекты сканирующей и просвечивающей микроскопии на начальном уровне. На передней обложке показано изображение антенны бабочки, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа. Показанная часть антенны имеет размеры 2.5 мм в длину. Образец сушили на воздухе, покрывали 40 нм палладиевого золота и исследовали при ускоряющем напряжении 15 кВ с использованием детектора вторичных электронов. (Любезно предоставлено С. Дж. Шмиттом). Изображение на задней обложке представляет собой ультратонкий срез, исследованный в просвечивающем электронном микроскопе, на котором видны плотно упакованные жгутики сперматозоидов насекомых (Odontocerum albicore). Каждый жгутик около 0,4 м в диаметре. (С любезного разрешения Р. Даллаи). Напечатано в Соединенных Штатах Америки. 02 01 00 99 10 9 8 7 6 5 4 3 2

Page v

Нашим родителям John, Sr.Лонни, старший Анджелина Джин

Стр. Vii

Краткое содержание Глава 1 Прошлое, настоящее и будущее электронной микроскопии

2

Глава 2 Подготовка образца для просвечивающей электронной микроскопии

16

Подготовка образцов для сканирующей электронной микроскопии

48

Глава 4 Ультрамикротомия

72

Глава 5 Методы окрашивания и контрастирования образцов для просвечивающей электронной микроскопии

120

Глава 6 Просвечивающий электронный микроскоп

Сканирующий микроскоп

Электронный микроскоп

202

Глава 8 Получение электронной микрофотографии

240

Глава 9 Иммуноцитохимия

262

Глава 10 Ферментная цитохимия

282

0003

0003autoradiography

Глава 12 Различные методы локализации и улучшения

310

Глава 13 Количественная электронная микроскопия

320

Глава 14 Репликация трещины замораживанием

Криоэлектронная микроскопия выявляет структуры белка, поддерживающего клеточные мембраны

На необработанных электронных микрофотографиях (A) можно найти отдельные молекулы белка (зеленые прямоугольники).Взяв в среднем тысячи таких одинаково ориентированных частиц, можно получить четкие двухмерные изображения (B), по которым можно рассчитать трехмерную структуру белка (C). Наконец, можно интерпретировать этот результат, построив модель белка (D). Фото: Милена Тимченко.

Используя новейшую электронную микроскопию, исследователи из Орхусского университета определили первые структуры липид-флиппазы. Эти открытия позволяют лучше понять основы того, как клетки работают и остаются здоровыми, и в конечном итоге могут расширить наши знания о нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера.

Все клетки окружены клеточной мембраной, которая определяет и защищает внутреннюю часть клетки от внешнего мира. Мембрана состоит из двух слоев жиров, называемых липидами, и распределение определенных типов липидов между двумя сторонами мембраны имеет большое значение для того, чтобы клетка оставалась здоровой и действовала динамично. Поскольку липидные флиппазы представляют собой мембранные белки, они расположены в мембранах клетки и имеют большое значение для свойств мембраны, где они перемещают липиды из внешней части клеточной мембраны во внутренний слой.

Исследователи изучили липид-флиппазу Drs2 / Cdc50, которая содержится в дрожжевых клетках и активно перемещает липиды с одной стороны клеточной мембраны на другую. Подобные белки обнаруживаются во многих вариантах у людей, где они также связаны с очень активными процессами в клетках мозга и, следовательно, с механизмами, которые являются центральными для неврологических заболеваний и деменции, например Болезнь Альцгеймера.

Белок примерно состоит из длинной цепи аминокислот, которая складывается в трехмерную структуру, которая имеет решающее значение для их функции.Экспериментальное определение трехмерных структур белковых молекул требует передовых методов и часто представляет собой серьезную проблему, особенно для мембранных белков, с которыми чрезвычайно трудно работать.

Невозможно делать обычные фотографии белков, поскольку они слишком малы, но с помощью технологии криоэлектронной микроскопии группе исследователей из исследовательской группы профессора Пола Ниссена из Орхусского университета удалось определить трехмерную структуру белка. Drs2 / Cdc50, сделав многие сотни тысяч «электронных фотографий» молекулы.Это первый раз, когда кто-либо определил структуру этого важного семейства белков, липидных флиппаз, и результаты только что были опубликованы в ведущем мировом журнале Nature .

Кульминация более 10 лет работы

С новой публикацией более 10 лет целенаправленной работы достигли высшей точки для ряда студентов и исследователей из исследовательской группы Пола Ниссена, которые также привлекли совместных партнеров из Университета Париж-Сакле и Института биофизики Макса Планка во Франкфурте.

«Замечательно быть частью заключительной части проекта, видеть, как результаты становятся на свои места, и внезапно иметь возможность объяснить наблюдения, которые были обнаружены несколько лет назад и которые теперь дают нам совершенно новое понимание», — говорит доктор философии. студентка Милена Тимченко, которая последние четыре года работала над определением структуры Drs2 / Cdc50 вместе с доцентом Джозефом Лайонсом.

Джозеф Лайонс добавляет: «Приятно наконец впервые увидеть эти мембранные белковые структуры.Теперь начинается самое интересное, чтобы собрать воедино большую картину того, как работают эти транспортные белки. Быть частью этого замечательного развития ».

Криоэлектронная микроскопия означает, что белки охлаждаются до -170 ° C в ультратонком слое, после чего они подвергаются «рентгеновскому облучению» мощным пучком электронов и формируют небольшие тени на чипе изображения.

«Это немного похоже на рентген в больнице, только с электронами вместо рентгеновских лучей и увеличенным почти в 150 000 раз», — говорит Милена Тимченко.«Желательно, чтобы белковые молекулы лежали совершенно неподвижно, чтобы получить четкое изображение, в то время как низкие температуры защищают белки от разрушения мощным электронным лучом, вызываемым напряжением 300 000 вольт. Вот почему мы охлаждаем их. Уловка состоит в том, чтобы заморозить образцы достаточно быстро, чтобы не образовывались кристаллы льда, и в достаточно тонком слое, чтобы белки не затеняли друг друга. Мы в Орхусе довольно хорошо в этом научились ».

Результаты привлекают огромное международное внимание

Объединив тысячи изображений, на которых белок наблюдается во всех возможных случайных направлениях, можно составить трехмерное изображение, которое позволяет построить модель молекулы белка, атом за атомом, с тысячами атомов.Модель вносит вклад в базовое понимание того, как работают липидные флиппазы, и, следовательно, может объяснить некоторые заболевания, возникающие в результате мутаций в этом семействе белков. Это означает, что в трехмерной структуре произошли небольшие изменения, и теперь исследователи могут описать эффект этих изменений.

Это первый раз, когда с помощью криоэлектронной микроскопии в Дании определяется совершенно новая структура мембранного белка, и результаты привлекают огромное международное внимание. Работа над большими наборами данных стала возможной благодаря большим усилиям по развитию исследовательской инфраструктуры в этой области, которая после нескольких лет работы теперь находится в Орхусе.

Профессор Пол Ниссен очень доволен этим развитием: «Благодаря этой исследовательской инфраструктуре и постоянно растущему опыту в области криоэлектронной микроскопии мы находимся в авангарде мирового соревнования за новые знания и возможности для понимания клеточной биологии, лекарств и биотехнологии в На молекулярном уровне. Это позволяет нам поддерживать и развивать конкурентоспособные позиции Дании в структурной биологии. Вскоре мы расширяем возможности микроскопии при поддержке инфраструктурной программы Министерства исследований и инноваций и, таким образом, можем открыть доступ для исследовательских групп во всех датских университетах. , промышленные и начинающие компании.Это важно для нашей способности открывать новые механизмы взаимодействия физики, химии, биологии и медицины, а также разрабатывать новые инновационные технологии ».

---

Обнаружена новая структура белка, которая помогает вирусам с липидными мембранами проникать в клетки

---

Дополнительная информация: Милена Тимченко и др., Структура и ауторегуляция липидной флиппазы Р4-АТФазы, Nature (2019).DOI: 10.1038 / s41586-019-1344-7 Предоставлено Орхусский университет

Ссылка : Криоэлектронная микроскопия выявляет структуры белка, поддерживающего клеточные мембраны (2019, 27 июня) получено 21 января 2021 г. с https: // физ.org / новости / 2019-06-крио-электронная-микроскопия-раскрывает-протеин-ячейка.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

МИКРОСКОПИЯ Учебное пособие 1.Типы микроскопии. Световая флуоресценция. Конфокальная электронно-просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) -сканирующая электронная микроскопия.

Презентация на тему: «Учебное пособие по МИКРОСКОПИИ 1. Типы микроскопии. Световая флуоресцентная конфокальная электронная — просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) — сканирующая электронная микроскопия». — Стенограмма презентации:

1 МИКРОСКОПИЯ Урок 1

2 Типы микроскопии Световая флуоресценция Конфокальная электронно-трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ) -сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

3 СВЕТЛАЯ МИКРОСКОПИЯ Преимущества — Живые клетки видны, цвет виден Недостатки — Предел разрешения равен 0.2 микрона Видимые органеллы — ядра, иногда митохондрии и аппарат Гольджи

4 Световая микроскопия, продолжение. Пример: эпидермальные клетки лука. Вы можете увидеть ядро.

5 Флуоресцентная микроскопия Флуоресцентные красители (например, флуорохромы) (используемые для окрашивания клеток) обнаруживаются с помощью флуоресцентного микроскопа. Окрашенные объекты отображаются ярким цветом на темном фоне. Преимущество — можно видеть живые клетки — можно выделить определенные структуры или молекулы.

6 Флуоресцентная микроскопия, продолжение.Пример: окрашивание DAPI, чтобы показать ДНК во время деления клеток. Вверху: (Интерфаза) Видно только ядро ​​Внизу: (Митоз) хромосомы выстроились в линию в центре клетки.

7 Преимущества просвечивающей электронной микроскопии — хорошее разрешение (от 200 нм до 0,2 нм; размер от органелл до макромолекул. пятно тяжелого металла) — Трудно построить трехмерную структуру из двухмерных срезов — ТЕМ нельзя использовать с живым материалом

8 ТЕА, продолжениеПример — гепатоциты печени крысы с грубым эндоплазматическим ретикулумом (RER) и митохондриями.